专利名称：食物链传递标记物定量分析法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生态学定量测定方法，尤其涉及利用标记物，对食物链上营养物总量传递进行定量分析方法的创新。
以往在生态学领域，对食物链中营养物总量传递的定量分析方法，多采用放射性元素(32P等)、或荧光染料液/粉(如若丹明-B、硫化锌粉)作为传递标记物，投放给食物链低层营养级，通过培养，使其向食物链高层营养级逐级传递，然后对每一营养级取样，进行化学分析，得出标记物传递的定量结果，再换算成营养物总量传递数值。但放射性元素标记物价格昂贵，污染环境，伤害人体；而荧光染料液/粉除对环境也有一定污染外，主要因其只能吸附在动、植物外表，不易被吸收进入体内循环，难以真正进入食物链传递，且易受环境变化(如雨水冲刷，风力吹散等)左右，随机波动太大，以至标记物传递可靠性及测定准确性和精度大大降低等缺点，故自从二十世纪四、五十年代以来，上述两类方法均一直难以在本领域推广。
本发明的目的，旨在为本领域找到一种既不污染环境，不伤害生物，又易于被动植物吸收进入体内循环，从而易于进入食物链传递，随机波动小，传递可靠性高，且便于准确、精密测定的标记物及相应的定量分析方法。
为达上述目的，本发明提供一种在生态学领域，利用标记物，对食物链上营养物总量传递进行定量测定的分析方法依次包括自食物链低层营养级投放标记物，培养向高层营养级传递标记物，后对食物链每一营养级进行取样，再根据标记物性质对各营养级样本初步提纯，获取预处理样品溶液，继而对各级预处理样品溶液进行化学分析，经处理得出标记物及营养物总量传递的定量结果，其特征在于所述的标记物是与强酸根结合或以其它形式存在的三价铕离子(Eu+3)；因为三价铕离子(Eu+3)，对自然界及生物没有污染和危害；三价铕的强酸盐易溶于水，容易被动、植物消化吸收进入体内，逐步向食物链高层营养级传递，外在随机误差小；且铕在自然界及生物体内的丰度极低，一般极少自然吸收，适宜作为食物链中的人为标记物；从分析测定方面看，铕是稀土中荧光效果较强的，便于作微量测定分析，所以采用稀土元素铕作为新的传递标记物，具有现有方法难以比拟的优越性。
对铕标记物的化学分析方法依次包括如下步骤(1)在各级样品溶液、空白对照样品溶液中加入三种掩蔽剂，以去除干扰离子，在此基础上，添加有机萃取相进行有机萃取，(2)对有机萃取相中的(Eu+3)，用强酸溶液进行反萃取进入水相，(3)对反萃取水相中的(Eu+3)，加入敏化剂进行敏化，再加入亲(Eu+3)的生色双配体溶液，形成三元生色络合物溶液，(4)将生色络合物溶液置于荧光光度计上，以适宜波长激发样品溶液发生荧光，测定继发荧光强度，再换算成相应的重量百分比。
上述的步骤(1)中，所述的掩蔽剂是抗坏血酸，以含酸量约25％的样品液为基数，加入量为0.5％-1.5％(w/w)；(40％)硫氰化铵水溶液，及(20％)磺基水杨酸水溶液；随后萃取过程，为控制pH值在5.4-6.2间，优选值pH5.8，以酸碱指示剂控制终点，采用氨水与盐酸溶液粗调，以乙酸-乙酸铵缓冲液精调；所述的有机萃取相是(0.5％)1-苯基-3-甲基-4-苯酰基吡啉酮(PMBP)-苯溶液，最后弃水相留下有机萃取相。
上述的步骤(2)中的强酸溶液是盐酸水溶液，加入量以原有机相为基数的35-45％(V/V)。
上述的步骤(3)中的敏化剂是三氧化二钆的酸溶液，敏化过程控制pH值在4-5间，优选4.5；所述的亲(Eu+3)的生色双配体溶液是(0.1mol/l)二苯甲酰甲烷(DBM)-乙醇溶液，及(0.1mol/l)溴代十六烷基吡啶(CPB)-乙醇溶液；用浓氨水粗调，用四硼酸钠-氢氧化钠缓冲液精调，控制形成的三元生色络合物溶液的pH值在9.5-10.5间，优选10.0。
所述的步骤(4)中适宜的激发光波长为250-480nm，优选390nm；继发光波长为470-613nm，优选612nm；采用日本岛津的荧光分光光度计测定。
本方法标记物安全环保，传递可靠，便于精确测定；后续分析步骤包括；对十几种干扰离子作三重掩蔽，对标记物作有机萃取再反萃取，敏化后三元络合生色，高效率荧光分析等，故大大强化了选择性，提高了灵敏度，在本领域具有先进性。
以下结合实施例进一步说明如下。
食物链各营养级培养及取样在培养基水中投放(Eu+3)标记物达10ppm，培养水稻四天，然后在水稻上引入水稻害虫(白背飞虱，褐飞虱)，培养四天，再引入害虫天敌-蜘蛛(狼蛛、瘤蛛)培养四天，分别按时间，对水稻、害虫、天敌取样(水稻2-4克，害虫、天敌尽可能多)，并取水稻、害虫、天敌空白对照样，均秤量记载。
样品预处理对上述各营养级，足量样品入马蝠炉在850-900℃灰化1小时，不足量样品放入坩埚中，加硝酸、高氯酸于电炉上消化。同时取纯品氧化铕(Eu2O3)加入去离子水，配成含(Eu+3)系列浓度标准溶液(ppm0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0)各1ml；然后在上述灰化样品、消化样品、及系列标准样品溶液的坩埚中均平行加入1∶1盐酸5ml，数滴30％过氧化氢，在电炉上搅动溶解15分钟，以定量滤纸置于分液漏斗上，对上述样品液过滤，再用2％盐酸溶液洗坩埚，用去离子水洗滤纸，各数次，合并滤/洗液并稀释到10ml；三重掩蔽及有机萃取；在上述的预处理液中，依次平行加入0.1克抗坏血酸并溶解，2ml(40％)硫氢化铵溶液，2ml(20％)磺基水杨酸溶液，再加入2-3滴溴代百里酚蓝指示剂，用1∶1浓氨水调至蓝绿色，后用1∶9盐酸溶液调到转黄色，加入5ml(pH5.8)乙酸-乙酸铵缓冲液，最后加入20ml(0.5％)PMBP-苯萃取液，振荡2-4分钟，静止分层后，弃去水相留下有机相待用。
反萃取；在上述的有机萃取相中，平行加入10ml(pH2.4)盐酸溶液，振荡分层后，分离水相保留，重复以上操作，合并水相。
敏化及生色络合；在上述的水相中，平行加入盐酸或浓氨水，粗调pH至4-4.5，加入4ml(pH4.5)乙酸-乙酸铵缓冲液精调，再加入1滴敏化剂-三氧化二钆的盐酸溶液，后加生色双配体溶液；5滴(0.1mol/l)DBM溶液，1滴(0.1mol/l)CPB溶液，用浓氨水粗调pH到10，再加5ml(pH10)四硼酸钠-氢氧化钠缓冲液，摇匀待用。
荧光测定；将上述待测液体置于日本岛津RF-5301PC型荧光分光光度计中，以波长390nm激发光波，激发、测定样品中铕的继发荧光(波长612nm)强度；先利用含(Eu+3)系列标准溶液绘制光强-含量的标准曲线，并回归分析得出经验公式，然后根据对各营养级样品的实测荧光强度，计算得出铕含量，进而换算出各营养级样品中标记物的传递量。结果分述如下；A)标准曲线回归公式；Y＝177.0988X-0.8344，(Y荧光强度值，X标记物(Eu+3)的浓度μg/ml)。
经误差分析证明，上述公式(包括常数；-0.8344)的误差范围小于0.2ppm，准确度很高；线性区间X＝0～2.6μg/ml，对于所述领域已足够工作；由此公式可见；公式中的浓度单位为μg/ml，而回归系数有上百倍的乘积效应，因此本方法的分析灵敏度很高。
B)依据前述各步骤所得(Eu+3)实际测定值，结合取样类别、批次、批量，进行微量分析数据处理，得到各营养级样品中标记物的测算结果，举例如下营养级4日平均传递量g/g·day 本底量g/g1-1)早稻(空白)～0、 0～8.608×10-8白背飞虱(空白)～0、 0、狼蛛(空白)～0、 0～3.768×10-9瘤蛛(空白)～0、 0～1.713×10-71-2)早稻(10ppm/Eu)、 1.46×10-7-白背飞虱(Eu链)3.41×10-7-狼蛛(Eu链)1.573×10-7-1-3)早稻(10ppm/Eu)0.546×10-7-
白背飞虱(Eu链)4.03×10-7-瘤蛛(Eu链)38.7×10-7-2-1)晚稻(空白)～0、 0、褐飞虱(空白) ～0、 0-6.645×10-11狼蛛(空白)～0、 0-6.266×10-10瘤蛛(空白)～0、 0-2.782×10-102-2)晚稻(10ppm/Eu)1.138×10-7-褐飞虱(Eu链) 5.84×10-7-狼蛛(Eu链)13.60×10-7-2-3)晚稻(10ppm/Eu)0.7415×10-7-褐飞虱(Eu链) 4.30×10-7-瘤蛛(Eu链)65.7×10-7-由上所有测算结果举例可见，本发明的方法，标记物传递有效、明显，与其中的化学分析方法、分析仪器及测定灵敏度、精确度配合很好，为深入分析研究食物链中营养物传递关系，提供了全新、有效、成本低廉的手段和基础。
权利要求
1.一种在生态学领域，利用标记物，对食物链上营养物总量传递进行定量测定的分析方法，包括自食物链低层营养级投放标记物，培养向高层营养级传递标记物，后对食物链每一营养级进行取样，再根据标记物性质对各营养级样本初步提纯，获取预处理样品溶液，继而对各级预处理样品溶液进行化学分析，经处理得出标记物及营养物总量传递的定量结果，其特征在于(A)所述的标记物是与强酸根结合或以其它形式存在的三价铕离子(Eu+3)；(B)所述的化学分析方法依次由如下步骤组成(1)在各级样品溶液、及空白对照样品溶液中加入三种掩蔽剂，以去除干扰离子，在此基础上，添加有机萃取相进行有机萃取，(2)对有机萃取相中的(Eu+3)，用强酸溶液进行反萃取进入水相，(3)对反萃取水相中的(Eu+3)，加入敏化剂进行敏化，再加入亲(Eu+3)的生色双配体溶液，形成三元生色络合物溶液，(4)将生色络合物溶液置于荧光光度计上，以适宜波长激发样品溶液发生荧光，测定继发荧光强度，再换算出相应(Eu+3)的重量百分比。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的步骤(1)中，所述的掩蔽剂是抗坏血酸，硫氰化铵溶液，及磺基水杨酸溶液，所述的有机萃取相是(1-苯基-3-甲基-4-苯酰基吡啉酮(PMBP)-苯溶液，萃取过程控制pH值在5.4-6.2间，优选5.8。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的步骤(2)中的强酸溶液是盐酸水溶液，pH值在2-3间，优选(pH2.4)盐酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的步骤(3)中的敏化剂是三氧化二钆的酸溶液，敏化过程控制pH值在4-5间，优选4.5；所述亲(Eu+3)的生色双配体溶液是二苯甲酰甲烷(DBM)-乙醇溶液，及溴代十六烷基吡啶(CPB)-乙醇溶液；控制所形成的三元生色络合物溶液在pH值9.5-10.5间，优选10.0。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的步骤(4)中适宜激发光波长为250-480，优选390nm；继发光波长为470-613nm，优选612nm。
全文摘要
一种在生态学领域，利用标记物对食物链上营养物传递进行定量测定的分析方法，其特征在于标记物是与强酸根结合或以其它形式存在的三价铕离子Eu
文档编号G01N33/52GK1316642SQ01114479
公开日2001年10月10日 申请日期2001年5月23日 优先权日2001年5月23日
发明者王洪全, 杨海明, 李承志, 朱泽瑞, 贺一原, 胡自强, 颜亨梅, 黎红辉 申请人:湖南师范大学