专利名称：利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法
技术领域：
本发明涉及水环境污染物生物毒性检测技术领域，尤其是一种利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法。
背景技术：
莠去津(atrazine，阿特拉津)是一种化学除草剂，化学名称为2_氯_4_乙氨基-6-异丙氨基-1，3，5-三嗪，1952年由Geigy化学公司开发，1958年申请瑞士专利，1958年申请了瑞士专利，1959年正式投入生产。由于成本低、除草效果好而很快得到广泛应用。莠去津是选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，适用于玉米、高粱、果园和林地等，可防除I年生禾本科杂草和阔叶杂草，对某些多年生杂草也有一定的抑制作用。但莠去津极性大，易溶解于水，很容易进入地下水层，对地下水资源具有潜在的威胁。一些欧共体国家已经禁止其使用，而在使用量最大的美国，EPA也已经将其列入控制使用类农药。近年来又发现莠去津有内分泌干扰作用，目前已认定属于内分泌干扰剂物质。我国生产和使用莠去津的历史较短，但已有较大的污染事故发生，应引起足够的重视。莠去津在土壤中不易降解，土壤中残留的莠去津还具有淋溶性，易被雨水、灌溉水淋溶至较深土层，或是随地表径流进入河流、湖泊，对地下水和地表水造成污染。莠去津造成的水污染情况日益严重，对莠去津的检测手段主要集中在HPLC高效液相色谱法和气相色谱法，但这两种方法只能测定莠去津的含量，用浓度表示出来，不能直观反映其在生物体上的毒性表现。现在生物监测方法发展较快，因为其能直接反映污染物对生物体生理特征的影响变化，直接反应污染物的毒性。目前发光细菌法是比较成熟的生物毒性检测方法，莠去津对发光细菌的毒性作用通过发光细菌的发光强度的变化来反映，从而确定莠去津毒性，但是发光细菌法也存在发光细菌不稳定和方法成本高等问题。藻类由于生长周期短，对毒物敏感，也被广泛用于该方面的研究。铜绿微囊藻属蓝藻，在水环境中非常常见，在实验室易培养，生长周期短。研究表明利用铜绿微囊藻叶绿素荧光检测莠去津生物毒性可行，建立该新方法可快速测定莠去津的生物毒性。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法，能够简便、快速的测定莠去津的生物毒性，成本低廉，绿色环保。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法，其步骤包括:A、铜绿微囊藻的培养:将铜绿微囊藻培养至对数期，备用；B、铜绿微囊藻藻液的制备:用灭菌的蒸馏水对生长至对数期的铜绿微囊藻进行稀释，使其在680nm处的OD值为0.3-0.5，用于进行莠去津生物毒性测定；C、铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津生物毒性的响应时间的确定:取一定浓度的莠去津溶液ImL加入到铜绿微囊藻制备液中，定容至IOOmL,震荡使其充分混合,每3min取一次藻液至IOmm光程的荧光比色皿中，放入荧光光谱仪中测定铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度，绘制铜绿微囊藻叶绿素荧光强度随时间变化的关系曲线，确定铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津生物毒性的最佳响应时间；D、利用铜绿微囊藻叶绿素荧光测定莠去津生物毒性的标准曲线的绘制:取系列浓度的莠去津标准液加入铜绿微囊藻制备液中，充分混合至步骤C确定的“最佳响应时间”后，用荧光光谱仪测定铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度；每一浓度设置三个平行样，用灭菌的蒸馏水替代样品设置一组空白样；按公式I计算光合抑制率，
权利要求
1.利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法，其特征步骤包括: A、铜绿微囊藻的培养:将铜绿微囊藻培养至对数期，备用； B、铜绿微囊藻藻液的制备:用灭菌的蒸馏水对生长至对数期的铜绿微囊藻进行稀释，使其在680nm处的OD值为0.3-0.5，用于进行莠去津生物毒性测定； C、铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津生物毒性的响应时间的确定:取一定浓度的莠去津溶液ImL加入到铜绿微囊藻制备液中，定容至IOOmL,震荡使其充分混合，每3min取一次藻液至IOmm光程的荧光比色皿中，放入荧光光谱仪中测定铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度，绘制铜绿微囊藻叶绿素荧光强度随时间变化的关系曲线，确定铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津生物毒性的最佳响应时间； D、利用铜绿微囊藻叶绿素荧光测定莠去津生物毒性的标准曲线的绘制: 取系列浓度的莠去津标准液加入铜绿微囊藻制备液中，充分混合至步骤C确定的“最佳响应时间”后，用荧光光谱仪测定铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度；每一浓度设置三个平行样，用灭菌的蒸馏水替代样品设置一组空白样；按公式I计算光合抑制率，
2.根据权利要求1所述的利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步骤A中，采用BG-1l培养基进行铜绿微囊藻的培养，按比例配制培养基，然后将培养基放入灭菌锅于121°C下灭菌30min ;取出后放入超净台冷却，于无菌条件下进行藻种接种；接种完成后置于恒温光照培养箱中培养；培养条件是:光照度为2000-25001ux,温度为25±1°C，湿度为75%RH，光暗周期为12h:12h，静置培养；每日摇瓶2_3次，每次随机调换三角瓶的位置，以免引起光照不均；将生长至对数期的藻按比例转接到灭菌培养基中，如此反复转接3次以上；然后对该藻进行扩大培养，生长至对数期，备用。
3.根据权利要求1所述的利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步骤B中，用经过高压灭菌的蒸馏水稀释生长至对数期的铜绿微囊藻，使其在680nm处的OD值为0.4，该稀释后的藻液用于莠去津生物毒性的测定。
4.根据权利要求1所述的利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步骤B中使用722型可见分光光度计测定铜绿微囊藻的光密度OD值来确定藻液的浓度。
5.根据权利要求1所述的利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步骤C中确定铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津生物毒性的最佳响应时间为15min。
6.根据权利要求1所述的利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步骤C、D中荧光光谱仪的工作参数为:狭缝为5nm，扫描速度2400nm/min，激发波长Ex=435nm,发射波长Em=680nm,步长5nm,电压700V, Icm的标准四通石英比色皿。
7.根据权利要求1所述的利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法，其特征在于:步骤D中系列浓度的莠去津标准液的浓度依次为:0.002,0.008,0.016,0.032,0.048、.0.064mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种利用铜绿微囊藻测定莠去津生物毒性的方法，其步骤包括A、铜绿微囊藻的培养；B、铜绿微囊藻藻液的制备；C、铜绿微囊藻叶绿素荧光对莠去津生物毒性的响应时间的确定；D、利用铜绿微囊藻叶绿素荧光测定莠去津生物毒性的标准曲线的绘制取系列浓度莠去津标准液加入到铜绿微囊藻制备液中，充分混合至步骤C确定的“最佳响应时间”后，用荧光光谱仪测定铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度；每一浓度设置三个平行样，用灭菌的蒸馏水替代样品设置空白样，计算光合抑制率，最后绘制“莠去津浓度与光合作用抑制率的剂量-效应关系曲线”，作为铜绿微囊藻叶绿素荧光法定量测定莠去津生物毒性的标准曲线。本发明能够简便、快速的测定莠去津的生物毒性，成本低廉，绿色环保。
文档编号G01N21/64GK103196884SQ201310137009
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月19日 优先权日2013年4月19日
发明者崔建升, 徐小惠 申请人:河北科技大学