专利名称：用竟争酶联免疫吸附试验检测犬狂犬病毒总抗体试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，具体地是一种用竟争酶联免疫吸附试验(ELISA)检测犬狂犬病毒总抗体试剂盒及制备方法。
背景技术：
实验动物是生命科学的重要基础和必备的支撑条件之一。实验动物质量的优劣不仅直接关系到相关科研工作的成败，而且也是一个国家总体相关科研水平的重要标志。实验动物的质量保证除了依赖于饲养管理水平和硬件条件外，还依赖于标准化的检测系统，而检测系统的关键是科学、先进的检测方法和标准化的检测试剂。目前，我国实验动物检测标准与体系尚不完备、不统一、不规范、不标准，与国外发达国家相比也有很大差距，这对我国总体相关科学研究的发展是一大障碍。
随着经济的发展和人民生活水平的提高，宠物犬的数量在不但增加，犬的活动区域也在不断扩大，仅武汉市区就有十万只以上。从宠物医疗市场得到的信息，人们是迫切希望了解宠物接种狂犬疫苗后对犬是否具有保护力，而目前狂犬病毒抗体的检测工作因受检测条件和费用的限制，并没有得到广泛的应用。狂犬病毒(Rabies Virus)是狂犬病的病原体，而我国又是狂犬病的高发国家，居世界第二位(仅次于印度)，由于狂犬病是人畜共患性疾病，95％的狂犬病是与人类密切接触的犬传播的，其危害已经引起政府和人民的高度关注。犬不仅用于狩猎(猎犬)、侦破(警犬)、看门、食肉和作为宠物饲养，犬还是进行生命科学、医学、药学、化工、农业、军事、环保、航天及生物工程领域应用广泛的重要实验动物(实验犬)之一。随着我国在生命科学、医学、药学等研究领域发展速度加快，实验犬的使用量不断增大，质量要求不断提高，实验犬的生产基地在不断涌现，但实验犬的检测体系尚未建立，使得狂犬病的危害更加突出，保证犬(尤其是实验犬)的质量和工作人员的身体健康与生命安全成为十分突出的课题。特别是我国进入WTO后，我国生命科学的研究成果、医药、生物制品以及实验犬等将跨出国门走向世界，这些均需要实验犬的质量检测工作标准化作为支撑，以突破发达国家设立的技术壁垒，进入国际市场。
目前，国内外用ELISA方法检测人血清中抗狂犬病毒抗体，辅助临床上狂犬病的诊断和用于狂犬疫苗效果的评价方法已经成熟。但用于实验动物(包括犬、猴、鼠等)狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒尚未见实验动物狂犬病毒抗体检测方法的研究报道，也未见相应的试剂盒商售。因此建立科学、快速、先进的实验动物狂犬病毒抗体检测方法，按规范程序生产相应的标准化试剂盒是当务之急。
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗狂犬病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种抗狂犬病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒，其组成为已预包被狂犬病毒抗原的酶标板 8×12孔酶结合物(HRP-抗狂犬病毒N蛋白McAb) 5ml阳性血清 0.2ml阴性血清 0.2ml浓缩洗涤液10ml底物A(TMB)5ml
底物B(H2O2) 5ml终止液(2mol/L H2SO4)5ml其中，所述的酶结合物为辣根过氧化酶—抗狂犬病毒单克隆抗体酶结合物；浓缩涤液为含0.05％吐温-20的生理盐水；底物A为3.3′-5.5′-四甲基联苯胺溶液；底物B为双氧水溶液；终止液为用蒸馏水稀释后的1mol/LH2SO4硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水比例为1∶17。
制备上述检测试剂盒的方法为A辣根过氧化酶(HRP)-抗狂犬病毒单克隆抗体酶结合物的制备鼠抗狂犬病毒核蛋白(N蛋白)单克隆抗体(McAb)制备与辣根过氧化酶(HRP)标记将抗狂犬病毒N蛋白的腹水McAb(由武汉生物所细胞工程室提供)经1次50％、2次33％饱和硫酸铵沉淀提纯；用改良过的过碘酸氧化法标记HRP；酶标记物(代号HRP-抗N)中加入1％BSA和50％甘油，-20℃-30℃保存备用；B阳性血清的制备挑选体格健壮的6月龄比格犬2～3只，初次免疫用兽用五联苗，加强免疫用人用狂犬苗，待犬血清中抗狂犬病毒IgG抗体酶联免疫吸附试验效价达1∶500以上，即可采血分离血清；用A液将冻存的阳性血清稀释至O.D值＜0.1，即为所需阳性血清；C阴性血清的制备用A液将冻存的阴性血清作适当稀释至O.D＞0.5，即为所需阴性血清；D浓缩洗涤液的制备将氯化钠(NaCl)170g；吐温(Tween)-2010ml；蒸馏水1000ml配制成所需的生理盐水浓缩洗涤液；E底物A的制备将3.3′-5.5′-四甲基联苯胺270g、无水乙醇240ml、甘油6ml、双蒸水340ml配制成3.3′-5.5′-四甲基联苯胺溶液；F底物B的制备将Na2HPO4·12H2O的磷酸氢二钠18.41g、无水Na2HPO4的磷酸氢二钠7.33g、枸橼酸5.10g、双蒸水1000ml及原装33％的双氧水1.0ml配制成所需双氧水溶液；G终止液的制备所述终止液为用蒸馏水稀释后的硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水为1∶17；H预包被板的制备将狂犬病毒抗原用0.05mol/L，pH9.6的磷酸缓冲液即包被液稀释成5μg/ml包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜；倒掉包被液，每孔加含10％小牛血清的封闭液4℃过夜；倒掉封闭液，吹干，4℃保存备用；将上述制备好的酶结合物用A液稀释、与浓缩洗涤液、底物A、底物B、终止液、阳性血清、阴性血清按上述试剂盒中组成的定量分装，再与预包被板分装成检测试剂盒。
所述的狂犬病毒抗原是用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎、差速离心提取，-20℃保存，作为包被用狂犬病毒用抗原。
所述的包被液即0.05mol/L，pH9.6的磷酸缓冲液制备方法为将碳酸钠(Na2CO3)1.59g、碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g、叠氮钠(NaN3)0.20g、蒸馏水1000ml配制而成。
所述的封闭液制备方法为将氯化钠(NaCl)8.5g、小牛血清(BSA)10.0g、双蒸水500ml、甘油500ml配制而成，其中，先将氯化钠和小牛血清溶于双蒸水中，再加甘油。
所述A液制备方法为将对乙酰氨基酚(APAP)1.5g，聚乙二醇2万(P)10g，小牛血清(BSA)2g，吐温(Tween)-20 1ml，硫柳汞0.2g和0.02mol/L、pH7.2的盐酸缓冲盐水1000ml配制而成。
本发明试剂盒检测程序取待检血清样本、阳性对照血清和阴性对照血清各50μl加入孔中，再加酶结合物(HRP-抗N工作浓度1∶1000)50μl，置37℃反应60分钟；洗板5次，滴加底物A、B液各50μl，37℃反应15分钟，用酶标检测仪检测O.D450值。
结果判断Cutoff＝(阴性对照平均O.D450值+阳性对照平O.D450值)/2。样本O.D450≤Cutoff值判为阳性。
试剂盒质量标准的制定及检定特异性20份阴性血清、20份阳性血清，检测符合率不低于95％。
灵敏性抗体阳性血清50μl(即直接取样本血清50μl加到反应孔中)能检出。
精密性变异系数(C·V)≤15％。将同一份血清同步作10孔所得O.D450值，经统计学处理，计算C·V值。
稳定性将试剂盒置37℃不少于3天与4℃存放的试剂盒同步检测10样品，其O.D450值的总变化率≤25％。
试剂的现场试用用本发明试剂检测正常人群中抗狂犬病毒抗体从本院门诊部随机抽取健康体检人员血清93份，按检测程序进行抗体检测。
用本发明试剂检测狂苗免疫犬体内总抗体的动态变化对本研究中2只进行狂苗接种制备抗血清的试验犬在最后一次加强免疫后第2、9、16天抽血及免疫前的血清样本上述的检测程序进行总抗体检测。
检测结果表明1.试剂的质量检定1.1 特异性检测血清中抗狂犬病毒总抗体试剂对20份阴性、10份阳性质控血清，符合率均为100％(结果见表1)表1本发明试剂特异性检定结果


1.2 灵敏度本发明试剂的灵敏度检定所用质控血清是用狂犬疫苗免疫实验犬制备的犬抗狂犬病毒阳性血清。检定结果(表2)表明检测灵敏度为1∶32。
表2试剂灵敏度检定结果(Cutoff＝0.352)血清稀空1∶24 8 163264128256S+S-S-释度白0.150.11 0.15 0.27 0.28 0.51 0.52 0.54 0.09 0.58 0.64 0.00O.D4508 4 6 4 1 9 5 2 9 7201.3 精密性试剂用阴性血清同步作10孔，O.D450的变异系数(C·V)为5.10％(表3)。
表3本发明试剂精密性检定结果变异系数孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10(C·V)O.D4500.573 0.587 0.580 0.581 0.587 0.534 0.559 0.525 0.533 0.5145.10％4 稳定性将试剂盒置37℃温箱存放4天、7天，与4℃存放的试剂盒同步测阴性血清，其变化率≤±20％。
现场试用用本发明试剂检测健康人群抗狂犬病毒抗体从从业人员健康体检的血清中随机抽取93份，用竞争ELISA试剂检测抗狂犬病毒抗体，结果(表4)90份为阴性，3份为阳性。
表4 用竞争ELISA试剂盒检测健康人群抗狂犬病毒抗体0.667 0.583 0.790 0.680 0.412 0.825 0.580 0.797 0.828 0.608 0.635 0.5000.577 0.567 0.584 0.611 0.630 0.701 0.586 0.693 0.785 0.035 0.652 0.6840.533 0.663 0.596 0.753 0.633 0.553 0.618 0.790 0.739 0.455 0.593 0.5850.506 0.612 0.573 0.601 0.724 0.499 0.613 0.714 0.622 0.667 0.736 0.5080.669 0.594 0.611 0.687 0.837 0.619 0.715 0.649 0.942 0.699 0.667 0.6670.562 0.294 0.693 0.775 0.620 0.679 0.707 0.779 0.851 0.183 0.717 0.5560.681 0.757 0.721 0.559 0.820 0.672 0.846 0.842 0.767 0.793 0.797 0.577S-S+空白0.560 0.853 0.473 0.748 0.656 0.538 0.777 0.798 0.7880.612 0.057 0.000Cutoff＝(0.612+0.057)/2＝0.334
实验犬接种狂苗后抗体产生情况的动态监测两只实验犬免疫前抗狂犬病毒抗体均为阴性，接种狂犬疫苗后，从最后一次加强免疫后的第2、9、16天采集血清检测抗体，结果表明总抗体及IgG抗体呈明显上升趋势(见表5)。
表5检测免疫犬抗狂犬病毒总抗体的动态变化

经对试生产的试剂盒进行质量检定的结果来看，试剂盒的特异性达到100％；灵敏度为1∶32稀释后50μl能检出(内控指标为原血清50μl能检出)；精密性(变异系数C·V)为5.10％(内控指标为不大于15％)；本试剂盒采用竞争ELISA检测血清中抗狂犬病毒总抗体，可用于所有实验动物、宠物、普通动物以及人群感染狂犬病毒的情况调查和接种狂犬疫苗的效果评价。


图1 为本发明工艺流程图
具体实施例方式一、实施例1 犬抗狂犬病毒免疫血清的制备挑选体格健壮的6月龄比格犬2～3只，初次免疫用兽用五联苗(狂犬病、犬传染性肝炎、犬副流感、犬瘟热、犬细小病毒)，加强免疫用人用狂犬疫苗(均按疫苗使用说明书操作)，待犬血清中抗狂犬病毒IgG抗体ELISA效价达1∶500以上，即可采血分离血清。为得到充分的来源一致的阳性血清，免疫犬不要一次采血致死，可多次采血。若抗体滴度下降，可再加强免疫。
2 HRP-抗狂犬病毒单克隆抗体的制备2.1 单克隆抗体的纯化2.1.1 将冻存的鼠抗狂犬病毒N蛋白McAb腹水从低温冰箱中取出，置37℃水浴中迅速化过滤除去脂类及不溶性残渣。
2.1.2 取滤过的腹水xml，加xml的PBS(0.01mol/L pH7.4)稀释，滴入饱和硫酸铵溶液2xml(终浓度为50％饱和硫酸铵)，4℃放置30分钟，3000rpm离心30分钟，去上清。
2.1.3 将沉淀用2xml PBS溶解，滴加xml饱和硫酸铵溶液，4℃放置30分钟，5000rpm离心30分钟，去上清。重复1次此操作。
2.1.4 将沉淀用适量PBS溶解，装入透析袋，对PBS透析48小时，期间换液5～6次。即得到纯化的鼠抗狂犬病毒N蛋白IgG型单克隆抗体。
2.2 辣根过氧化物酶(HRP)标记2.2.1 准确称取HRP(RZ≥3.0，Sigma公司产品)xmg，溶于0.2xml的双蒸水中，电磁搅拌下，滴加新配制的0.1mol/L高碘酸钠(NaIO4)溶液0.04xml，室温(25℃)搅拌20分钟。溶液由棕红色转为墨绿色(醛化的HRP)。
2.2.2 将醛化的HRP装入透析袋内，对1mmol/L醋酸缓冲液(pH4.4)透析过夜。溶液由墨绿色转为棕红色。
2.2.3 用0.2mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)将醛化的HRP溶液pH调至9.0～9.5(每ml醛化HRP约加碳缓0.2ml)，立即加入纯化的鼠抗狂犬病毒N蛋白单克隆抗体(在加入前也应用碳缓调pH至9.0～9.5)。
2.2.4 加入新配制的硼氢化钠溶液(4mg/ml)0.02xml，4℃放置2小时。
2.2.5 搅拌下滴加等量饱和硫酸钠溶液，4℃放置30分钟，有絮状沉淀出现。5000rpm离心30分钟，去上清。上清应无色，沉淀为棕红色。
2.2.6 将沉淀用适量PBS溶解，装入透析袋，对PBS透析48小时，其间换液5～6次。即为HRP-抗N(酶结合物)。
在标记并检定合格的酶结合物中加入1％牛血清白蛋白(BSA)，使其充分溶解后，再加入等体积的中性甘油，-20℃保存备用。
3 狂犬病毒抗原的制备3.1 毒种狂犬病毒CTN株(武汉生物所疫苗生产毒株)3.2 细胞Vero细胞3.3 将复苏活化的狂犬病毒悬液按1∶10(100ml培养瓶接种1ml病毒悬液)接种到已长成单层的Vero细胞上，37℃培养5～6天(细胞不出现明显病变，但细胞内颗粒增多，纹理紊乱)，收取培养液上清(病毒悬液)。
3.4 在收集的病毒悬液中，加入终浓度为1/3000的甲醛灭活病毒。
3.5 将灭活的病毒悬液5000rpm离心1小时，去沉淀。
3.6 将含病毒的上清40,000rpm离心1小时，去上清。沉淀用适量PBS悬浮测定蛋白含量(同1.1.3①)，加50％的中性甘油，-20℃保存，作为包被用狂犬病毒抗原。
3.7 狂犬病毒抗原检定①病毒活性检测将狂犬病毒抗原用维持液作适当稀释(不小于1∶10)接种到已成片的Vero细胞上，同时作正常细胞对照。37℃培养6天接种细胞与正常细胞相同，无病理改变；取培养液上清(包括正常细胞培养液上清)包被酶标板，用阳性血清进行检测，病毒培养液和正常细胞培养液显色情况一致，均为无色，表明作为包被抗原用的狂犬病毒已灭活彻底，不具感染性。
②工作浓度测定将狂犬病毒抗原用包被液从1∶100开始作倍比稀释到第12管(1∶204800)，每个稀释度取100μl加到12孔板条的相应孔中，共包被3条(包被程序见5.1)第1条加同1份阳性血清、第2条加阴性血清、第3条加临界值血清每孔100μl，37℃温育30分钟，洗板5次，加酶结合物(每孔100μl)，37℃温育30分钟，洗板5次，加底物A、B各50μl，37℃显色15分钟，加终止液50μl，用酶标检测仪测各孔O.D450值。阳性血清O.D＞0.500、阴性血清O.D＜0.100、临界值血清O.D/阴性血清O.D≥2.1的抗原最高稀释度倍数为此批抗原的工作浓度4 试剂盒组件的制备4.1 预包被板的制作4.1.1 将狂犬病毒抗原用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)稀释到工作浓度，每孔100μl，4℃过夜(不少于18小时)。
4.1.2 倒掉包被液，用1％BSA的封闭液封闭，每孔150μl，4℃过夜(不少于18小时)。
4.1.3 倒掉封闭液，拍干。室温电风吹干。装入封口袋，放干燥剂一袋，封口，4℃保存。
4.1.4 预包被板的检定①外观孔底均匀透明，无水气、污点、尘粒。
②均质性检测随机抽取1根预包被板条，同一份阳性血清(间接法)或和同一份阴性血清(竞争法)同时检测两端和中间共3孔O.D值的变异系数小于10％。
5.2 试剂盒中各种试液的配制与分装按下表进行。
试剂盒中试液的配制分装表


注1.A液配方对乙酰氨基酚1.5g，聚乙二醇2万10g，小牛血清2g，吐温-20 1ml，硫柳汞0.2g和(0.02mol/L、pH7.2)的盐酸缓冲盐水1000ml。
其中，生产过程中所用试剂的配制如下1. 生理盐水(0.85％NaCl)NaCl170g 85g 8.5g 0.85g蒸馏水 20000ml 10000ml 1000ml 100ml2. 饱和硫酸铵溶液(NH4)2SO4156g蒸馏水 200ml加热溶解，趁热过滤，用28％氨水调至pH7.0，室温保存。
3. 磷酸缓冲盐水(PBS，0.01mol/L pH7.4)0.2mol/L Na2HPO481ml0.2mol/L NaH2PO419mlNaCl 17g蒸馏水 定溶至 2000ml4. 1mmol/L醋酸盐缓冲液(pH4.4)
0.2mol/L NaAc1.85ml0.2mol/L HAc 3.15ml双蒸水 定溶至 1000ml5.0.2mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)0.2mol/L Na2CO33ml0.2mol/L NaHCO37ml1. 包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液CB pH9.6)Na2CO31.59gNaHCO32.93gNaN30.20g蒸馏水1000ml2. 封闭液NaCl 8.5gBSA 10.0g双蒸水 500ml甘油 500ml先将NaCl和BSA溶于双蒸水中，再加甘油。
权利要求
1.一种用竟争酶联免疫吸附试验检测犬狂犬病毒总抗体试剂盒，其特征在于所述试剂盒的组成为已预包被狂犬病毒抗原的酶标板 8×12孔酶结合物 5ml阳性血清 0.2ml阴性血清 0.2ml浓缩洗涤液 10ml底物A 5ml底物B 5ml终止液 5ml其中，所述的酶结合物为辣根过氧化酶-抗狂犬病毒单克隆抗体酶结合物；浓缩涤液为含0.05％吐温-20的生理盐水；底物A为3.3′-5.5′-四甲基联苯胺溶液；底物B为双氧水溶液；终止液为用蒸馏水稀释后的1mol/LH2SO4硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水比例为1∶17。
2.一种制备如权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于所述的方法包括A辣根过氧化酶-抗狂犬病毒单克隆抗体酶结合物的制备鼠抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体制备与辣根过氧化酶标记将抗狂犬病毒核蛋白的腹水经1次50％、2次33％饱和硫酸铵沉淀提纯；用改良过的过碘酸氧化法标记辣根过氧化酶；酶标记物中加入1％小牛血清和50％甘油，-20℃-30℃保存备用；B阳性血清的制备挑选体格健壮的6月龄比格犬2～3只，初次免疫用兽用五联苗，加强免疫用人用狂犬苗，待犬血清中抗狂犬病毒IgG抗体酶联免疫吸附试验效价达1∶500以上，即可采血分离血清；用A液将冻存的阳性血清稀释至O.D值＜0.1，即为所需阳性血清；C阴性血清的制备用A液将冻存的阴性血清作适当稀释至O.D＞0.5，即为所需阴性血清；D浓缩洗涤液的制备将氯化钠170g；吐温-2010ml；蒸馏水1000ml配制成所需的生理盐水浓缩洗涤液；E底物A的制备将3.3′-5.5′-四甲基联苯胺270g、无水乙醇240ml、甘油6ml、双蒸水340ml配制成3.3′-5.5′-四甲基联苯胺溶液；F底物B的制备将Na2HPO4·12H2O的磷酸氢二钠18.41g、无水Na2HPO4的磷酸氢二钠7.33g、枸橼酸5.10g、双蒸水1000ml及原装33％的双氧水1.0ml配制成所需双氧水溶液；G终止液的制备所述终止液为用蒸馏水稀释后的硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水为1∶17；H预包被板的制备将狂犬病毒抗原用0.05mol/L，pH9.6的磷酸缓冲液即包被液稀释成5μg/ml，包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜；倒掉包被液，每孔加含10％小牛血清的封闭液4℃过夜；倒掉封闭液，吹干，4℃保存备用；将上述制备好的酶结合物用A液稀释，与浓缩洗涤液、底物A、底物B、终止液、阳性血清、阴性血清按权利要求1所述的定量分装，再与预包被板分装成检测试剂盒。
3.如权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于所述的狂犬病毒抗原是用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎、差速离心提取，-20℃保存，作为包被用狂犬病毒用抗原。
4.如权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于所述的包被液即0.05mol/L，pH9.6的磷酸缓冲液制备方法为将碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g、叠氮钠0.20g、蒸馏水1000ml配制而成。
5.如权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于所述的封闭液制备方法为将氯化钠8.5g、小牛血清10.0g、双蒸水500ml、甘油500ml配制而成，其中，先将氯化钠和小牛血清溶于双蒸水中，再加甘油。
6.如权利要求2所这的试剂盒的制备方法，其特征在于所述A液制备方法为将对乙酰氨基酚1.5g，聚乙二醇2万10g，小牛血清2g，吐温-20 1ml，硫柳汞0.2g和0.02mol/L、pH7.2的盐酸缓冲盐水1000ml配制而成。
全文摘要
本发明涉及一种检测试剂盒，具体地是一种用竟争酶联免疫吸附试验(ELISA)检测犬狂犬病毒总抗体试剂盒及制备方法。试剂盒组成为已预包被狂犬病毒抗原的酶标板，酶结合物(HRP－抗狂犬病毒N)，阳性血清，阴性血清，浓缩洗涤液，底物，终止液。经对试生产的试剂盒进行质量检定的结果来看，试剂盒的特异性达到100％；灵敏度为1∶32稀释后50μl能检出(内控指标为原血清50μl能检出)；精密性(变异系数C·V)为5.10％(内控指标为不大于15％)；本试剂盒采用竞争ELISA检测血清中抗狂犬病毒总抗体，可用于所有实验动物、宠物、普通动物以及人群感染狂犬病毒的情况调查和接种狂犬疫苗的效果评价。
文档编号G01N33/569GK1547028SQ200310111498
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月2日 优先权日2003年12月2日
发明者徐国景, 张瑜, 唐利军, 肖红雨, 张金明, 孙凡中, 易平, 杨文祥, 林乔, 龚镇奎 申请人:湖北省预防医学科学院