专利名称：检测血小板特异性抗体的流式微球方法
技术领域：
本发明属于一种血小板基础实验研究上用来检测血小板特异性抗体的具有较高敏感性 的新型实验方法。
背景技术：
依据实验室血小板抗体检测方法出现的早晚，可分为I期、II期及III期检查方法'。I期检査出现于十九世纪50年代至70年代，主要检测患者血清或血浆在体外对正常血小板功能的影响，所用的实验方法均是间接法，其敏感性和特异性均很低。II期实验方法在十九世纪70年代发展起来，主要 是检测血小板相关抗体。血小板相关抗体虽然有较高的敏感性但特异性较低。 III期实验方法是在十九世纪80年代中期发展起来的抗原特异性分析法。最 近发展起来的糖蛋白俘获检查法一即单克隆抗体固定特异血小板抗原法，不 仅可检测血小板特异性抗体(间接法)而且可检测血小板相关的特异性抗体 (直接法)；并且血小板裂解发生在特异性抗体与血小板膜糖蛋白结合后，避 免了去垢剂处理对自身抗原表位的破坏；实验中在分离的试管内洗涤致敏的 正常血小板，阻止了血浆/血清与塑料的粘附，减低了背景干扰。这些方法特异 性较高，敏感性太低，限制了其在血小板抗体基础研究方面的应用。目前实验室需要一种敏 感性高的检测血小板自身特异性抗体的试验方法。

发明内容
本发明属于一种血小板基础实验研究上用来检测血小板特异性抗体的具有较高敏感性的新型实验方法。本发明用抗人血小板膜糖蛋白单抗包被微球，将血小板裂解液与包被过的微球孵育，之 后加入藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体，流式细胞仪分析。若血小板表面存在 特异性抗体，则形成"微球-血小板膜糖蛋白单抗-血小板膜糖蛋白特异性抗体-藻红蛋白标 记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体"复合物结构,表现为检测微球的荧光强度增高。本发明的技术方案包括如下步骤l微球包被采用物理吸附的方法包被聚苯乙烯微球，利用抗体Fc段的疏水作用与微球吸附，Fab段仍保持活性。包被前重悬微球，将微球加入包被缓冲液稀释好的鼠抗人单抗中， 室温涡旋震荡；2患者血样采集与处理抽取患者静脉血分离血小板，转移至离心管，离心取沉淀，血小板裂解液裂解后离心，吸取上清液；3抗原的俘获与上机检测向裂解后上清液加入单抗包被过的微球，室温震荡孵育，加 入藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体，避光震荡孵育离心，弃上清，流式细胞仪上进行检测；4数据处理散点图圈出检测微球门，获取微球，记录直方图中的检测微球的平均荧光 强度，对数据进行分析。设正常人作为对照。本发明操作方便，技术成熟，检测血小板特异性抗体敏感性高，有助于血小板特异性抗 体的基础实验研究。
具体实施例方式本发明的检测步骤如下1微球包被采用物理吸附的方法包被聚苯乙烯微球，利用抗体FC段的疏水作用与微球吸附，Fab段仍保持活性。包被前重悬微球，将微球加入包被缓冲液稀释好的鼠抗人血小 板膜糖蛋白单抗中(使抗体与微球比例为70ug抗体/ml微球)，室温涡旋震荡2小时(或4 。C涡旋震荡过夜)，0.01M PBS/TWEEN洗涤三次，之后5%小牛血清白蛋白震荡封闭微球2h， 0. 01M PBS/TWEEN洗涤三次，含0. 2%叠氮钠的等渗盐溶液重悬微球，使微球最终浓度为0. 25%。 4'C保存。十第1、 2、 5、 10、 30、 40天应用异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋A G多 克隆抗体及羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体(阴性对照)检测微球，根据荧光强度的高低及 其变化判断微球包被效果和稳定性；2血样采集与处理采血前血细胞计数仪计数患者血小板，根据患者血小板计数，于枸 橼酸钠抗凝的硅化管采集外周静脉血(应使采集血液屮至少含有1X1()S个血小板)，200Xg 离心10分钟，吸取上层富血小板血浆(PRP),转移至离心管，3000转/分钟离心2分钟(将 上清取出，置于离心管中，-scrc冻存，留作血浆中糖蛋白特异性特异性抗体的测定)，取沉 淀，P服.2、 0. 05mol/L的枸橼酸钠洗涤5次，重悬计数，取1 X 108个血小板置于Ep藻红蛋 白ndor士'管中，离心弃上清，加入含l%Trit。n X-100的裂解液110ul (内含0. lmg/ml的leu 藻红蛋白ptm)， 4'C30分钟。5000转/分钟离心5分钟，吸取上清液，转移至另一Ep藻红 蛋白ndorf管；3抗原的俘获与上机检测向裂解后上清液加入15000个单抗包被过的微球，室温震荡 孵育加，离心，弃上清，PBS-TWEEN洗涤三次，之后用98ul 0.01M PBS重悬，加入2ul藻 红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体，避光震荡孵育lh，离心，弃上清，PBS-TWEEN 洗涤二次，0.01M PBS调整最终体积至200ul，在BD-FACS Calibur流式细胞仪上利用 CellQuest Pro软件进行检测；4数据处理FSC/SSC散点图圈出检测微球门，获取2500-3000个微球，纪录FL-2直方 图中的检测微球的平均荧光强度，存盘后用软件对数据进行分析。检测标本的同时，将三个 正常人的血样作为正常对照。计算正常对照平均荧光强度的均值，将标本平均荧光强度与之 比较并计算比率。
权利要求
1、检测血小板特异性抗体的流式微球方法，其特征在于它采用如下步骤(1)微球包被采用物理吸附的方法包被聚苯乙烯微球，利用抗体Fc段的疏水作用与微球吸附，Fab段仍保持活性，包被前重悬微球，将微球加入包被缓冲液稀释好的鼠抗人单抗中，室温涡旋震荡；(2)患者血样采集与处理抽取患者静脉血分离血小板，转移至离心管，离心取沉淀，血小板裂解液裂解后离心，吸取上清液；(3)抗原的俘获与上机检测向裂解后上清液加入单抗包被过的微球，室温震荡孵育，加入藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体，避光震荡孵育离心，弃上清，流式细胞仪上进行检测；(4)数据处理散点图圈出检测微球门，获取微球，记录直方图中的检测微球的平均荧光强度，对数据进行分析，设正常对照。
2、根据权利要求1所述检测血小板特异性抗体的流式微球方法，其特征在于用抗人血 小板膜糖蛋白单抗包被微球，将血小板裂解液与包被过的微球孵育，之后加入藻红蛋白标记 的羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体,流式细胞仪分析，患者血小板表面存在自身抗体，形成"微 球-血小板膜糖蛋白单抗-血小板膜糖蛋白自身抗体-藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白G多克隆抗体"复合物结构,表现为检测微球的荧光强度增高。
全文摘要
本发明属于一种血小板基础实验研究上具有较高敏感性的用来检测血小板特异性抗体的流式微球方法。它用抗人血小板膜糖蛋白单抗包被微球，将血小板裂解液与包被过的微球孵育，之后加入藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体，流式细胞仪分析。若血小板表面存在自身抗体，则形成“微球-血小板膜糖蛋白单抗-血小板膜糖蛋白自身抗体-藻红蛋白标记的羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体”复合物结构，表现为检测微球的荧光强度增高。本发明操作方便，技术成熟，检测血小板自身抗体敏感性高，有助于血小板抗体的基础实验研究。
文档编号G01N33/546GK101246173SQ20071011319
公开日2008年8月20日 申请日期2007年10月22日 优先权日2007年10月22日
发明者明 侯, 冀学斌, 刘新光, 张爱军, 军 彭, 艳 石, 平 秦 申请人:侯 明;冀学斌;彭 军