专利名称：用于在生物分析传感器应用中研究试剂跨双层膜运输的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于测量试剂跨双层膜运输的方法和装置。
背景技术：
跨膜运输以及结合在膜上的分子例如膜蛋白的影响对于例如研发新药物时的研 究以及在许多其他相关领域中意义重大。在1985年奥弗顿(Overton)提出分子以与它们的油-水分配系数相同的相对规 则渗透细胞[1]，并且在1943年丹尼利(Danielli)提出连续的脂双层相当于扩散壁垒，决 定跨细胞膜的被动扩散速率[2]。然而，随着制备分隔两个液舱的单个脂双层的方法的发 展，在60年代早期出现了第一个直接研究跨独立的脂双层渗透的方法[3]。虽然这种技术 很适合于带电溶质的渗透率研究，但当今的这种用于非电解质的被动和主动运输(包括水 运输和药物摄取)的研究的标准方法依赖于悬浮的脂质囊(所谓的脂质体)的渗透诱发的 尺寸变化的测量[4]。这种方法是基于当渗透诱发的跨脂质膜的水转移导致脂质体尺寸变 化时对散射光的强度差进行的动态光散射(DLS)测量，这种变化为脂质体先(< 1ms)收 缩，因为此时水扩散出脂质体，接下来脂质体膨胀，因为此时水在溶质分子向内渗透作用的 驱动下重新进入该脂质体[5]。尽管已经成功地应用于许多被动和主动溶质渗透的特性的 研究[6]，但是这种方法受限于脂质体尺寸的变化是一种间接效应的事实，这种变化并不一 定与实际的溶质运输有关。另外，因为不仅脂质体尺寸，还有脂质体运动、溶质折射率和膜 聚集都对散射光的强度有贡献，溶质转移的这种量化并不总是简单的[7，8]。从实用角度 考虑，这种方法还受低信噪比的影响，这意味着通常要求通过多个数据组的平均来解析动 力学曲线(kinetic traces) 0更进一步地，因为是对悬浮的脂质体进行测量，所以这种方 法不适合于完全相同的脂质体试样的平行或依次筛选。这转而意味着通常需要大量材料。 除了略有改善的灵敏度以外，对于一种比较不广泛使用的方法也存在这些限制，在这种方 法中，通过监控脂质体包封的荧光团在脂质体收缩和随之而来的荧光团浓度增加时的自猝 灭的变化来记录渗透诱发的尺寸波动[9]。可以对多个识别事件或依次或同时地进行筛选 是基于表面的生物分析传感技术的主要优点之一，在这种技术中，将完全相同的一组固定 在表面的探针分子以自动的方式暴露在一系列不同的化合物中。这些传感器在生命科学中 的重要性逐渐突显的另外一个原因是由于这些传感器能够与微流体处理(micro-fluidic handling)结合[10]，这使得它们适用于小试样体积并因此非常适于测量稀少和不富余的 物质。表面等离子体共振仪(SPR)是当今主导的基于表面的生物分析传感器。它基于在平 面金属(通常为金)基底上横向传播的表面等离子的激发，其中sra激发的条件对例如由 与所述表面非常接近(通常为几百个纳米)的区域内的生物分子结合诱发的界面折射率 Δ η胃胃的变化是极度敏感的。因此，通过将探针分子固定在所述表面上，可通过良好近似于 与八1!^5成比例的响应来实时监控固定的探针与靶物的结合[11，12]。其他公知的研究跨膜运输的手段包括溶液中的脂质体。在脂质体膜上结合着例如
4感兴趣的膜蛋白，采用涉及例如荧光和/或放射性测量的方法研究由所述膜蛋白介导的试 剂的跨膜运输。US2004/0033624披露了一种膜受体试剂和测试装置。脂质体束缚在具有锚基团 (anchor groups)的表面上。该表面包含束缚在该表面上的试剂配体。该配体能够可逆地 与脂质体膜中的受体结合。脂质体中的膜蛋白与能够被表面释放的能量激发的分子结合并 因此而产生可检测的信号。脂质体膜中的膜蛋白与表面上的试剂配体的结合通常将脂质体 拉向所述表面。与所述膜蛋白具有亲和力的测试分子将竞争性地与膜蛋白结合并且一定程 度上取代所述表面上的试剂配体。这将导致膜蛋白从所述表面脱落并且在脂质体膜中重新 分布，而脂质体仍然固定于所述表面。从所述表面至所述膜蛋白的平均距离将会更大，因而 它们从所述表面获得的能量较少，因为从所述表面转移的能量与距离有关。这可以被检测 到。为实现上述目的，在美国专利申请2004/0033624中的方法要求某种标记物例如荧光 团。根据现有技术，在用于膜蛋白介导的跨膜运输的测量的分析方法中，存在改进膜 蛋白的必需用量的空间。通常，提纯大量的膜蛋白是困难且昂贵的。在现有技术中还存在改进空间，因为在许多分析方法中必须使用标记物。标记并 不总是能够进行的，因为它可能改变分析物/受体的结构和功能并且干扰待研究的分子间 相互作用。另外荧光性标记物是疏水性的，这可能引起非特异性的背底结合。

发明内容
本发明的一个目的是为了解决用于测量跨膜运输的公知分析方法和装置中的至 少部分问题，以及为了提供一种改进的方法和装置，减轻现有技术中的至少部分问题。进一 步地，经仔细研究本说明书、实施例和权利要求书，公知方法和装置的缺点和本发明实施例 的优点对于本领域的技术人员是显而易见的。本文公开了一种如权利要求书中所限定的方法和装置，通过引用的方式并入本文中。经仔细研究本说明书、实施例、权利要求书和附图，本发明的其他方面以及它们的 优点对于本领域技术人员是显而易见的。定义在详细描述本发明的装置和方法前，可以理解的是，本发明不限于本文中公开的 那些具体的构造、方法步骤、检测方法、传导方法、传感器和材料，因为这些构造、方法步骤、 检测方法、传导方法、传感器和材料可以稍有变化。还可以理解的是，本文中所使用的术语 仅仅是为了描述具体的实施例，并不用于表示限定，因为本发明的范围将仅由权利要求和 它们的等同替代物限定。还必须注意的是，本说明书和权利要求中所使用的单数词语“一个”(“a”，“an”) 和“这个”、“那个”(“the”)包括复数指示对象，除非在上下文中清楚地另指他意。因此， 例如，含有“一个分析物”的反应混合物的指示对象包括两种或更多种分析物的混合物。当用于本文中的数值时，词语“大约”表示为本领域技术人员熟悉且可接受的精确 度区间。所述区间优选为士 10%。在描述和要求保护本发明的过程中，将根据本文中所设的定义使用以下的术语。
本说明书和权利要求书使用的术语“双层结构”表示原子或分子尤其是脂质的双 层结构。该词语包括所有几何形状的双层，包含但不限于弯曲的双层。双层结构的例子包 括但不限于脂质体。本说明书和权利要求书使用的术语“检测体积”表示测量折射率的体积。本说明书和权利要求书使用的术语“椭圆偏振光谱传感器”表示包含椭圆偏振光 谱仪的传感器。本说明书和权利要求书使用的术语“离子载体”表示能够跨过脂质双层运输离子 的可溶于脂质的分子。本说明书和权利要求书使用的术语“脂质”表示任何可溶于脂肪的分子。脂质的 例子包括但不限于脂肪、油、石蜡、胆固醇、固醇、单甘油酯、双甘油酯和磷脂。本说明书和权利要求书使用的术语“脂质体”表示含有脂质双层膜的大致球状的 囊。脂质体可以包括水溶液的核。脂质体的脂质膜可以包括但不限于例如蛋白质、糖脂、类 固醇组分和其他与膜结合的组分。
本说明书和权利要求书使用的术语“膜”包括各种类型的膜，例如但不限于双层 膜。膜可以包括分子，例如但不限于蛋白质和脂质。本说明书和权利要求书使用的术语“膜蛋白”表示结合在膜上的蛋白质。本说明书和权利要求书使用的术语“传感器”表示采用一种类型的能量、某种信号 并且将其转化为用于信息传送的示数的换能器。本说明书和权利要求书使用的术语“间隔子”表示用于将其他分子连在一起以使 被连接的分子之间存在间隔的分子。本说明书和权利要求书使用的术语“表面”应从广义上理解。在本发明中可以使 用表面支撑装置，结构体可以束缚在该装置上。本说明书和权利要求书使用的术语“表面等离子体共振传感器”表示利用光对表 面等离子体的激发的传感器。本说明书和权利要求书使用的术语“束缚”表示物质以一种约束(confine)但并 不一定限制(restrict)该物质的运动的方式附着在表面上或为表面俘获。发明说明根据第一方面，本发明提供了一种用于研究试剂跨膜运输的方法，该方法包括以 下步骤a)提供至少一个表面，在所述表面上束缚有双层结构，所述双层结构包括检测体 积，b)所述双层与待分析的至少一种试剂接触，以及c)检测由所述试剂的跨膜运输引起的所述检测体积中的折射率的变化。所述双层结构与溶剂接触。在一个实施例中，所述溶剂为水。所述双层结构包括 至少一个膜。在一个实施例中，至少一种膜蛋白与所述双层结构结合。如果希望研究由膜蛋白 介导的跨膜运输，则在一个实施例中所述膜蛋白嵌于所述双层膜中。关于跨膜运输还可以 研究其他分子的运输。例子包括但不限于分子跨膜的被动扩散和由例如离子载体和渗透促 进剂促进的运输。渗透促进剂是一种被添加至含有分析物的溶液中并影响跨膜运输的分子。在一个实施例中，至少一个选自由膜蛋白和离子载体组成的组的实体(entity) 与所述双层结构结合。所述表面包含检测折射率的检测体积。束缚于所述表面的所述双层结构全部或部 分地在所述检测体积内。在一个实施例中，所述检测体积由所述表面和距离所述表面250nm 并平行于所述表面的平面限定。在一个实施例中，所述检测体积的灵敏度随距所述表面之间的距离呈指数下降。 在一个实施例中，所述检测体积限定在检测灵敏度大于在所述表面处的最大灵敏度的
的体积。因此，对于所述检测体积的灵敏度随距所述表面之间的距离呈指数下降的实施例， 也可以计算检测体积。检测体积的灵敏度随距所述表面之间的距离呈指数下降的实施例的 例子包括但不限于含有表面等离子体共振传感器的实施例。所述双层结构使分析物由于所述双层不能扩散或自由运动跨过所述双层结构。但 是，所述分析物仍然可以穿过膜。在一个实施例中，所述双层结构包括至少部分被所述双层包围的体积。在一个实施例中将待研究的分析物添加至与双层结构接触的溶剂中。根据所述分 析物的特性，其可能转移得很缓慢或几乎完全不能跨过所述双层膜。对于一些分析物而言， 所述分析物可以以更快的速率转移跨过所述双层膜。分析物的跨膜运输取决于所述分析物 的性能和所述双层中的分子。在一个实施例中，在所述双层结构上结合着至少一个待研究的分子。这种分子的 例子包括但不限于离子载体、整合跨膜蛋白、通过疏水补丁与所述双层的一侧结合的蛋白 质、通过共价结合的烃基链疏水性结合的主要为亲水性的蛋白质、具有能够吸引脂质链的 疏水袋的主要为亲水性的蛋白质和静电结合的亲水性蛋白质。本发明提供了研究分子促进的跨双层膜运输的可能性。通过测量折射率来测定分 析物跨双层膜的运输。分析物的例子包括但不限于阳离子、阴离子、药物分子、有机分子、无机分子、受体 配体、蔗糖、DNA、RNA、肽和蛋白质。在一个实施例中，将分析物添加至与双层结构接触的溶剂中并遍布双层结构中的 双层的一侧上的体积中。以一定浓度溶解于溶剂中的所述分析物具有一个折射率。在双层 结构中的双层的另一侧上的体积中，分析物的浓度可能是不同的，因而该体积内的折射率 不同。通过测量折射率，可以监控跨膜运输。基于表面的技术的优点包括它们可以更好地结合微流体装置、它们可以全部自动 化并且测量需要的试样体积较小。在一个实施例中，传感器采用测量非常接近表面处的折射率的变化的技术。在一 个实施例中，传感器具有测量离表面0-250nm的距离内的折射率的变化的能力。在一个实施例中，所述方法包括使用选自由表面等离子体共振传感器、椭圆偏振 光谱传感器和光学波导激光光谱传感器组成的组的传感器测量折射率的变化。在一个实施例中，所述双层结构包括至少一个脂质体。在另一个实施例中，所述双 层结构包括至少一层脂质体。在又另一个实施例中，所述双层结构为一层被束缚的脂质体。 在另一个实施例中，所述双层结构包括至少两层脂质体。在又另一个实施例中，所述双层结构为束缚于表面的大量脂质体。在一个实施例中，所述脂质体通过间隔子分子被束缚于表面上。在一个存在多层 脂质体的实施例中，存在至少一个间隔子将一层中的脂质体束缚至相邻层中的脂质体上。在一个实施例中，所述方法包括测量由双层结构包围的体积中的折射率。在一个实施例中，所述方法包括测量被束缚于所述表面的脂质体包围的体积中的 折射率。在一个实施例中，所述方法包括测量被至少一个束缚于所述表面的脂质体包围的 体积中的折射率。在一个实施例中，所述双层结构包围所述检测体积的第一体积，其中没有被双层 结构包围但是在所述检测体积内的体积为第二体积，并且其中为了测量所述第一体积的折 射率，优化所述第一和第二体积之间的比值。当希望测量所述第一体积的折射率时，相比于 所述第二体积，所述第一体积应当尽可能大。大的第一体积将产生较高的灵敏度。所述第 一体积和所述第二体积之间的合适的比值的例子包括但不限于0. 001,0. 01,0. 1、1和10。 本发明也包括较高的比值例如20、50、100、500和1000。总之，本发明研究细胞膜渗透的方法有利地允许直接测量不带电荷和带电荷的溶 质跨过生物膜的转移速率。所述方法以分析由依赖于渗透的脂质体内部溶质浓度的变化引 起的折射率随时间的变化为基础，所述脂质体被约束于伴随着例如表面等离子体共振活性 传感器表面的瞬逝场。在本发明的第二方面中，提供了一种装置，该装置包括a)至少一个表面，b)至少一个束缚于所述表面的双层结构，以及c)至少一个能够检测出检测体积中的折射率的变化的传感器，其中所述双层结构 包围所述检测体积的第一体积，其中没有被所述双层结构包围但在所述检测体积内的体积 为第二体积，并且其中所述第一体积和第二体积之间的比值为约0.001以上。在可选的实施例中，所述第一体积和所述第二体积之间的比值为约0.001以上， 优选约0.01以上，更优选约0. 1以上，甚至更优选约1以上，并且最优选约10以上。高的 比值是有利的，因为它使得所述第一体积中的折射率测量具有更好的灵敏度。本发明的一 个优点是通过提供高的比值可以提高灵敏度和准确性。在一个实施例中，所述双层结构包括至少一个束缚于所述表面的脂质体。在另一 个实施例中，所述双层结构包括大量束缚于所述表面的脂质体。在一个实施例中，至少一个脂质体通过至少一个间隔子束缚于所述表面。间隔子 的例子包括但不限于聚合物、核酸、DNA、His-tag、附着于与表面共价结合的亲和素上的生 物素化的脂质和疏水改性的葡聚糖。还可以使用上述提到的间隔子的任意组合。在一个实施例中，至少一个间隔子为聚合物。在另一个实施例中，至少一个间隔子 为His-tag。在又一个实施例中，同时存在聚合物间隔子和His-tag间隔子。在一个实施例中，所述双层结构和所述表面之间的距离小于约250nm。在一个实施例中，测量所述检测体积中的折射率的传感器选自由表面等离子体共 振传感器、椭圆偏振光谱传感器和光学波导激光光谱传感器组成的组。在一个实施例中，所述传感器利用表面等离子体共振现象。


图1示出了将中性亲和素/生物素DNA (N/B)、0. IM蔗糖(Si)、2mg/ml胆固醇DNA 标签的POPC-脂质体(POPC)、0. IM蔗糖(52)、401^蜂毒素、0. IM蔗糖(S3) ,0. IM蔗糖 (S4)、0. IM蔗糖(S5)依次添加至PEG/PEG-生物素功能化的Biacore 传感器。图2示出了来自五次蔗糖添加(S1-S5)的响应(RU)。插图示出了图2的局部放大 图。图3示出了作为时间的函数的脂质体的蔗糖摄取量，这通过从添加S3-S5时RU的 变化中减去在将蔗糖添加至封闭的脂质体时(S2)RU的变化获得。图4a和图4b示出了脂质体对于丙三醇、脲、羟基脲的渗透率。图5a和图5b示出了在不同的温度下丙三醇的释放和运输速率。图6a至图6c示出了当置于环糊精中时含有胆固醇的脂质体的性质。图7示出了碘离子和氯离子的膜运输。
具体实施例方式实施例1.蜂毒素及其对膜运输的影响的研究材料和方法1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油_3_胆碱磷酸(POPC)购买自阿凡提极性脂质公 司 (Avanti Polar Lipids )。PEG-聚合物(3kDa)、HS-PEG-NHC0-CH2-CH2-0H(HS_PEG)、 HS-PEG-NHCO-CH2CH2-生物素(HS-PEG-生物素)购买自拉普聚合物 有限公司 (Rapp Polymere GmbH)。传感器芯片购买自ge医疗集团 (ge Healthcare )。膜蛋白 分析试剂盒来自LayerLab 。HEPES-2 为 IOmM HEPESU50mM NaCl、pH 为 7. 4。脂质体的制备通过首先使用氮气流从POPC脂质中蒸发出溶剂三氯甲烷制得脂质体。使干燥的 脂质在氮气流中保持至少一个小时，然后加入HEPES-2以生成浓度为4mg/ml的P0PC。溶解 的POPC脂质经涡旋振荡至少30分钟以生成多层脂质体。使用微型挤出机和孔尺寸为50nm 的阿凡提极性脂质公司⑧的聚碳酸酯膜制备单层脂质体。脂质体的半径呈高斯尺寸分布，平 均半径为36nm。所述脂质体在使用前存储在4°C的氮气中(2天内)。生物传感器表面的功能化将溶于HEPES-2 中的 HS-PEG (200 μ g/ml)和 HS-PEG-生物素(20 μ g/ml)的混合 物(300μ 1)以5μ 1/min的流速注射并覆盖在Bia<X)re Au传感器芯片上。然后注入中性 亲和素(40 μ g/ml)和生物素-DNA (0.7 μ Μ)的混合物(150 μ 1)并使其与在所述表面处的 HS-PEG-生物素结合。脂质体的束缚以5 μ 1/min的流速注入含有胆固醇-DNA标签(每个脂质体含有3个DNA标签) 的POPC脂质体(2mg/ml，在HEPES-2中)。胆固醇-DNA标签的DNA部分的末端为单链的并 且与在所述表面处的生物素-DNA序列互补，使得所述脂质体能够束缚于所述传感器表面。与所述脂质体结合的蜂毒素
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在POPC脂质体的束缚完成后，直接在Biae()re 仪器中测量蜂毒素的可逆结合。 依次注入在HEPES-2中浓度为0. 5-40 μ M的蜂毒素溶液。在注射过程中，所述蜂毒素分子 与脂质体结合，并且在所述注射停止后，运行缓冲液(HEPES-2)流过并覆盖该表面并且蜂 毒素游离出来。在所述游离完成后，注入新的不同浓度的蜂毒素溶液。蜂毒素造成的脂质体的破裂在束缚所述pope脂质体后，直接在Biaeore 仪器中测量蜂毒素造成的脂质体的 破裂。注入溶于HEPES-2中的浓度为360yM(lmg/ml)的蜂毒素，并监控当脂质体破裂时所 述响应(RU)的下降。蜂毒素介导的蔗糖的摄取在束缚中性亲和素/生物素-DNA后，依次进行以下注射0. IM蔗糖、2mg/ml胆固 醇-DNA标签的POPC-脂质体、0. IM蔗糖、40 μ M蜂毒素、0. IM蔗糖、0. IM蔗糖、0. IM蔗糖。 所有试样都溶于HEPES-2中。结果脂质体的束缚存在脂质体与生物传感器表面的结合。通过使用EDC/NHS将表面的羧基激活 以进行酰胺结合。然后，加入PLL-PEG/PLL-PEG-生物素(5 1)、中性亲和素/生物 素-DNA(1 1)和胆固醇DNA标签的POPC脂质体。所述双层结构包围所述检测体积的第一体积，而没有被所述双层结构包围但是在 所述检测体积内的体积为第二体积。在这个具体的例子中所述第一和第二体积之间的比值 约为0. 1。蜂毒素的结合和孔的形成在Biaeore 仪器中将不同浓度的蜂毒素溶液(ο. 50-40 μ Μ)以5 μ 1/min注 射并覆盖到被结合的脂质体上。将作为时间函数的响应(Ru)的变化拟合为RU = RVRU1* (1-exp ("t/ τ ) +RU2* (l_exp (_t/ τ 2))。但是，在注射 0. 5 μ M 蜂毒素的过程中 RU 的变化可以仅用一个指数表示(即RU2 = 0)。已知高浓度的蜂毒素可以使细胞和脂质体破 裂。蜂毒素的非特异性结合(即与不含脂质体的生物传感器表面的结合)少，小于蜂毒素与 脂质体膜表面结合的5% (数据未示出)。将实测的速率常数Ic1Gi1 = 1/ τ J和响应(RU1) 作为在本体溶液中的蜂毒素浓度函数来研究。脂质体膜表面上蜂毒素的微观吸 附速率(microscopic on-rate) (k+1)和解离速率(off-rate) (Ie1)通过将数据拟合为Ii1 = [Μθ1]β^+1+^来获得，其中得到= 0. 032s"1且k+1 = 3684Μ_ν。幅值RU1也通过微观速 率常数确定，RU1 = RUmax* (k+1/(、+、))。当采用 = 0. 032、且 k+1 = 3684M-1s"1 (通过 将h拟合成[Mel]B的函数得到的)时，RU1作为[Mel]B的函数拟合良好。来自脂质体的结合的响应(RU)与来自蜂毒素的结合的响应的比较提供了与 每个脂质体结合的蜂毒素分子的数量。已知α-螺旋蜂毒素分子以平行的方向与膜结 合，并且蜂毒素分子占据的脂质体膜的面积为大约210人2。脂质体外膜的表面积为大约 1.63*106 A2 (脂质体半径 360人)。因此对于每个[Mei]B可以计算在脂质体外膜处的 蜂毒素的浓度([Mel]aM.)以及蜂毒素分子所覆盖的脂质体表面的分率(FaM.)。在蜂毒素浓度为2、4、8和40 μ M的本体溶液中，蜂毒素与脂质体的结合是双阶段的。已知在膜表面处的蜂毒素达到阈值浓度时诱发孔的形成。如果形成了孔，则本体溶液 中脂质体外部的蜂毒素分子应该能够跨过脂质体膜并且与脂质体的内膜表面结合。因此 认为较慢的动力学阶段代表蜂毒素与内膜结合。发现实测到的速率常数k2线性地依赖于 [Mel]B，这表示通过所述孔转移蜂毒素不是限速步骤(不依赖于[Mel]B)。线性拟合得到k+2 =56M-V1 且 k_2 = 0. 0046s—1。表观扩散系数 k+2 (δθΜ"^"1)的值相比于 k+1 (36841^8^)较 低，可以解释为蜂毒素分子找到脂质体的孔的可能性比找到作为一个整体的脂质体表面的 可能性更低。孔数/脂质体呈高斯分布，并且在低[Mel]aM.下，[Mel]B的上升增加了含有 一个孔的脂质体的数量。因此，在低[Mel]B下，所述响应(RU2)将不仅依赖于[Mel]B，还依 赖于不含任何孔的脂质体的分率。在高[Mel]BT，所有脂质体含有至少一个孔，在此情况 下蜂毒素在内膜处的表面覆盖率应等于其在外膜处的表面覆盖率，并且RU2应接近于RU2max =冊1*(面积#/面积一。因此，上述结果表示较慢的动力学阶段描述了蜂毒素与内膜的结 合。进一步的证明来自于观测到当4、8和40 μ M的注射停止后，RU没有回到初始值(注射 前)，这可以解释为，当由于蜂毒素自膜表面分离而导致孔消失时蜂毒素分子被困在了脂质 体内部。由蜂毒素孔介导的蔗糖摄取在研究例如膜运输体时，一种用于在生物传感器表面对跨膜分析物进行实时和不 含标签的摄取测量的简单方法很有价值。这里我们想测试是否可以通过简单地检测当分析 物蔗糖被摄取时引起的脂质体内部溶液的折射率的变化来测量所述分析物穿过蜂毒素孔 的摄取。图1示出了将中性亲和素/生物素DNA (N/B)、0. IM蔗糖(Si)、2mg/ml胆固醇DNA 标签的POPC-脂质体(POPC)、0. IM蔗糖(52)、401^蜂毒素、0. IM蔗糖(S3) ,0. IM蔗糖 (S4)、0. IM蔗糖(S5)依次添加至PEG/PEG-生物素功能化的表面。图2示出了来自五次蔗糖添加(S1-S5)的响应(RU)。添加蔗糖改变检测体积(即 对应于传感器表面上方瞬逝场的体积)中的溶液的折射率，这表现为RU的改变。添加S2 时比添加Sl时RU的上升更小对应于由表面结合的脂质体引起的瞬逝场可进入的体积减 小。蜂毒素的加入在脂质体膜中产生孔从而形成被添加的蔗糖分子可进入的脂质体的内部 体积。当停止添加蜂毒素时，蜂毒素从膜表面游离出来，并且含有蜂毒素孔的脂质体的数量 随时间减少。图2示出了当孔数/脂质体减少时添加蔗糖(S3-S5)时的RU的变化。图3示出了作为时间函数的脂质体中的蔗糖摄取，这通过从添加S3-S5时RU的变 化中减去将蔗糖添加至封闭的脂质体(S2)时RU的变化获得。从S3至S5所述摄取的幅值 降低，这可以解释为含有孔的脂质体的数量减少。从S3至S5所述速率也降低，这可以解释 为每个脂质体的孔数减少。从图3中的曲线可知，可以估计用于蔗糖摄取量的衰减时间并 且T3 20sec。如果摄取后的脂质体内的蔗糖的浓度等于[蔗糖]3 = 0.1M，然后 7400 个蔗糖分子在 20秒内跨过膜。表2示出了在[Mel]B = 40 μ M时RU2/RU2max为0. 85，这与含 有多于一个孔/脂质体的脂质体的数量相符。响应的幅值与可以来自用0. IM蔗糖(分子量 (Mw)为0. 34kDa)填满脂质体的期望值吻合良好。可以通过固定脂质体自身获得的响应(RU =6790)计算脂质体内的7400个蔗糖分子(0. 1M)的期望RU。所述脂质体的虬为35800kDa， 这提供了 0. 19RU/kDa。7400 个蔗糖分子的 Mw 为 7400*0. 342kDa = 2531kDa，这使得 RU = 2531*0. 19 = 480。由于仅 85%的脂质体含有孔，那么期望值为480/0. 85 ^ 560RU，这与
11测量到的来自S3注射的响应530RU吻合良好。实施例2軒诵过石开劍_军麵二酉享、_____絲_割牛_〒5 尺 的方法通过研究非电解质丙三醇、脲和羟基脲这些全部与生物相关的分子来评估基于 SI^R的方法的效率及其与多渗透事件的筛选的相容性。例如，跨储存脂肪分子的脂肪细胞膜 运输丙三醇的效率已经被认为是肥胖症和II型糖尿病的发展过程中的重要因素[17]。另 一方面，脲是新陈代谢过程中产生的废物并且从肝细胞中运出并经由尿释放到体外，而羟 基脲是一种已广泛用于癌症化疗[18]以及HIV-病毒感染治疗[19]的药物。已经证明该 方法能够应用于原位变化以及通过监控当环糊精诱发的脂质体的胆固醇含量逐渐减少时 丙三醇渗透的增加同时监控脂质体的渗透率。还示出了探测离子运输的方法的相容性。首先根据实施例1提供70nm的脂质体。图4a示出了 70nm的脂质体的结合，然后 重复注射不同浓度的丙三醇、脲、羟基脲的冲量(pulse)(参见插图)。图4b示出了清洗步 骤之一的放大，通过该步骤从脂质体内部释放出溶质(丙三醇)。在图4b (虚线表示的曲 线)中还示出了不含固定的脂质体的完全相同的清洗步骤，显示了流体交换的时间常数比 IOOms更快，足以在时间上分析这些运输测量。在8至22°C的温度区间内测量丙三醇的释 放速率。结果示于图5a中。与期望一致，跨脂质膜的运输速率随温度的上升而增大，并且 阿累尼乌斯图(Arrhenius plots)显示ln(l/)和(1/T)之间具有线性相关性，所产生的被 研究的三种溶质(丙三醇、脲和羟基脲)的活化能与文献数据吻合良好，参见图5b。在图4和5中所示的结果表示所述方法可用于通过溶质的释放而不是摄取来准确 地确定脂质膜的渗透系数。注意所有的这些数据都来自于使用相同的一组固定的脂质体的 单一实验。不同实验之间的再现性优于2%。根据实施例1获得了含有40%的胆固醇的70nm的脂质体。图6a中示出了所述脂 质体的结合，之后重复注射环糊精，所述环糊精从脂质体的脂质双层中除去胆固醇。SPR响 应与界面折射率是成比例的，这使得可以量化除去的胆固醇。在注射七次环糊精后，胆固醇 的含量降低至14%。每次注射环糊精(图6a)后注射丙三醇的冲量，这使得可以量化相对于胆固醇含 量的丙三醇运输的时间常数，所述时间常数的范围从40%胆固醇的7s到14%胆固醇的ls， 参见图6b。注意可检测当胆固醇含量发生那么小的变化时的运输速率的差异。图6c示出了渗透率的变化(由溶质的转移速率和囊面积估计)和响应的幅值(与 内部体积是成比例的)。与期望一致，所述渗透率相对于胆固醇含量线性降低，而内在化 (internalized)的体积非线性增加。后一观测数据反映在胆固醇含量约25%时所述膜的 结构变化。通过图3a至3c所示的测量，证实所述方法使得能够根据渗透率量化溶质转移，这 可以同时与膜特性的结构变化相关联。这类信息在关于例如药物如何影响细胞膜的渗透率 的研究中具有高度的相关性。不带电荷的溶质的被动转移和膜蛋白介导的转移都具有高度 的生物学和药物学相关性。但是，对于像这种普遍适用于任意类型的膜转移反应的方法，也 应该可以测量离子转运(translocation)，这在当今通常采用基于膜片钳的分析方法。图7 示出了碘离子( IOs)和氯离子( 200s)的膜运输，与文献数据吻合得非常好。注意脂质体中并入了短杆菌肽以保证反离子(K+)的共运输，从而防止静电跨膜电势的建立，如果 建立了静电跨膜电势，则会限制无阻碍的阴离子运输。图7中所示的结果证实了所述方法 也适用于带电溶质的时间解析的膜转运反应。这一工作自然延伸到对分子和离子通道控制 的运输的研究，并且在药物筛选的过程中具有高相关性。如对于丙三醇、脲和羟基脲所描述的那样，根据本发明的方法实现了在单一测量 中对多渗透事件的筛选，并且允许待量化的渗透率发生原位变化，这以从脂质双层中连续 除去胆固醇为例。一种可选的探测非电解质转移的方法依赖于间接测量悬浮的脂质体的渗 透诱发的尺寸变化，相比于上述方法，本发明方法提高了灵敏度并且降低了所需的试样量 的数量级。在图4至7中所示的结果中，示出了可以根据当溶质释放而不是摄取时的脂质体 内在化的体积的折射率变化确定跨固定在电磁瞬逝场中的脂质体的脂质双层膜的溶质运 输(图4)。还示出了所述膜特性可以原位变化，并且与渗透率的变化相关联(图5)。在图 6中，我们证明了根据当溶质释放(或摄取)时的脂质体内在化的体积的折射率变化不仅可 以测量不带电荷的溶质还可以测量离子的运输。总之，本发明肯定了利用这种传感原理以IOOms的时间分辨率直接测量非电解质 溶质的分子跨膜运输的可能性。所述方法实现了对溶质跨脂质双层转移的直接的而非间接 的(参考DLS和荧光猝灭方法)测量，而这到目前为止仅能够通过使用膜片钳[14]或基于 芯片的替代物[15]用于带电荷的分子，在此意义上本方法是独一无二的。相比于间接的方 法，本发明还具有基于表面的方法的所有其他优点，例如快速依次(或平行)筛选多种溶质 以及由效应分子的添加引起的脂质体渗透率的原位扰动。对于受分析的脂质体的尺寸也没 有特别限定，但是基于DLS的方法仅适用于比较大的脂质体，因为直径小于约SOnm的脂质 体是基本不可压缩的(< ) [16]。尽管本发明中已经描述了包括发明人目前所知道的最佳方式在内的优选实施例， 但是可以理解的是，可以进行对于本领域普通技术人员而言显而易见的不同的变化和修改 而不偏离本发明在权利要求书中所要求保护的范围。参考文献1、E.奥弗顿(E. Overton)，苏黎世自然科学协会的季刊(Vierteljahrsschrift der Naturforschenden Gesellschaft in Ziirich)40，159(1895)。2、Η·达沃森，丹尼利 J. F. (H. Davson，Danielli J. F.)，天然膜的渗透率，(The Permeability of Natural Memranes)(剑桥大学出版社(Cambridge University Press), 英国剑桥，1943)。3、P.米勒，D.O.鲁丁，H.T.蒂恩(P. Mueller, D. 0. Rudin, H. Τ. Tien)等，自然 (Nature)194,979(1962)。4、A. D.班厄姆(A. D. Bangham)，生物物理和分子生物学的进展(Prog Biophys Mol Biol)18,29(1968)。5、Β·Ε·立昂和 A.D.班厄姆(B.E.Cohen and A. D. Bangham)，自然 (Nature)236(5343)，173(1972)。6、Α· S.维克曼(Α. S. Verkman)，膜生物学杂志(J Membr Biol) 148 (2)，99 (1995)。7、D. G.莱维特和 H. J.穆勒克德(D. G. Levitt and H. J. Mlekoday)，基因物理学杂志(J Gen Physiol)81(2),239 (1983)O8、P. Y.陈和 A. S.维克曼(P. Y. Chen and Α. S. Verkman)，欧洲生理学杂志 (Pflugers Arch)408(5)，491(1987)。9、Ρ·Υ·陈，D.皮尔斯和 Α. S.维克曼(P. Y. Chen，D. Pearce and A. S. Verkman)，生 物化学(Biochemistry) 27 (15)，5713 (1988)。10,U.约翰逊，L.法格斯坦，B.伊瓦尔松(U. Jonsson，L.Fagerstam，B. Ivarsson) 等，生物技术(Biotechniques) 11(5), 620 (1991)。11、L. S.荣格，C. T.坎贝尔，Τ. M.契诺沃斯基(L. S. Jung, C. Τ. Campbell, Τ. Μ. Chinowsky)等，朗谬尔(Langmuir) 14 (19)，5636 (1998)。12、B.利德贝里，I.伦德斯特伦和 Ε.斯腾贝里(B. Liedberg, I. lundstrom, and Ε. Stenberg)，传感器和促动器 B-化学(Sensors andActuators B-Chemical) 11 (1-3)， 63(1993)。13、Μ.布兰登，S.达林和 F.虎克(M. Branden, S. Dahlin and F. Hook)，化学物理 化学(Chemphyschem) 9 (17)，2480 (2008)。14、E.内尔和 B.萨克曼(E. Neher and B. Sakman)，自然(Nature) 260 (5554)， 799(1976)。15、A.杰斯霍夫和C.斯泰纳姆(A. Janshoff and C. Steinem)，分析化学和生物分 析化学(Analytical and Bioanalytical Chemistry) 385 (3)，433 (2006)。16, S. Τ.孙，Α.米隆，Τ.田中(S. Τ. Sun, A. MiIon, Τ. Tanaka)等，生物化学与生物 物理学报(Biochimica Et Biophysica Acta) 860 (3)，525 (1986)。17、Ε. M.温特尔和 B. A.亨利(E. M. Wintour and B. A. Henry)，内分泌学和新陈代 谢趋势(Trends Endocrinol Metab) 17 (3)，77 (2006)。18,C.福泽尔(C. Fausel)，美国健康系统药物杂志 64) (24 Suppl 15)，S9 (2007)。19、F.洛里，A.福禾lj，L. Μ.凯利(F. Loli, A. Foli, L. Μ. Kelly)等，现代药物化学 (Curr Med Chem)14(2)，233(2007)。
1权利要求
一种用于研究试剂跨膜运输的方法，所述方法包括以下步骤a、提供至少一个表面，在所述表面上束缚有双层结构，并且所述双层结构包含检测体积，b、所述双层与至少一种待分析的试剂接触，以及c、检测由所述试剂的跨膜运输引起的所述检测体积中的折射率的变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括使用至少一个选自由表面 等离子体共振传感器、椭圆偏振光谱传感器和光学波导激光光谱传感器组成的组的传感器 检测折射率的变化。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个选自由膜蛋白和离 子载体组成的组的实体与所述双层结构结合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述双层结构包括至少一个 脂质体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，至少一个脂质体通过间隔子分子束缚在 所述表面上。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述双层结构包括至少两层 脂质体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括测量由所述双 层结构包围的体积的折射率。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述双层结构包围所述检测 体积的第一体积，没有被包围在所述双层结构中但在所述检测体积内的体积为第二体积， 并且其中为了测量所述第一体积的折射率，优化所述第一和第二体积之间的比值。
9.一种装置，包括a、至少一个表面，b、至少一个束缚在所述表面上的双层结构，以及C、至少一个能够检测出检测体积中折射率的变化的传感器，其中所述双层结构包围所述检测体积的第一体积，没有被包围在所述双层结构中但在所述 检测体积内的体积为第二体积，并且其中所述第一体积和第二体积之间的比值为约0. 001 以上。
10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，至少一个选自由膜蛋白和离子载体组成 的组的实体与所述双层结构结合。
11.根据权利要求9-10中任意一项所述的装置，其特征在于，所述双层结构包括至少 一个束缚在所述表面上的脂质体。
12.根据权利要求11所述的装置，其特征在于，至少一个脂质体通过至少一个间隔子 束缚在所述表面上。
13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，至少一个间隔子选自由聚合物、核酸、 DNA、His-tag、附着在与所述表面共价结合的亲和素上的生物素化的脂质和疏水改性的葡 聚糖组成的组中的至少一种。
14.根据权利要求9-13中任意一项所述的装置，其特征在于，所述传感器具有测量距 所述表面0-250nm的距离内的折射率的变化的能力。
15.根据权利要求9-14中任意一项所述的装置，其特征在于，所述传感器选自由表面 等离子体共振传感器、椭圆偏振光谱传感器和光学波导激光光谱传感器组成的组。
16.根据权利要求9-15中任意一项所述的装置，其特征在于，所述传感器利用表面等 离子共振现象。
全文摘要
本发明提供了一种用于研究试剂跨膜运输的方法，该方法包括以下步骤a)提供至少一个具有双层结构的表面，在所述表面上束缚有所述双层结构，所述双层结构包括检测体积，b)所述双层与至少一种待分析的试剂接触，以及c)检测由所述试剂的跨膜运输引起的检测体积中的折射率的变化。进一步地，本发明提供了一种装置，所述装置包含a)至少一个表面，b)至少一个束缚在所述表面上的双层结构，和c)至少一个能够检测出检测体积中折射率的变化的传感器，其中所述双层结构包围所述检测体积的第一体积，其中没有被所述双层结构包围但是在所述检测体积内的体积为第二体积，而且所述第一体积和第二体积之间的比值为约0.001以上。
文档编号G01N33/543GK101939647SQ200980104408
公开日2011年1月5日 申请日期2009年2月6日 优先权日2008年2月8日
发明者塞耶德·塔巴义, 弗雷德里克·赫克, 芒努斯·布兰登 申请人:拉耶莱布股份公司