专利名称：检测安定的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法
技术领域：
一种检测安定(CPZ)的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析 (TRFIA)技术领域，用于对尿液、组织、饲料等样品中安定的含量检测。
背景技术：
安定又名地西泮(diazepam)，是临床常用的镇静、催眠药物。长期服用该类药物可产生依赖性或成瘾性。近几年来，有些饲料企业为了追求饲料的转化率和高额利润，在饲料中安定，安定经肝脏代谢为奥沙西泮，仍有生物活性，故连续应用可蓄积。为此国家有关部门下文将安定类明确定为禁止添加的药物之一。目前，检测安定较为常用的方法有高效液相色谱法(HPLC)，薄层扫描法(TLC)， 光化学荧光分析法(PCFA)，酶联免疫吸附法(ELISA)等。其中免疫测定法由于其特异性强， 灵敏度高，操作简便，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。TRFIA是上世纪八十年代初发展起来的新的免疫测定技术。TRFIA其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体分子上的自由氨基联接，制成Eu3+标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancement Solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的萘甲酰三氟丙酮(β-ΝΤΑ)重新形成微胶囊，在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。

发明内容
本发明的目的在于提供一种检测DIA的试剂盒及其检测方法，用于对尿液、组织、 饲料等样品中安定含量的检测。本发明中要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测 DIA0技术方案该检测DIA的试剂盒是由(1)96或48孔包被板，( 缓冲液，( 安定标准，(4)安定的抗体冻干品，( 铕标记的羊抗兔抗体，(6)洗涤液，(7)增强液所组成。本发明测定方法测定的基础是标记免疫反应。包被有DIA-OVA的微孔板，加入 DIA标准或已处理好的样品到各自的微孔中，再加入DIA抗体，振荡反应，游离的DIA与微孔板上的DIA-OVA竞争DIA抗体，洗涤液洗涤，没有连接的DIA抗体在洗涤步骤中被除去。加入EU3+-羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的EU3+-羊抗兔抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。


图1 :DIA_TRFIA反应示意图。
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图2 :DIA-TRFIA标准曲线图。图3:检测安定的试剂盒示意图。(1)96或48孔包被板，(2)缓冲液，(3)安定标准，(4)安定的抗体冻干品，( 铕标记的羊抗兔抗体，(6)洗涤液，(7)增强液。
具体实施方案实施例1按下列步骤制备试剂盒和检测尿液样品(I)Eu3+-羊抗兔抗体的制备取溶解于50mmol/LPBS pH7. 0的5g/L羊抗兔抗体l_2m，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0. 155mol/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03 pH8. 5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46Α28(Γ0.74Α26(Ι)，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L。取 500-1000 μ 1稀释后的羊抗兔抗体加入含0. 2-0. 4mg的Eu3+-N2-[ρ-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30°C磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7. 8缓冲液平衡的kpharose CL-6B柱(lX40cm)层析，A28tl监测收集蛋白峰， 稀释分装备用。(2)包被板固相抗原制备将DIA-OVA 用 50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH9. 6 缓冲液稀释至 5mg/L 的包被液， 96 (或48)孔微孔板各孔加100μ 1，4°C放置过夜。弃去包被液，冲洗两次，加150μ 1含3g/ LBSA的上述缓冲液封闭.4°C放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20°C冷冻保存。(3)试剂的配制A.标准安定(DIA) (Ong/ml，0. 05ng/ml，0. lng/ml，0. 5ng/ml，lng/ml，5ng/ml)， 从DIA纯品中稀释得到，稀释液为甲醇水=7 3。B.缓冲液8mmol/LNaCl、0. 1 % BSA、50 μ mol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0· lml/ LTween-80 禾口 0· NaN3 的 Tris-HCl ρΗ7· 8。C.洗涤液14.5mmol/L NaCl,0. 2ml/LTween-80 和 0· 2 % NaN3 的 50mmol/L Tris-HCl ρΗ7·8。D.增强液的配制1升pH3. 2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15 μ mol β -萘甲酰三氟内酮(β -ΝΤΑ)，50 μ mol 三正辛基氧化膦(Τ0Ρ0)，Iml 曲拉通 X-100 (Triton X-100)。(4)试剂盒提供的试剂每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下A. 1X96孔板(8条X 12孔，可以拆分为单孔)包被有DIA-0VA。B. 6XDIA 标准液，1. Oml/ 瓶，标准液浓度为:0ng/ml，0. 05ng/ml，0. lng/ml, 0.5ng/ml,lng/ml, 5ng/ml。C. 1 X DIA抗体冻干品，用时0. 5ml蒸馏水溶解。D. 1 X EU3+-羊抗兔抗体冻干品，用时0. 5ml蒸馏水溶解。Ε· IX 增强液15ml。F. IX洗涤液30ml，用时以蒸馏水1 25稀释。G. IX 缓冲液30ml。
(5)测定之前注意事项A.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30°C )。B.使用之后立即将所有试剂放回2_8°C。C.如果样品量大建议使用多通道移液器。D.在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。E.取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8°C。(6)具体检测步骤如下取DIA-OVA板条，加入50 μ 1的DIA标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1 20稀释的DIA抗体50μ1，37 振荡1小时，洗涤液洗四次，加缓冲液1 20稀释的Eu3+-羊抗兔抗体100 μ 1，37°C振荡45分钟，用洗涤液洗六次，加200 μ 1增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的DIA含量，见表 1和图2，该例的样品浓度为0. 07ng/ml。表 权利要求
1.一种检测安定(DIA)的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由⑴96或48孔包被板( 缓冲液( 安定标准(4)安定的抗体冻干品( 铕标记的羊抗兔抗体(6)洗涤液(7)增强液所组成。
2.一种用权利要求1所述的试剂盒安定的方法，其特征是取包被有DIA-OVA的微孔包被板，加入DIA标准或处现好的样品到各自的微孔中，再加入DIA抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加铕标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加增强液振荡后测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的DIA含量。
3.根据权利要求2所述的检测安定的方法，其操作为取包被有DIA-OVA的微孔包被板，加入50 μ 1的DIA标准或处理好的样品到各自的微孔中，加50 μ 1以缓冲液(2)稀释的 DIA抗体，25°C振荡1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液(2)稀释的100 μ 1 Eu3+_羊抗兔抗体，25°C振荡0. 5小时，用洗涤液洗六次，加200 μ 1增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps， 从标准曲线计算样品中的DIA含量。
全文摘要
一种检测安定(DIA)的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于对肉类、鱼类等动物性食品及饲料中DIA含量的检测。本发明配制的试剂盒，采用TRFIA检测DIA，测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有DIA-OVA，加入DIA标准或样品，再加入DIA抗体。游离的DIA与微孔板上的DIA-OVA竞争DIA抗体，没有连接的DIA抗体被洗涤除去，加入Eu3+-羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的Eu3+-羊抗兔抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的DIA浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中DIA的含量。本发明提供的检测DIA试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高。
文档编号G01N33/543GK102455358SQ201010528958
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者匡燕云, 岳振峰, 张建莹, 朱海, 范放, 赵凤娟, 赵芳, 黄飚 申请人:深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心