专利名称：含有以HpαR为有效成份的肺癌诊断用标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有以Hp a R为有效成份的肺癌诊断用标记及利用该标记对肺癌进行诊断的方法。
背景技术：
随着吸烟人口的增加和大气污染等原因，在我们国家肺癌也是一种急剧增加的肿瘤疾病。据统计局最近调查，其发生频率在男性中排在胃癌之后居第2位，在女性中排在子宫癌、胃癌、肝癌、大肠癌之后居第5位，其死亡率无论男女均居癌症死亡率的第I位。
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从当前的吸烟状况看，这种肺癌的发生频率及因肺癌导致死亡率的增加在今后相当长的一段时间内仍将持续。肺癌通常因癌细胞的生长而侵犯周边组织或者导致气道阻塞、淋巴结转移等症状，但是，也有10-15%左右的患者无任何症状，通过定期体检才能诊断出。另外，大部分肺癌发现时都已经发展到了第III (3)期以上，一般都很难治愈。因此，对肺癌进行早期诊断以降低因肺癌导致的死亡率是一个紧迫的问题。为了对肺癌进行诊断，一般都综合运用多种方法，到目前为止，大都通过检查肿瘤的大小、淋巴结是否转移等或者对肺肿瘤组织或淋巴结等做活检并通过免疫组织化学方法进行分析或者通过利用胸部X-线摄影、胸部计算机断层扫描、纤维支气管镜等进行诊断。但是，如果采用胸部计算机断层扫描，肺癌的大小必须达到约O. Icm以上才能够进行测定，在这一时期，癌症很可能已经转移到了其它的组织。利用纤维支气管镜的方法虽然可以将内镜插入支气管直接对肺内部进行观察，但是，其观察范围在空间上具有一定的局限性，很难对肺末端的肿瘤进行观察。为了克服上述现有诊断方法的缺点，研究人员一直试图通过测定患者血液中全血细胞计数(Complete blood count, CBC)、血清电解质(含I丐)、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase)、白蛋白(Albumin)、天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST) >丙氨酸转氨酶(Alanine transaminase, ALT)、总胆红素(Total bilirubin)或者肌酐(Creatinine)的浓度从而对肺癌进行诊断。但是，虽然一直在对这种肿瘤标记(marker)作为诊断因素或预后因素的价值进行研究，到目前为止也仅限于有限使用，仍然没有建议正式使用的肺癌标记。另外，结合珠蛋白(Haptoglobin, Hp)作为一种与IgG、白蛋白等一起大量存在于血液中的血清蛋白，主要在肝、皮肤、肺及肾脏细胞中合成，并分泌到血液中。通过由2个a chain和2个β chain形成二硫键(disulfide bond)连接的四聚体蛋白(tetramericprotein)形式存在，与红细胞中游离的血红蛋白结合，最终在血液中产生抗氧化功能(ffassell J. (2002)Haptoglobin:function and polymorphism. Clin Lab. 46, 547-552/Langlois M. R. & Delanghe J. R. (1996)Biological and clinical significance ofhaptoglobin polymorphism in humans. Clinical Chemistry 42, 15891600)。据最近的蛋白质组学研究报告表明，皮下及腹部脂肪细胞内也能够产生并分泌非常少量的结合珠蛋白。虽然能够在成人的肝内合成，但是却不能够在胎儿的肝内合成。结合珠蛋白是在生物体内与感染或炎症反应而使血中浓度急剧增加的急性时相蛋白(acute phaseprotein, APP)中的一种。Hp有 2个等位型(Hpl，Hp2)及 3种基因型(Hpl-l，Hp2-l，Hp2-2) (Maeda N, McEvoySM, Harris HF, Huisman TH, Smithies O. (1986)Polymorphisms in the human haptoglobingene cluster: chromosomes with multiple haptoglobin-related (Hpr) genes.Proc NatlAcad Sci U S A. 83, 73957399/Patzelt D, Geserick G, Schroder H. (1988)The genetichaptoglobin polymorphism:relevance of paternity assessment. Electrophoresis9, 393397), Hp α链(Hp a )上存在a I及a 2，上述a蛋白质以多种位点变体(positionvariant)的形式存在(Sadrzadeh SM, Bozorgmehr J. (2004)Haptoglobin phenotypes inhealth and disorders. Am J Clin Pathol. 121 Suppl:S97-104)。与上述蛋白质的基因相关的疾病包括糖尿病肾病(diabetic nephropathy)、克罗恩病(Crohn’ s disease)等，由急性时相蛋白感染(infection)、过度紧张(extreme·stress)、烧伤(burns)、严重的挤压伤(major crush injury)、过敏(allergy)等原因而导致其血液浓度增加，最近有报告显示，Hp的血液浓度在卵巢癌等多数癌症中均增加。但是，到目前为止，有关结合珠蛋白作为肺癌诊断用标记作用的研究仍然很少。因此，现在迫切需要一种能够对肺癌的诊断或者预后进行早期预测的肺癌诊断用标记。

发明内容
技术问题
本发明人在研究一种能够对肺癌的诊断或者预后进行早期预测的肺癌诊断用标记时发现Hpa R的浓度在肺癌患者血液中都非常高，从而完成本发明。技术方案
本发明提供一种含有以Hp a R为有效成份的肺癌诊断用标记。另外，本发明提供一种含有与Hp a R特异结合抗体的肺癌诊断试剂盒。另外，本发明提供一种包含通过血液测定Hp a R步骤的肺癌诊断方法。在本发明的一个实施例中上述血液采用血清。技术效果
本发明的肺癌诊断用标记及利用其抗体的肺癌诊断试剂盒用比较容易采集的血液作为检体，因此与以活检为对象的现有肺癌诊断方法不同，不仅不会给患者任何负担，能够非常简便地对肺癌进行诊断，而且诊断的敏感度及筛选度高，从而非常有助于肺癌的早期诊断。


图I是利用ELISA方法分别对含有C-末端精氨酸的肽抗原(RP)及除去精氨酸后C-末端氨基酸由谷氨酰胺构成的肽抗原(QP)的VR及VQ抗体的敏感度及筛选度进行测定的不意 图2是利用ELISA方法随RP及QP肽的浓度变化而分别对其VR抗体、VQ抗体、单克隆抗体(MHa及ΜΗβ)及多克隆抗体(Pa)的反应性进行测定的示意图；图3是分别对RP及QP肽的VR抗体、VQ抗体及单克隆抗体(ΜΗ α及MH β )的反应性通过免疫印迹法进行测定的示意 图4是利用ELISA方法对男性正常群及男性肺癌群血清中的Hp a R浓度进行测定的示意 图5是利用ELISA方法对肺炎患者血液中Hp a R、HpHp a Q、Hp α及Hp β浓度进行测定的不意 图6是利用VR及VQ抗体混合物通过ELISA方法对正常群与肺癌患者群血液中相关抗原蛋白质量进行测定及其ROC曲线分析结果的示意图。
具体实施例方式下面，将对本发明中使用的术语进行说明。 术语“ΗρΗρ a 2R”是结合珠蛋白 α 2 链变体(Hp alpha2 chain variant)的一种，是指通过其C-末端(C-terminal)的精氨酸(Arg，R)在2D胶上其位置发生变化的位点变体。术语“Hpa R”是对结合珠蛋白a I (Hp alphal)及结合珠蛋白α 2 (Hp alpha2)中C-末端带有精氨酸的位点变体的总称。术语“HpHpaQ”是对结合珠蛋白a I (Hp alphal)及结合珠蛋白α 2 (Hp alpha2)中除去C-末端精氨酸的位点变体的总称。术语“VR抗体”是为了确保只能够检测出含有结合珠蛋白a (Hp alpha)的变体蛋白质中对肺癌特别敏感的蛋白质即Hp a R的C-末端精氨酸的部位而制作的抗体。术语“VQ抗体”为了确保只能够检测出含有HpHp α Q的C-末端谷氨酰胺(Gln，Q)的部位而制作的抗体。下面，将对本发明进行详细说明。本发明将正常群与肺癌群的血清蛋白通过2D电泳展开，发现了在肺癌患者群中增加的蛋白质点(spot)，对其蛋白质进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDIT0F)质量分析，结果表明，肺癌标记候选蛋白质是结合珠蛋白α链变体的一种，通过其C-末端的精氨酸在2D胶(Gel)上其位置发生变化的变体。在本发明中，上述Hpa R以与肺癌相关的2D电泳实验结果为基础，制造出与之特异结合的抗体，再以肺癌患者的血液样品为对象通过免疫化学法分析，并获得有价值的结果，确认上述Hp a R可以作为肺癌诊断标记使用。由此，本发明提供含有以Hp a R为有效成份的肺癌诊断用标记。依据本发明的实施例，通过ELISA方法对正常群与肺癌患者群血液中本发明的HpaR浓度进行观察，结果表明，随着肺癌的发展血液中Hp a R的浓度增加，但是，Hp a Q在II期之前一直增加，而从III/IV期开始减少，Hp α及Ηρβ血液中蛋白质浓度在肺癌发生时增加，此后随着肺癌的发展就显著减少。因此，唯有Hp a R蛋白质随着肺癌周期而增加，所以，Hp a R可以作为能够跟踪肺癌发展的标记。如上所述，本发明的Hp a R在肺癌患者的血液中的浓度显著升高，从而可以对肺癌的诊断或预后进行早期预测，并可以作为肺癌诊断用标记使用。另外，本发明提供一种含有与Hp a R特异结合抗体的肺癌诊断试剂盒。
本发明的诊断试剂盒不仅包含与Ηρα R特异结合的抗体，而且还包含通常在相关领域用于免疫学分析的工具、试剂等，并且利用上述标记通过在该领域通常使用的制造方法就能够很容易地制造出来。依据本发明的一个实施例，上述肺癌诊断试剂盒包括与Ηρα R特异结合的抗体；接合有通过与基质的反应着色标记体的2次抗体共轭物(conjugate);与上述标记体发生着色反应的发色基质溶液；洗涤液；以及酶反应停止液。依据本发明的肺癌诊断试剂盒可以通过抗原-抗体结合反应对抗体蛋白质的抗原进行定量或者定性分析从而对肺癌进行诊断，上述抗原-抗体结合反应可以通过普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定(radioimmunoassay, RIA)、夹心法(sandwichassay)、免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组化染色(immunohistochemical staining)、免疫荧光法、酶基质着色法、抗原-抗体混凝法等方法进行测定。例如为了确保能够利用表面涂布有检体及对照群的96孔微量滴定板等实施与重组单克隆抗体蛋白质反应的ELISA以提供上述诊断试剂盒。 作为进行抗原-抗体结合反应的固定体可以使用硝酸纤维素膜、PVDF膜、由聚乙烯(polyvinyl)树脂或聚苯乙烯(polystyrene)树脂合成的孔板(Well plate)、由玻璃制成的载玻片、蛋白质结合用树脂(Resin)等。优选地，上述2次抗体共轭物的标记体采用发生着色反应的普通着色齐U，可以使用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、胶体金(colloid gold)、聚-L-赖氨酸-异硫氰酸突光素(poly L-lysine-f luoresceinisothiocyanate, FITC)、罗丹明-B-异硫氰酸酯(rhodamine-B-isothiocyanate,RITC)等突光素(fluorescein)及色素(dye)等的标记体。优选地，诱导着色的上述发色基质根据发生着色反应的标记体确定，可以使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(3，3，，5，5，-tetramethyl bezidine，TMB), 2,2’-连氮双(3-乙基并噻 _6_ 横酸[2，2，-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6_sulfonicacid),ABTS],邻苯二胺(ophenylenediamine,0PD)等。在这种情况下，发色基质更优先为以溶解于缓冲溶液(0. IM NaAc, pH5. 5)中的形式提供。优选地，洗涤液包括磷酸盐缓冲溶液、NaCl及吐温20 (Tween 20)，更优先地采用由0. 02M磷酸盐缓冲溶液、0. 13M NaCl及0. 05%吐温20构成的缓冲溶液(PBST)。洗涤液在完成抗原-抗体结合反应后使抗原-抗体结合体与2次抗体发生反应，然后取适当量加入到固定体中并洗涤3至6次。优选地，反应停止液使用硫酸溶液(H2SO4)。另外，本发明提供一种包含通过血液测定Hp a R步骤的肺癌诊断方法。即，通过利用血液中与肺癌诊断用标记即Hp a R特异结合抗体的抗原-抗体结合反应以对肺癌进行诊断或者预测。优选地，上述血液采用血清。下面，为了有助于对本发明的理解，列举优选的实施例。但是，下述实施例仅为了更加容易地理解本发明，它并不限定本发明的内容。[实施例]
实施例I.研究对象
用于本研究的正常人(normal control)及癌症患者的血清(serum)通过白种人(White caucasian)获取。为了确保所有的血清都适合生物标记(Biomarker)的研究,均根据美国食品和药物管理局(the Food and Drug Administration,FDA)及美国国家癌症研究所(National Cancer Institute, NCI)指南进行收集及处理，从事先获得IRB及HIPAA批准而收集的血液中获取。所有的血清及其临床信息均由Bioserve公司(美国)提供，与之相关的概要信息如表I所示。[表 I]
权利要求
1.一种肺癌诊断用标记，其特征在于所述标记含有以Hp a R为有效成份。
2.一种肺癌诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有与Hp a R特异结合的抗体。
3.一种肺癌诊断方法，其特征在于所述方法包括通过血液测定Hp a R的步骤。
4.如权利要求3所述的肺癌诊断方法，其特征在于所述血液为血清。
全文摘要
本发明涉及一种含有以HpαR为有效成份的肺癌诊断用标记。本发明的肺癌诊断用标记及利用其抗体的肺癌诊断试剂盒使用比较容易采集的血液作为检体，因此与以活检为对象的现有的肺癌诊断方法不同，不仅不会给患者任何负担，能够非常简便地对肺癌进行诊断，而且诊断的敏感度及筛选度高，从而非常有助于肺癌的早期诊断。
文档编号G01N33/574GK102959398SQ201180005762
公开日2013年3月6日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者金一韩 申请人:培材大学校产学协力团