专利名称：一种羟基自由基的电化学分析方法
技术领域：
本发明属于羟基自由基的分析测试技术领域，具体涉及一种羟基自由基的电化学 分析方法。
背景技术：
活性氧(ROS)是一类化学性质比氧气更活泼的氧的代谢产物及含氧衍生物，主要 包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(02‘_)、羟基自由基(·0Η)、单线态氧(1O2)、过氧化自由基 (R00’)以及一氧化氮(NO)等，其中以·0Η的活性最高。·0Η的实时在线检测，对于研究TiO2 光催化和生命有机体的各种生理、病理反应(如癌症、机体炎症、组织过氧化、蛋白质交联 变性、DNA损伤和信号传导等)有良好的应用前景。自由基生物学最早出现于50年代初期，但由于当时借助的是电子自旋共振仪来 研究自由基，其仪器昂贵，难于普及，阻碍了这一学科的发展。直到1969年J. Μ. McCord 和I. J. Fridovich (Biol. Chem.，1969，244，6049)发现了清除超氧化物自由基的超氧物 岐化酶(SOD)并研究了其生物学作用。由于分子生物学的迅猛发展，研究短寿命的自由 基的方法有所突破，1969 年 F. Gerson 在 Electron Spin Resonance Spectroscopy of Organic Radicals —书中报道了电子顺磁共振波谱法检测脂质过氧化自由基(R00·)的 技术，1992年N. Chakraborty (Plant Physiol, 1992，98，7)中报导了利用分光光度法检测 1O2 的方法，2007 年 F. Scholz (Angew. Chem.，2007，119，8225)报导了电化学方法检测· OH 的技术。近代对活性氧的检测虽有较大进展，然而，由于活性氧具有反应活性高、寿命短 等特点，迫切需要设计一种简便、灵敏、有选择性地实时在线检测活性氧的方法。1969年 G. G. Guilbualt (Anal. Chem.，1967，39，271)报导了荧光分光光度法检测细胞中H2O2的方 法，但由于细胞中‘0H的寿命很短，会很快转变成H2O2，因此该方法不能选择性的检测细胞中 的.0H。

发明内容
本发明的目的在于提出一种羟基自由基的电化学分析方法，该方法基于电化学交 流阻抗技术表征疏水性长链脂肪烃单分子自组装修饰电极的电荷传递电阻，可实时在线检 测羟基自由基，并且可选择性检测无机体系和生物体有机体系中的‘ 0H。本发明的内容为一种羟基自由基的电化学分析方法，具体步骤如下(1)超疏水单分子自组装膜的制备将经过前处理的ITO导电玻璃作为工作电极，钼丝为对电极，饱和Ag/AgCl电极为 参比电极，在20-40mmol/L的氯金酸溶液中于_0. 08V下沉积5-30min，得到纳米金修饰电 极；将纳米金电极浸泡在含巯基的长链脂肪烃的乙醇溶液中修饰，制得超疏水自组装单分 子层；(2)光催化剂TiO2膜的制备将锐钛矿TiO2溶胶通过旋涂法修饰在经过前处理的ITO玻璃上，并在723K下烧结 lh，得到 TiO2 膜即 Ti02/IT0 ；(3) · OH对超疏水自组装单分子层的降解将步骤(1)制得的超疏水自组装单分子层与步骤(2)制得的TiO2膜正面相对，两 者面积均取0. 3-1. Ocm2,借助垫片使其间距为10-2000 μ m,用紫外光从Ti02/IT0背面一侧 照射不同的时间段，直至超疏水自组装单分子层降解完全，利用非接触TiO2光催化过程产 生的‘ OH降解超疏水自组装单分子层；(4) ESI表征超疏水自组装单分子层表面R。t的变化以修饰有超疏水自组装单分子层的Au电极为工作电极，在含有IOmmol/ UFe(CN)6]3*的0. lmol/L KCl溶液中，通过EIS方法表征[Fe (CN) 6] 氧化还原探针在 步骤(3)所述的不同光照时间里修饰有超疏水自组装单分子层的Au电极表面的电荷转移 电阻R。t;(5)荧光光度法定量非接触TiO2光催化产生的· OH将Ti02/IT0与玻璃组装成一个含有进气管和出气管的长方体密闭装置，其底面积 与TiO2膜面积相等，高与超疏水自组装单分子层和TiO2膜之间距离相等，且TiO2膜一侧在 密闭装置内；紫外光从Ti02/IT0背面照射，控制进气管以l-5ml/min的速度通入空气，将出 气管导入收集液中，室温下反应10-30min，用荧光光度法定量不同时间生成的H2O2，确定非 接触TiO2光催化过程中生成的‘ OH的量；其中，所述收集液含有三羟甲基氨基甲烷缓冲液、高香草酸(HVA)和辣根过氧化 物酶；(6) ESI 间接检测· OH建立步骤(4)中不同光照时间后[Fe (CN)6] 在修饰有超疏水自组装单分子层 的Au电极表面Ret的变化与步骤(5)中在相同实验条件下生成的‘0H的物质的量之间的对 应关系，通过ESI检测非接触TiO2光催化和巨噬细胞中产生的‘ OH的量。本发明中，步骤(1)和步骤(2)中铟锡氧化物(ITO)导电玻璃的前处理过程为分 别在去离子水、乙醇、lmol/L的KOH水溶液中依次超声清洗半小时后，用去离子水洗净并吹 干。本发明中，步骤(1)中使用的含巯基的长链脂肪烃为十八烷基硫醇(ODT)，溶液为 浓度为Immo 1/L，修饰ODT的时间为7_12h。较佳的，本发明中步骤(3)超疏水自组装单分子层与TiO2膜正面相对的距离为 50 μ m,面积为1cm2，紫外光强度为7. 6mff/cm2,光照时间为0-380min，即从ODT刚刚开始降 解到被降解完全。本发明的有益效果在于该方法具有较高的选择性和灵敏度，其线性范围为1. 8 43. 8nmol，最低检测线 为1. Snmol，可以原位检测细胞中产生的‘ 0H,也可选择性检测无机体系和生物体有机体系 中的·0Η。


图1是交流阻抗技术检测非接触TiO2光催化过程中‘ OH机理的示意图；图2是收集非接触TiO2光催化过程中的H2O2的示意图3是实施例lODT/Au电极在非接触TiO2光催化过程中反应不同时间的交流阻 抗图，其中a线是Omin，b线是30min，c线是60min，，d线是180min，，e线是240min，，f线 是300min，，g线是360min，h线是金电极，小图是[Fe (CN) 6] 在ODT/Au表面Rct的减小 百分比与‘0H的物质的量之间的线性关系图；图4是实施例1检测细胞中‘OH的交流阻抗图，其中a线是ODT/Au电极与细胞 中‘0H反应后的交流阻抗线，b线是ODT/Au电极与细胞中‘0H反应后的交流阻抗线。
具体实施例方式下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。实施例1检测小鼠白血病巨噬细胞(RAW264. 7)产生的· OH(1)超疏水自组装单分子层的制备如图1所示，将铟锡氧化物(ITO)导电玻璃分别用去离子水、乙醇、lmol/L的KOH 水溶液超声清洗半小时，去离子水洗净并吹干。将此ITO导电玻璃作为工作电极，钼丝为对 电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，于40mmol/L的氯金酸溶液中在_0. 08V下沉积5min， 得到纳米金电极。将纳米金电极浸泡在ODT的乙醇溶液中(lmmol/L)，修饰12h，得到ODT/ Au超疏水界面。(2)光催化剂TiO2膜的制备将ITO导电玻璃分别用去离子水、乙醇、lmol/L的KOH水溶液超声清洗半小时，去 离子水洗净并吹干。将锐钛矿纳米TiO2溶胶通过旋涂法修饰在ITO玻璃上，并在723K下 烧结lh，得到超亲水纳米Ti02/IT0膜。(3) ’ OH对超疏水自组装单分子层的降解借助垫片使面积均为Icm2的ODT/Au与Ti02/IT0保持50 μ m距离，正面相对。在 室温、空气相对湿度为60%条件下，用7. 6mW/cm2紫外光(UV light)从Ti02/IT0背面一侧 分别光照 15、30、45、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、38011^11，利用该非接 触TiO2光催化体系产生的‘ OH降解ODT自组装单分子层。(4) ESI表征超疏水自组装单分子层表面R。t的变化以ODT/Au电极为工作电极，钼丝为对电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，在含有 IOmM[Fe (CN)6ΓΛ-的0. lmol/L KCl溶液中，通过EIS方法表征[Fe (CN)6]3*氧化还原探针 上述光照不同时间下ODT/Au电极表面的电荷转移电阻。(5)荧光光度法定量非接触TiO2光催化产生的‘ OH如图2所示，通过垫片将Ti02/IT0与玻璃组装成一个内部体积为 IcmX lcmX50 μ m的含有进气管和出气管的密闭装置，TiO2膜朝向密闭装置内。用7. 6mW/ cm2紫外光从Ti02/IT0背面一侧光照，光照面积为1 X Icm2，控制进气管以2ml/min的速度通 入室温、相对湿度为60%的空气，将出气管导入含0. lmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH =8. 50), 2. 5mmol/L高香草酸(HVA)和2. 0U/ml的辣根过氧化物酶(HRP)的3ml搜集液 中，室温下反应30min。基于HRP催化过氧化氢(H2O2)氧化HVA生成能产生荧光的二聚体， 在激发波长λεχ为313nm、发射波长λ em为425nm下，用荧光方法检测紫外光照不同时间生 成的H2O2，根据双激发原理2 · 0H)确定生成的‘0H的物质的量。(6) ESI 间接检测· OH
如图3所示，根据得到的不同光照时间下恤(0幻6]3-/4-在0017^11表面R。t的变化 与相同实验参数下生成的‘0H的物质的量，确定二者之间的对应关系。以ODT/Au电极为工 作电极，钼丝为对电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，在含有1 XlO6nIr1RAWZei 7细胞、 10馳[卩6化吣6]3"4-、100_01/1葡糖糖和0. lmol/L KCl 溶液中表征[Fe (CN) 6] 3- 在 ODT/Au 电极表面的R。t，然后加入脂多糖(LPS，在氧气充足的情况下刺激细胞产生大量)，使其最终 浓度为500ng/ml，410K下反应半小时，EIS表征[Fe (CN) 6] 在ODT/Au电极表面Rct。与没加入LPS前相比，Ret减小了 34.47 %。由图3可推知细胞产生的·OH为 15. 5nmoL·图4是[Fe (CN) 6] 条在ODT/Au电极表面Ret变化图。实施例2检测小鼠白血病巨噬细胞(RAW264. 7)产生的· OH(1)超疏水自组装单分子层的制备如图1所示，将铟锡氧化物(ITO)导电玻璃分别用去离子水、乙醇、lmol/L的KOH 水溶液超声清洗半小时，去离子水洗净并吹干。将此ITO导电玻璃作为工作电极，钼丝为对 电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，于20mmol/L的氯金酸溶液中在_0. 08V下沉积30min， 得到纳米金电极。将纳米金电极浸泡在ODT的乙醇溶液中(lOmmol/L)，修饰lh，得到ODT/ Au超疏水界面。(2)光催化剂TiO2膜的制备将ITO导电玻璃分别用去离子水、乙醇、lmol/L的KOH水溶液超声清洗半小时，去 离子水洗净并吹干。将锐钛矿纳米TiO2溶胶通过旋涂法修饰在ITO玻璃上，并在723K下 烧结lh，得到超亲水纳米Ti02/IT0膜。(3) ’ OH对超疏水自组装单分子层的降解借助垫片使面积均为Icm2的ODT/Au与Ti02/IT0保持50 μ m距离，正面相对。在 室温、空气相对湿度为60%条件下，用7. 6mW/cm2紫外光(UV light)从Ti02/IT0背面一侧 分别光照 15、30、45、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、38011^11，利用该非接 触TiO2光催化体系产生的‘ OH降解ODT自组装单分子层。(4) ESI表征超疏水自组装单分子层表面R。t的变化以ODT/Au电极为工作电极，钼丝为对电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，在含有 5mM[Fe (CN)6]3*的0. lmol/L KCl溶液中，通过EIS方法表征[Fe (CN)6]氧化还原探针 上述光照不同时间下ODT/Au电极表面的电荷转移电阻。(5)荧光光度法定量非接触TiO2光催化产生的‘ OH如图2所示，通过垫片将Ti02/IT0与玻璃组装成一个内部体积为 IcmX lcmX50 μ m的含有进气管和出气管的密闭装置，TiO2膜朝向密闭装置内。用7. 6mW/ cm2紫外光从Ti02/IT0背面一侧光照，光照面积为1 X Icm2，控制进气管以2ml/min的速度通 入室温、相对湿度为60%的空气，将出气管导入含0. lmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH =8. 50), 2. 5mmol/L高香草酸(HVA)和2. 0U/ml的辣根过氧化物酶(HRP)的3ml搜集液 中，室温下反应30min。基于HRP催化过氧化氢(H2O2)氧化HVA生成能产生荧光的二聚体， 在激发波长λεχ为313nm、发射波长λ em为425nm下，用荧光方法检测紫外光照不同时间生 成的H2O2，根据双激发原理· 0Η)确定生成的‘0Η的物质的量。(6) ESI 间接检测· OH如图3所示，根据得到的不同光照时间下[Fe (CN)6]3"4-在ODT/Au表面R。t的变化与相同实验参数下生成的‘0H的物质的量，确定二者之间的对应关系。以ODT/Au电极为工 作电极，钼丝为对电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，在含有1 XlO6nIr1RAWZei 7细胞、 10馳[卩6化吣6]3"4-、100_01/1葡糖糖和0. lmol/L KCl 溶液中表征[Fe (CN) 6] 3- 在 ODT/Au 电极表面的R。t，然后加入脂多糖(LPS，在氧气充足的情况下刺激细胞产生大量)，使其最终 浓度为 500ng/ml，410K 下反应 20min，EIS 表征[Fe (CN) 6] “4-在 ODT/Au 电极表面 Rct。
与没加入LPS前相比，Ret减小了 25. 1%。由图3可推知细胞产生的·OH为 11. 2nmol。
权利要求
一种羟基自由基的电化学分析方法，其特征在于具体步骤如下(1)超疏水单分子自组装膜的制备将经过前处理的ITO导电玻璃作为工作电极，铂丝为对电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，在20 40mmol/L的氯金酸溶液中于 0.08V下沉积5 30min，得到纳米金修饰电极；将纳米金电极浸泡在含巯基的长链脂肪烃乙醇溶液中，制得超疏水单分子自组装膜；(2)光催化剂TiO2膜的制备将锐钛矿TiO2溶胶通过旋涂法涂覆在经过前处理的ITO玻璃上，并在723K下烧结1h，得到TiO2膜；(3)·OH对超疏水单分子自组装膜的降解将步骤(1)制得的超疏水单分子自组装膜与步骤(2)制得的TiO2膜正面相对，两者面积均取0.3 1.0cm2，借助垫片使其间距为10 2000μm，用紫外光从TiO2膜背面照射不同的时间段，直至超疏水单分子自组装膜完全降解，利用非接触TiO2光催化过程产生的·OH降解超疏水单分子自组装膜层；(4)ESI表征超疏水单分子自组装膜表面Rct的变化以修饰有超疏水单分子自组装膜电极为工作电极，在含有5 10mmol/L[Fe(CN)6]3 /4 的0.1mol/L KCl溶液中，通过EIS方法表征[Fe(CN)6]3 /4 氧化还原探针在步骤(3)所述的不同光照时间里修饰有超疏水单分子自组装膜电极表面的电荷转移电阻Rct；(5)荧光光度法定量非接触TiO2光催化产生的·OH将TiO2膜与玻璃组装成一个含有进气管和出气管的长方体密闭装置，其底面积与TiO2膜面积相等，高与超疏水自组装单分子层和TiO2膜之间距离相等，且TiO2膜一侧在密闭装置内；紫外光从TiO2膜背面照射，控制进气管以1 5ml/min的速度通入空气，将出气管导入收集液中，室温下反应10 30min，用荧光光度法定量不同时间生成的H2O2，确定非接触TiO2光催化过程中生成的·OH的量；其中，所述收集液含有三羟甲基氨基甲烷缓冲液、高香草酸HVA和辣根过氧化物酶；(6)ESI间接检测·OH建立步骤(4)中不同光照时间后[Fe(CN)6]3 /4 在修饰有超疏水单分子自组装膜电极表面Rct的变化与步骤(5)中在相同实验条件下生成的·OH物质的量之间的对应关系，通过ESI检测非接触TiO2光催化和巨噬细胞中产生的·OH的量。
2.根据权利要求1所述的一种羟基自由基的电化学分析方法，其特征在于步骤(1)和 步骤(2)中铟锡氧化物即ITO导电玻璃的前处理过程为分别在去离子水、乙醇、lmol/L的 KOH水溶液中依次超声清洗半小时后，用去离子水洗净并吹干。
3.根据权利要求1所述的一种羟基自由基的电化学分析方法，其特征在于步骤(1)中 使用的含巯基的长链脂肪烃为十八烷基硫醇，溶液为浓度为lmmol/L，修饰十八烷基硫醇的 时间为l_24h。
4.根据权利要求1所述的一种羟基自由基的电化学分析方法，其特征在于步骤(3)超 疏水单分子自组装膜与TiO2膜正面相对的距离为50 μ m,面积为1cm2，紫外光强度为7. 6mff/ cm2，光照时间为0-380min。
全文摘要
本发明属于羟基自由基分析测试技术领域，具体涉及一种羟基自由基的电化学分析方法。具体步骤有超疏水单分子自组装膜的制备；光催化剂二氧化钛(TiO2)膜的制备；·OH对超疏水单分子自组装膜的降解；电化学交流阻抗法(ESI)表征超疏水单分子自组装膜表面的电荷传递电阻(Rct)的变化；荧光光度法定量分析非接触TiO2光催化产生的·OH；ESI间接分析检测·OH六个步骤。本发明具有较高的选择性和灵敏度，其线性范围为1.8～43.8nmol，最低检出限为1.8nmol，可以原位检测细胞中产生的·OH，也可选择性分析无机体系和生物体有机体系中的·OH。
文档编号G01N21/64GK101929975SQ20101024556
公开日2010年12月29日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者刘岩, 朱安伟, 田阳 申请人:同济大学