专利名称：一种检测动物肌肉组织中替米考星的前处理试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于食品安全分析技术领域，更具体涉及一种检测动物肌肉组织中替米考星(tilmicisin，TLM)的前处理试剂盒，同时还涉及一种动物肌肉组织中替米考星残留量检测的方法，本试剂盒及检测方法适用于鲜活动物(鱼、虾、猪、鸡)肌肉组织中替米考星残留量检测的样品前处理及检测。
背景技术：
替米考星(Tilmicosin)是80年代由英国Elanco动物保健品公司研发成功的，主要用于牛、奶牛、山羊、绵羊、猪、鸡、鱼等动物由敏感菌引起的感染性疾病。替米考星是一种半合成的大环内酯类抗生素，是泰乐菌素(Tylosin)的衍生物，具有同泰乐菌素相似的抗菌谱，对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌、霉形体、螺旋体等均有抑制作用。其主要通过抑制细菌的蛋白合成起到杀菌的作用。在畜禽上的研究表明，其对胸膜肺炎放线杆菌、溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌及畜禽霉形体具有比泰乐菌素更强的活性。随着人们对大环内酯类药物研究的深入，替米考星等大环内酯类药物对人类的危害也逐渐被人们所认识， 如大环内酯可产生交叉耐药性，高残留会对人类造成至敏性和毒性反应，尤其是敏感个体等。欧盟和我国均对动物性食品中替米考星残留量有严格的限止。为了保障我国人民的健康和避免由于动物性食品中替米考星残留而引起的贸易壁垒，加强对动物性食品中替米考星残留的检测是非常必要的。目前，检测动物肌肉组织中替米考星的前处理方法，提取过程复杂，消耗有机溶剂量大，净化过程多采用固相萃取小柱(SPE柱)，不仅增加了工作量，而且增加了检测的成本。在对前处理好的样品进行替米考星检测所用的流动相(液相)组分复杂，且配制过程繁琐、耗时，所用添加剂对色谱柱有较大的损害。动物肌肉组织中替米考星用传统的前处理及检测方法费时、费钱且操作过程复杂不易掌握。为提高对动物肌肉组织中替米考星残留检测的效率，节约检测成本，研制动物肌肉组织中TLM检测的前处理试剂盒及检测方法具有非常重要的经济和社会意义。目前，国内外均未见有动物肌肉组织中替米考星检测前处理试剂盒的报道。

发明内容
本发明目的是在于提供了一种检测鲜活动物肌肉组织中替米考星(tilmicisin， TLM)的样品前处理试剂盒，样品前处理所用试剂价格便宜，容易获得，且用量小，样品处理无需用固相萃取小柱进行样品净化，从而大大节约了检测成本；该试剂盒操作方便快捷，适于大量鲜活动物肌肉样品的处理，从而大大提高了样品前处理的效率；该试剂盒将所需试剂整合于一个前处理试剂盒内便于携带和储存。本发明的另一个目的是在于提供了一种经本前处理试剂盒处理后的样品中替米考星残留量的检测方法，该检测方法流动相配制简单，用量少，且所用试剂对色谱柱无损害；该检测方法所用时间短，且在较短的时间内能将替米考星的2种同分异构体(顺式异构体和反式异构体)分离，从而大大节约了检测时间和检测成本。从使用该前处理试剂盒和检测方法的效果来看，样品处理干净，在色谱图上无杂质峰干扰且能将替米考星的2种同分异构体较好分离。该方法是一种能够快速、准确、灵敏地检测利用本前处理试剂盒处理的样品的超高效液相色谱法(UPLC)。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种动物肌肉组织中替米考星检测的前处理试剂盒，本发明前处理试剂盒主要由盒体、试剂管A、试剂袋B、试剂管C、试剂瓶D、试剂瓶E、试剂袋F。盒体内分为a、b、c、d 4 个区，a和b区为适合试剂管A和试剂管C放置的孔区，c区放试剂袋B和试剂袋F的凹槽， d区放试剂瓶D和试剂瓶E的凹槽。优选的，所述的试剂管A中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试齐LU优选的，所述的试剂袋B中是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、 磷酸二氢铵、硫酸钠或硫酸镁中任一种试剂。优选的，所述试剂管C中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂。优选的，所述试剂瓶D中是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂的溶液。优选的，所述试剂瓶E中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂。优选的，所述试剂试剂袋F中是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂。试剂D的溶液的配制方法取试剂D 2_20g，溶于200mL的蒸馏水中溶解配制成浓度为-10%的试剂D的溶液。试剂F的溶液的配制方法为取试剂F 0.6_3g，溶于500mL蒸馏水中，配制成浓度为10mM-50mM的试剂F的溶液。优选的液体试剂E和试剂F的溶液的体积比E F=I 9-1 1。一种动物肌肉组织中替米考星检测前处理试剂盒的使用方法，其步骤是A、取动物肌肉组织2. Og于50mL塑料离心管中，加入试剂A 5_10mL，振荡30s ；所述试剂A可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂。B、再加入试剂试剂B 2-10g，振荡30s，5000r/min离心5min，将上清液转移至鸡心瓶中，45°C旋转蒸发至干；所述试剂B可以是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、硫酸钠或硫酸镁中任一种试剂。C、向鸡心瓶中加入试剂C 2-10mL，将其转移至15mL离心管中；所述试剂C可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂。D、再向其中加入试剂溶液D l_5mL，振荡30s，5000r/min离心5min，将上层液体取出置于15mL离心管中，置45°C氮吹仪吹至干；所述试剂溶液D可以是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂的溶液。E、剩余物用ImL液体试剂E和试剂F的溶液的混合溶液溶解，再加入^iiL正己烷， 漩涡振荡30s，5000r/min离心5min，去除上层液正己烷层，下层液体经0. 22 μ m滤头过滤，UPLC测定。所述的试剂E可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂； 所述的试剂F可以是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂。结果表明经本试剂盒处理后的样品经本检测方法检测，色谱基线平稳，在目标物附近无杂质峰干扰，并能将替米考星的2种同分异构体分开。发明提供了一种动物肌肉组织中替米考星前处理方法，该方法包括可以提取动物肌肉组织中替米考星的液体试剂A，用于动物肌肉组织样品净化的试剂B，用于溶解浓缩样品残渣的液体试剂C，用于净化溶解残渣样品的试剂溶液D，用于溶解经净化处理的样品浓缩物的液体试剂E和试剂F的溶液的混合物。一种用于检测经本前处理试剂盒处理的动物肌肉组织样品的方法，本检测方法包括流动相组成液体试剂E和试剂F的溶液；色谱条件及梯度洗脱程序。优选的液体试剂E是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂。优选的，所述试剂F是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂。试剂F的溶液的配制方法为试剂F 0.6_3g，溶于 500mL蒸馏水中，配制成浓度为10mM-50mM的试剂F的溶液。优选的液体试剂E和试剂F的溶液的体积比E F = 1 9-1 1。优化的色谱条件及梯度洗脱程序是色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1 X 100mm, 1. 7 μ m)反相色谱柱；柱温:30-40 °C ；流速 0. 1-0. 4mL/min ；进样量 2. 0-7. OyL0梯度洗脱条件:A相为液体试剂E，B相为试剂F的溶液，0 1. 5min, 10% E ； 1. 5 6min，10 % E 30 % E，6_8min 30%E 10%E，8 12min，10 % E，检测波长 287nm。本发明还提供了一种测定动物性食品肌肉组织的超高效液相色谱法，该方法包括流动相组成E和F ；梯度洗脱程序等。优选的，所述的液体试剂E是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试齐LU优选的，所述的试剂F的溶液是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂的溶液。试剂F的溶液的配制方法为取一定量的试剂F，溶于适量的蒸馏水中，配制成浓度为10mM-50mM的试剂F的溶液，液体试剂 E和试剂F的溶液；两者的体积比E F=I 9-1 1。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果(1)操作过程简单、快速、所用试剂量少。(2)无需用固相萃取小柱进行样品净化，节约检测成本，节约样品前处理时间。(3)优选的试剂处理鲜活动物肌肉组织效果好，价格低廉。(4)流动相配制简单，所用试剂对色谱柱无损害。(5)检测方法消耗试剂少，分析时间短，目标物附件无干扰峰，且能将替米考星2 种同分异构体分离开。


图1前处理试剂盒的直观示意图其中盒体1、A试剂管A2、B试剂袋B3、C试剂管C4、D试剂瓶D5、试剂瓶Eedl1^lJ 袋F7。试剂盒可常温(15-35°C )储存，有效期6个月。
图2为一种经本试剂盒处理后的样品，经本检测方法检测后得出的动物肌肉组织样品中中替米考星的色谱图。 经本试剂盒处理后的样品，经本检测方法检测后得出的动物肌肉组织样品中中替米考星的色谱图，基线平稳，目标物附近无干扰峰，2种替米考星同分异构体能较好分离。
具体实施例方式实施例1 下面结合附图对本发明做进一步说明。一种动物肌肉组织中替米考星检测的前处理试剂盒，本发明前处理试剂盒主要由盒体1、试剂管A2、试剂袋B3、试剂管C4、试剂瓶D5、试剂瓶E6、试剂袋F7。盒体内分为a、 b、c、d 4个区，a和b区为适合试剂管A2和试剂管C4放置的孔区，c区放试剂袋B3和试剂袋F7的凹槽，d区放试剂瓶D5和试剂瓶E6的凹槽。优选的，所述的试剂管A2中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂。所述试剂A可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂，加入试剂A的量为5-10mL。优选的，所述的试剂袋B3中是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、 磷酸二氢铵、硫酸钠或硫酸镁中任一种试剂。所述试剂B可以是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、 磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、硫酸钠或硫酸镁中任一种试剂，加入试剂B的量为 2-10g。优选的，所述试剂管C4中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂。所述试剂C可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂，加入试剂 C2-10mL。优选的，所述试剂瓶D5中是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂的溶液。试剂D的溶液的配制方法取试剂D 2_20g，溶于200mL的蒸馏水中溶解配制成浓度为-10%的试剂D的溶液。优选的，所述试剂瓶E6中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试齐LU优选的，所述试剂袋F7中是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、 磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂。试剂F的溶液的配制方法为取试剂F 0. 6-3g，溶于500mL蒸馏水中，配制成浓度为10mM-50mM的试剂F的溶液，液体试剂E和试剂F的溶液两者的体积比E F=I 9-1 1。实施例2:一种动物肌肉组织中替米考星检测的前处理试剂盒的样品处理方法，其步骤是A、取动物肌肉组织2. Og于50mL塑料离心管中，加入试剂A 5_10mL，振荡30s ；所述试剂A可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂。B、再加入试剂B 2-10g，振荡30s，5000r/min离心5min，将上清液转移至鸡心瓶中，45°C旋转蒸发至干；所述试剂B可以是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、硫酸钠或硫酸镁中任一种试剂。C、向鸡心瓶中加入试剂C 2-10mL，将其转移至15mL离心管中；所述试剂C可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂。D、再向其中加入试剂D溶液l-5mL，振荡30s，5000r/min离心5min，将上层液体取出置于15mL离心管中，置45°C氮吹仪吹至干；所述试剂D溶液可以是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂的溶液。E、剩余物用ImL液体试剂E和试剂F的溶液的混合溶液溶解，再2mL正己烷，漩涡振荡30s，5000r/min离心5min，去除上层液正己烷层，下层液体经0. 22 μ m滤头过滤，UPLC 测定。所述试剂E可以是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂；所述试剂F的溶液可以是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂的溶液。结果表明，经本试剂盒处理后的样品经本检测方法检测， 色谱基线平稳，在目标物附近无杂质峰干扰，并能将替米考星的2种同分异构体分开。一种用于检测经本前处理试剂盒处理的动物肌肉组织样品的方法，本检测方法包括流动相组成E和F ；色谱条件及梯度洗脱程序。优选的试剂E是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂。优选的，所述试剂试剂F是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂溶液，试剂F的溶液的配制方法为取试剂F 0. 6-3g，溶于500mL蒸馏水中，配制成浓度为10mM-50mM的试剂F的溶液。优化的色谱条件及梯度洗脱程序是色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1 X 100mm, 1. 7 μ m)反相色谱柱；柱温:30-40 °C ；流速 0. 1-0. 4mL/min ；进样量 2. 0-7. 0 μ L0 梯度洗脱条件Α 相为 Ε，Β 相为 F，0 1. 5min,10% E ；1. 5 6min，10% E 30% E，6-8min 30% E 10% E，8 12min，10% E，检测波长 287nm。
权利要求
1.一种动物肌肉组织中替米考星检测的前处理试剂盒，试剂盒由盒体、试剂管A、试剂袋B、试剂管C、试剂瓶D、试剂瓶E、试剂袋F组成，其特征在于盒体内分为a、b、c、d 4个区，a和b区为试剂管A和试剂管C放置的孔区，c区放试剂袋B和试剂袋F的凹槽，d区放试剂瓶D和试剂瓶E的凹槽；所述的试剂管A中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂；所述的试剂袋B中是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、 硫酸钠或硫酸镁中任一种试剂；所述的试剂管C中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂；所述的试剂瓶D中是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、 硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂的溶液；所述的试剂瓶E中是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂；所述的试剂试剂袋F中是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂。
2.根据权利要求1所述一种动物肌肉组织中替米考星检测的前处理试剂盒，其特征在于所述的试剂瓶D中的试剂溶液D的配制方法取试剂D 2-20 g，溶于200 mL的蒸馏水中溶解配制成浓度为1%_10%的试剂D的溶液。
3.根据权利要求1所述一种动物肌肉组织中替米考星检测的前处理试剂盒，其特征在于所述的试剂F的溶液的配制方法为取试剂F 0.6-3 g，溶于500 mL的蒸馏水中， 配制成浓度为10 mM-50mM的试剂F的溶液，液体试剂E和试剂F的溶液，两者的体积比 E:F=1:9-1:1。
4.权利要求1所述的一种动物肌肉组织中替米考星检测前处理试剂盒的方法，其步骤是A、取动物肌肉组织2.0g于50 mL塑料离心管中，加入试剂A 5-10 mL，振荡30 s ；所述试剂A是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂；B、再加入试剂B2-10 g，振荡30 s，5000 r/min离心5 min，将上清液转移至鸡心瓶中， 45 °C旋转蒸发至干；所述试剂B是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、硫酸钠或硫酸镁中任一种试剂；C、向鸡心瓶中加入试剂C2-10 mL，将其转移至15 mL离心管中；所述试剂C是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂；D、再向其中加入试剂D的溶液1-5mL，振荡30 s，5000 r/min离心5 min，将上层液体取出置于15 mL离心管中，置45 °C氮吹仪吹至干；所述试剂D的溶液是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂的溶液；E、剩余物用1mL液体试剂E和试剂F的溶液的混合溶液溶解，再加入2 mL正己烷， 漩涡振荡30 8,5000 r/min离心5 min，去除上层液正己烷层，下层液体经0. 22 Mm滤头过滤，UPLC (超高效液相色谱)测定；所述的试剂E是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇、二氯甲烷中任一种液体试剂；所述的试剂F是氯化钠、碳酸钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、硫酸钠钾或硫酸镁中任一种试剂。
全文摘要
本发明公开了一种检测动物肌肉组织中替米考星的前处理试剂盒及方法，试剂盒由盒体、试剂管A、试剂袋B、试剂管C、试剂瓶D、试剂瓶E、试剂袋F组成，盒体内分为a、b、c、d，a和b区为试剂管A和试剂管C放置的孔区，c区放试剂袋B和试剂袋F的凹槽，d区放试剂瓶D和试剂瓶E的凹槽；其步骤A、取动物肌肉组织于离心管中，加入试剂，振荡；B、加入试剂，旋转蒸发至干；C、向鸡心瓶中加入试剂，将其转移至离心管中；D、再加入试剂溶液，振荡，置氮吹仪吹至干。E、剩余物用液体试剂混合溶液溶解，再加入正己烷，漩涡振荡，去除上层液体，下层液体经滤头过滤，UPLC测定。操作简单、快速，价格低廉，所用试剂对色谱柱无损害。
文档编号G01N30/14GK102393430SQ20111038483
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者何力, 刘永涛, 喻亚丽, 杨红, 艾晓辉, 邹世平 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所