专利名称：一种猪瘟活疫苗效力检验方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是一种猪瘟活疫苗效力检验方法。
背景技术：
猪瘟(ClassicalSwine fever，简称 CSF)又称为猪霍乱(Hog cholera)或欧洲型 猪瘟(European swine fever)，是一种猪急性或超急性发热的病毒传染性疾病，临床上的 特征是散播迅速、发烧，解剖检验时可看到典型的出血病变。猪瘟可感染各种年龄的猪只， 一年四季流行，发病率和死亡率均高，对猪危害极大。本病是威胁养猪业最重要的传染病之 一。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，中国则定为一类烈性 传染病。许多国家和地区使用猪瘟活疫苗强制接种免疫，也是目前防治猪瘟的最佳方法。目前，我国生产猪瘟活疫苗效力检测方法都是采用兔体反应热方法。不仅需要很 多试验大白兔，费时又费力，而且由于我国纯系大耳白兔的逐渐减少和品系越来越杂，导致 现如今很难用兔体反应热来准确检测活疫苗的效力
发明内容

鉴于此，本发明提供一种新的猪瘟活疫苗效力检验方法，具体地说，通过用间接免 疫荧光(IFA)方法检测活疫苗在传代细胞中病毒含量来评价活疫苗的效力，替代传统的兔 体反应热方法，以达到快速准确、简单有效的检测出猪瘟活活疫苗效力的目的。本发明提供了一种猪瘟活疫苗效力检验方法，包括如下步骤(1)准备传代细胞将长满单层的细胞，用EDTA-胰酶消化分散，得到传代细胞悬液；(2)猪瘟活疫苗在传代细胞中的病毒含量测定用细胞维持液将冻干猪瘟活疫苗回溶并稀释，将活疫苗稀释液和步骤(1)中细胞 悬液加入细胞培养板中，置于培养箱中培养，同时设立不接毒正常细胞对照；(3)间接免疫荧光(IFA)方法检测步骤(2)所得细胞中病毒含量①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用PBS洗涤；②加入丙酮水溶液固定；③弃去丙酮水溶液，用PBS洗涤；④加入PBS稀释的猪瘟阳性血清(一抗)；⑤弃去一抗，PBS洗涤；⑥加入PBS稀释的FITC标记兔抗猪IgG (二抗)；⑦弃去二抗，用PBS洗涤，最后加入PBS保存；⑧置于荧光显微镜下观察荧光情况，判定猪瘟活疫苗效力。较佳的，步骤(1)中在细胞板中加入细胞悬液的同时，加入步骤(2)中经稀释的猪
瘟活疫苗液。较佳的，步骤(2)中所述猪瘟活疫苗稀释是在0_8°C低温环境下进行。
较佳的，步骤(2)中培养箱是CO2培养箱，温度为36-37°C，C02含量为2. 5% -5%, 培养时间为2-5天。较佳的，步骤(3)中PBS洗涤的次数为2-7次。较佳的，步骤(3)中丙酮水溶液温度为0-8°C，浓度为30% -90 %。较佳的，步骤(3)中一抗的稀释倍数选择范围为50-1000倍，二抗的稀释倍数选择 范围为50-10000倍。优选的，步骤(3)中一抗的稀释倍数是400倍，二抗的稀释倍数是500倍。与现有技术相比，本发明具有如下技术效果1.检测时间短，只需要3天，而通常用兔体感染剂量检测至少需要11天。2.用细胞感染病毒，操作简单，成本低，不需要买大量的实验动物，同时不需要专 人测定实 验动物体温。3.利用细胞感染病毒，条件均一、稳定，不会出现实验动物个体差异而引起的实验
结果差异显著。
具体实施例方式实施例1猪瘟活疫苗效力检验方法1.准备传代细胞将长满单层的猪睾丸(ST)细胞(来源于ATCC，美国典型菌毒种保藏中心)，用 0. 25%的胰酶(含0. 02%的EDTA)消化分散后加入含3%胎牛血清的α -MEM细胞维持培 养液，细胞计数后，将细胞悬液加入到96孔细胞板中，每孔100 μ 1。2.猪瘟活疫苗的稀释本实施例制备了三批活疫苗，并分别测定了其抗原含量。猪瘟活疫苗的毒株为猪瘟兔化弱毒株(中国兽医药品监察所保藏，保藏号 AV1412)。将猪瘟兔化弱毒株接种ST细胞，将收获的病毒抗原液配以适当冻干保护剂制成 猪瘟活疫苗。用含3%胎牛血清的α-MEM细胞维持培养液将冻干猪瘟活疫苗回溶，在冰上 或其他可保持0-8°C的低温环境中进行10倍系列稀释，取KT1-KT7稀释度加入步骤1中的 细胞培养板的96孔板内，每孔100 μ 1，每个稀释度做8孔重复，将细胞培养板置于CO2培 养箱中培养，温度为36-37°C，CO2含量为2.5%-5%，培养时间为2-5天。优选地，温度为 37°C、CO2含量为5%、培养时间为3天，即可进行间接免疫荧光(IFA)判定毒价。同时，设 立不接毒正常细胞对照。具体步骤如下(1)弃去96孔板内液体，用0. 01mol/L的PBS(pH值为7. 4)洗2-7次，每次3min， 最优地，洗涤次数为3次，每次3min ；(2)加入温度为0-8 °C的30% -90%丙酮水溶液，最优地，80%的丙酮水溶液 IOOul/ 孔，4°C冰箱固定 30min ；(3)弃去丙酮，用0. 01mol/L的PBS (pH值为7. 4)洗2-7次，每次3min，最优地，洗 涤次数为3次，每次3min;(4)加入用0. 01mol/L的PBS(pH值为7. 4)作50-1000倍稀释的猪瘟阳性血清 (一抗，购自中国兽医药品监察所)，最优地，稀释倍数为400倍，抗体含量5 μ g/ml，每孔100 μ 1，37°C 作用 60min ；(5)弃去一抗，用O.Olmol/L的PBS(pH值为7.4)洗2-7次，每次3min，最优地，洗 涤次数为3次，每次3min;(6)加入用0. 01mol/L的PBS (pH值为7. 4)作50-10000倍稀释的异硫氰酸荧光 素(FITC)标记兔抗猪IgG (二抗，购自Sigma公司)，最优地，稀释倍数为500倍，抗体含量 6μ g/ml，每孔 100 μ 1，37°C 作用 60min ；(7)弃去二抗，用0. 01mol/L的PBS (pH值为7. 4)洗涤3次，每次lOmin，最后加入 0. 01mol/L 的 PBS (pH 值为 7. 4)，每孔 50 μ 1 ；(8)置于荧光显微镜下观察荧光情况，记录荧光孔数，按照Reed-Muench法计算 TCID50 结果；(9) IFA荧光判定标准设立的不接毒正常对照细胞胞浆内未出现特异黄绿色荧 光，而接毒的细胞板孔内细胞胞浆内可观察到特异性的黄绿色荧光，判定为阳性孔。观察结 果如下表1。
表1间接免疫荧光(IFA)观察结果 按照Reed-Muench法计算TCID50结果如下为表2所示。表2三批活疫苗的毒价测定结果 (1)活疫苗稀释具体稀释方法如下(每瓶疫苗按20头份计算)I、II、III批疫苗，两瓶冻干疫苗用生理盐水混合回溶至40ml，每头份1ml，取其中 Iml回溶后的疫苗液分别加入5. 325ml,8. 290ml,6. 431ml生理盐水，然后再依次进行10倍 系列稀释和5倍稀释，最终将每批疫苗稀释为病毒含量5TCID5(1/ml、lTCID5(1/ml、0. 2TCID50/ ml的疫苗使用液。具体操作如下取稀释后疫苗液Iml加入9ml生理盐水；取上步稀释后疫苗液Iml加入9ml生理 盐水；取上步稀释后疫苗液Iml加入9ml生理盐水；取上步稀释后疫苗液2ml加入8ml生理 盐水；取上步稀释后疫苗液2ml加入8ml生理盐水。(2)动物试验设计
此项试验用39头仔猪(猪瘟抗原抗体均为阴性、体重均勻、健康)，随机分为 10组，攻毒对照组为3头，免疫组每组4头。每批疫苗分别免疫3组，免疫剂量分别为 0. 2TCID50/头份、ITCID5q/头份、5TCID5(1/头份。免疫后14日，免疫组连同条件相同的对照 组一起注射IO5最小致死量(MLD)的猪瘟石门系血毒Iml (IO5MLD是指将猪瘟石门系血毒稀 释IO5倍后给猪攻毒1ml，猪仍然死亡，是行业内的攻毒标准)。观察16日，判定结果，如下 表3所示。根据结果，统计毒价与攻毒保护之间的相关性，统计出最小免疫剂量。表3动物试验设计及结果 攻毒实验的结果表明，I、II、ΙΙΙ批猪瘟活疫苗(ST传代细胞)分别稀释到ITCID5tl/ ml，注射1ml，即可达到仔猪全数保护量。即3批活疫苗对猪瘟石门系强毒的最小免疫剂量 均为ITCID5tl/头份。目前猪瘟疫苗国家标准均是以一头份的疫苗稀释3000倍后免疫猪仍 可以抵抗强毒攻击，而根据本发明方法，当检测的猪瘟活疫苗效价大于等于IO3 5TCID5tl/头 份时，稀释3000倍后免疫猪，即能达到全数的保护效果，符合国家的检测标准。因此，根据 本发明之方法，可以提出鉴定猪瘟活疫苗符合国家检测的标准。综上所述，本发明提供一种新的猪瘟活疫苗效力检验方法，具体地说，通过用间接 免疫荧光(IFA)方法检测活疫苗在传代细胞中病毒含量来评价活疫苗的效力。该方法检测 时间短，并且操作简单、成本低、得到的结果准确，可重复性好，具有很好的应用价值和广阔 的市场前景。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围 之内。
权利要求
一种猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于包括如下步骤(1)准备传代细胞将长满单层的细胞，用EDTA-胰酶消化分散，得到传代细胞悬液；(2)猪瘟活疫苗在传代细胞中的病毒含量测定用细胞维持液将冻干猪瘟活疫苗回溶并稀释，将活疫苗稀释液与步骤(1)中细胞悬液加入细胞培养板中，置于培养箱中培养，同时设立不接毒正常细胞对照；(3)间接免疫荧光(IFA)方法检测步骤(2)所得细胞中病毒含量①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用PBS洗涤；②加入丙酮水溶液固定；③弃去丙酮水溶液，用PBS洗涤；④加入PBS稀释的猪瘟阳性血清(一抗)；⑤弃去一抗，PBS洗涤；⑥加入PBS稀释的FITC标记兔抗猪IgG(二抗)；⑦弃去二抗，用PBS洗涤，最后加入PBS保存；⑧置于荧光显微镜下观察荧光情况，判定猪瘟活疫苗效力。
2.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于步骤(1)中在细胞 板中加入细胞悬液的同时，加入步骤(2)中经稀释的猪瘟疫苗液。
3.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于步骤(2)中所述猪 瘟活疫苗稀释是在0-8 °C低温环境下进行的。
4.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于步骤(2)中培养箱 是CO2培养箱，温度为36-37°C，CO2含量为2. 5% _5%，培养时间为2-5天。
5.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于步骤(3)中PBS洗 涤的次数为2-7次。
6.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于步骤(3)中丙酮水 溶液温度为0-8°C，浓度为30% -90%。
7.根据权利要求1所述的猪瘟活疫苗效力检验方法，其特征在于步骤(3)中一抗的 稀释倍数选择范围为50-1000倍，二抗的稀释倍数选择范围为50-10000倍。
全文摘要
本发明属于兽药生物新医药技术领域，具体涉及猪瘟活疫苗的效力检验方法。通过用间接免疫荧光(IFA)方法检测活疫苗的病毒含量来评价活疫苗的效力。该方法检测时间短，并且操作简单、成本低、得到的结果准确，可重复性好，具有很好的应用价值和广阔的市场前景。
文档编号G01N21/64GK101846683SQ20101021008
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者乔荣岑, 孙进忠, 张许科 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司