专利名称：一种测定HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法
技术领域：
本发明属于酶学和药物化学领域，涉及一种测定HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法，以及一种测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法。
背景技术：
HMG-CoA 还原酶(3_hydroxy 3-methyIglutaryI coenzyme Areductase)是肝细胞合成胆固醇过程中的限速酶，催化生成甲戍二轻酸(Mevalonic Ac id, MVA),抑制HMG-CoA还原酶能够限制胆固醇合成。目前，常见的HMG-CoA还原酶抑制剂有他汀类化合物，例如羟基洛伐他汀酸。测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法可分为酶制备、反应和抑制率检测3个步骤。首先制备大鼠肝微粒体HMG-CoA还原酶液；进而将制备的酶与底物置于缓冲液中，反应一定时间，加酸终止反应；反应终止后，利用酶标仪，直接检测酶反应体系的吸光度或从酶反应体系中分离产物，如甲戊二羟酸内酯(Mevalonolactone，MVAL)，测定其含量。目前对产物(MVAL)含量测定方法有闪烁计数仪测定同位素活度法(Kuroda M, Endo A. Inhibitionof in vitro cholesterolsynthesis by fatty acids. Biochim Biophys Acta，1976，486 :70 ；Endo A，et al. Competitive inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymeareductase by ML—236A and ML—236B fungal metabolites， havinghypocholesterolemicacitivity. FEBS Letters，1976，72 :323 ;和 AlbertsAW，et al. Mevinolin a highlypotent competitive inhibitor ofhydroxymethylglutary1-coenzyme A reductase andacholestero1-lowering agent. Proc Natl Acad Sci USA，1980，77(7) :3957)、LC-MS法(Park EJ, et al. Analysis of3-hydroxy-3-methylglutaryI coenzyme a reductaseinhibitors usingliquid chromatography-electrospray mass spectrometry.JChromatogr B Biomed Sci Appl，2001，754 :327)、LC-ESI-MS/MS 法(Honda A，MizokamiY，Matsuzaki Y，et al. Highly sensitive assay ofHMG-CoA reductase activity byLC-ESI-MS/MS. J Lipid Res，2007，48 :1212) 上述方法中，利用酶标仪的分光光度法的不足之处是酶反应体系较复杂并干扰较多，所以不能准确反映某一底物(NADPH)的吸光度并只能定性。产物(MVAL)的含量测定法中，利用闪烁计数仪测定同位素活度比较早期使用的方法，该方法价格昂贵，并存在同位素的安全性问题；利用LC-MS及LC-ESI-MS/MS方法先进及灵敏度较高，但是LC-MS是一级分裂的Mass，所以灵敏度不如二级分裂的LC-MS/MS，LC-ESI-MS/MS是对易于离子化的化合物很有效，但不易离子化的化合物(试验发现他汀类化合物普遍不易离子化)，从而不能正确反映其含量。血脂康胶囊是以红曲为主要成分的治疗高血脂症的药物，其包含多种HMG-CoA还原酶抑制剂成分(Ma J，Li Y，Ye Q，et al. Constituents of Red Yeast Rice，aTraditional Chinese food andmedicine. J Agric Food Chem. 2000，48 :5220)，但是由于其中很多成分是未知的，因此难以测定血脂康胶囊中HMG-CoA还原酶抑制剂的含量。
因此，本领域亟 需精确测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，以及能够测定未知样品中HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法。

发明内容
本发明人经过大量的试验和创造性的劳动，惊奇地发现了一种测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，并且结合该方法，能够有效并且精确地测定未知具体成分的样品(例如血脂康胶囊)中HMG-CoA还原酶抑制剂的浓度或者含量。由此提供了下述发明本发明的一个方面涉及一种测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，包括下述步骤I)建立如下的HMG-CoA还原酶酶促反应体系加入待测样品的待测样品反应体系，和加入与待测样品相同体积去离子水的阴性对照反应体系；2)通过HPLC-MS/MS (高效液相色谱一串联质谱，也称为LC/MS/MS)法测定待测样品反应体系和阴性对照反应体系中MVAL(甲戊二羟酸内酯)各自的浓度；3)通过式子HMG-CoA还原酶抑制率=[(MVAL在阴性对照反应体系中的浓度-MVAL在待测样品反应体系中的浓度)/MVAL在阴性对照反应体系中的浓度]X 100%,计算得到HMG-CoA还原酶抑制率。根据本发明的任一项所述的测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，其中，所述待测样品为HMG-CoA还原酶抑制剂，例如羟基洛伐他汀酸。待测样品可以是溶液的形式，也可以是固体。如果是固体，可以配制成溶液，作为待测样品。在本发明的一个实施方案中，步骤I)中建立HMG-CoA还原酶酶促反应体系的步骤如下移取100 μ L空白人血浆(人血浆中不加任何添加物的纯血浆)到I. 2mL深孔96孔板中，加入400 μ L甲醇之后，润流振荡混勻。样品溶液以3750rpm/min)离心IOmin,取上清液300 μ L移入到I. 2mL可拆卸96孔板管中，并40°C下用氮气流吹干上清液；用移液枪加入20 μ L待测样品至待测样品反应体系中(阴性对照反应体系不加)；反应体系置冰浴中，然后加入3. 3mg/mL的大鼠肝脏微粒体溶液(购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司)120 μ L，涡流振荡5秒；37 °C水浴预孵育，同时振摇15min ；再加入O. 5mM的HMG-CoA溶液20 μ L，涡流振荡混匀；37 °C水浴孵育，同时振摇30min ；加入5N的HCl 20 μ L，涡流振荡混匀。再次37°C水浴孵育，同时振摇15min以终止反应,此反应溶液可用作MVAL浓度测定。根据本发明的任一项所述的测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，其中，步骤2)中通过HPLC-MS/MS法测定阴性对照反应体系和待测反应体系中MVAL各自的浓度的步骤如下A.向阴性对照反应体系和待测反应体系中分别加入适量盐酸，并混匀，静置，使MVA(甲戊二羟酸)RKSmvau甲戊二羟酸内酯)；
B.用甲醇和O. IN的盐酸依次预处理ENV-SPE小柱；C.将步骤A中得到样品溶液分别上ENV-SPE小柱；D.用O. IN的盐酸和去离子水依次洗脱ENV-SPE小柱；E.用甲醇洗脱步骤D处理后的ENV-SPE小柱，富集流分，得到洗脱液；F.将步骤E中得到的洗脱液进行干燥，得到干燥物； G.将步骤F中得到干燥物用氨水重新溶解，混匀，静置，使MVAL转化为MVA ；H.将步骤G中得到的样品进样HPLC-MS/MS系统。根据本发明的任一项所述的测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，其中，步骤F中的干燥通过在40°C下，氮气吹干进行。根据本发明的任一项所述的测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，其中，步骤G中的氨水的浓度为O. 2%。根据本发明的任一项所述的测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，其中，步骤A和/或步骤G中的静置为30分钟。根据本发明的任一项所述的测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，其中，步骤H中，样品在15°C自动进样器中稳定24小时。根据本发明的任一项所述的测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，其中，HPLC条件如下流动相IOmM 甲酸铵(ρΗ8· O):乙腈，70/30 (ν/ν)流速O. 8mL/min (无分流)洗针溶液50 50甲醇/水(ν/ν)进样体积30 μ L数据采集时间3min柱温室温自动进样温度室温；转换阀的转换时间Tl设置在第一个色谱峰出峰前O. 5分钟，转换时间T2设置在最后一个色谱峰出峰至少O. 5分钟后；MS/MS 条件MVA 极性负模式母离子质荷比(m/z)147. O子离子质荷比59. I延滞时间200msec停顿时间5msec保留时间约1.8minMVA-d7 极性负模式母离子m/z154. O子离子 m/z59. I延滞时间200msec
停顿时间5msec保留时间约1.8min在本发明的一个实施方案中，转换时间Tl为I. 2分钟，转换时间T2为2. 5分钟。上述中的HPLC-MS/MS可以采用市售的高效液相色谱质谱联用仪，例如使用美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)生产的 API 4000 LC/MS/MS。根据本发明的任一项所述的测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，其中，通过如下方法计算MVAL的浓度确定色谱峰保留时间和峰面积，以峰面积比率和浓度得到曲线，由该曲线计算出MVAL的浓度，即采用线性回归根据以下公式计算出MVAL的 浓度y = ax+b其中y =被测物(MVA)与内标物(MVA_d7)的峰面积比率，b=曲线的截距，a=曲线的斜率，X = MVAl的浓度(测得的MVA的浓度即为MVAL的浓度，二者相同)。具体地，可以通过分析软件(可以使用本领域已知的分析软件，例如HPLC自带的软件，如 Applied Biosystems Analyst DataAcquisition Software (version 1.4.1))石角定色谱峰保留时间和峰面积，以峰面积比率和浓度得到曲线。根据本发明的任一项所述的测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，其中，MVAL在阴性对照反应体系中的浓度为多个阴性对照反应体系中的平均浓度。本发明的另一方面涉及一种测定待测样品中HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法，包括下述步骤I)根据上面任一项所述的方法测得η组不同已知浓度的羟基洛伐他汀酸溶液对应的HMG-CoA还原酶抑制率，η大于等于5 ;优选地，η大于等于10。II)制作步骤I)中HMG-CoA还原酶抑制率y_羟基洛伐他汀酸溶液浓度X的曲线方程；III)根据上面任一项所述的方法测得待测样品的HMG-CoA还原酶抑制率y ；IV)将步骤III)中测得的HMG-CoA还原酶抑制率y代入步骤II)中的曲线方程，计算得到的羟基洛伐他汀酸浓度X即为待测样品中HMG-CoA还原酶抑制剂的浓度。在本发明的一个实施方案中，其中，步骤II)中，通过软件0rigin7. 5制作曲线方程。在本发明的一个实施方案中，其中，步骤II)中的曲线方程如下HMG-CoA还原酶抑制率y_羟基洛伐他汀酸浓度X的曲线方程y = A2+ (A1-A2) / [1+ (X/X0)P]其中，X为羟基洛伐他汀酸的浓度或者抑制剂的浓度(ng/mL)-5 ^ A1 < A2 ^ 115A1, A2, X。和P来自软件Origin 7. 5中的原始参数(这四个参数,是拟合曲线的参数，决定曲线的形状，A1是拟合后曲线的top，上渐近线的估值；A2是拟合后曲线的bottom，下渐近线的估值；X(|是拟合后曲线的Midpoint,中间值；P是斜率hillslope。不同批次的反应体系中变化不大。)。在本发明的一个实施方案中，所述样品为血脂康胶囊或者血脂康胶囊配制的溶液。对本领域技术人员而言，可以根据测得的血脂康胶囊配制的溶液中HMG-CoA还原酶抑制剂的浓度，结合溶液的体积和所用血脂康胶囊的个数和/或重量，容易地计算出每个血脂康胶囊中HMG-CoA还原酶抑制剂的含量。
发明的有益效果他汀类药物研究开发一直是天然产物与微生物领域研究热点之一。他汀类药物的开发研究离不开体外检测，无论是研发还是大规模生产，产品质量控制，化合物的定性、定量检测都是及其重要的。利用体外酶促反应及LC-MS/MS系统，对血脂康胶囊这样包含多种HMG-CoA还原酶抑制活性成分的天然药物进行HMG-CoA还原酶抑制活性评价时，可以排除药物(例如血脂康胶囊)中难溶解成分对分光光度法检测带来的干扰，并能准确地反映药物的酶抑制活性，同时一步测定其总活性成分的含量而无需对单一成分一一测定其含量。任何全新的、可能的HMG-CoA还原酶抑制剂的活性及含量测定都可以通过此方法检测确认。本发明的测定样品中HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法具有较高的灵敏度和良好的准确度。


图I :MVAL的校正曲线。图2 羟基洛伐他汀酸的标准曲线。图3 :血脂康胶囊样品的色谱图。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I :HMG-CoA还原酶抑制率的测定I.建立HMG-CoA还原酶酶促反应体系移取100 μ L空白人血浆(目的是给酶促反应提供适宜的反应环境)到I. 2mL深孔96孔板中，加入400 μ L甲醇之后，润流振荡混勻。样品溶液离心(3750rpm/min) IOmin,取上清液300 μ L移入到I. 2mL可拆卸96孔板管中，并40°C下用氮气流吹干上清液。用移液枪向各管中加入20 μ L样品(待测样品为表I所示浓度的羟基洛伐他汀酸溶液，阴性对照为去离子水)。冰浴下，用排枪向各管中加入3. 3mg/mL的大鼠肝脏微粒体溶液120μ L，涡流振荡5秒。37 °C水浴预孵育，同时振摇15min。再用排枪加入O. 5mM的HMG-CoA溶液20 μ L，涡流振荡混匀。37°C水浴孵育，同时振摇30min。
用排枪向各孔加入5N的HCl 20 μ L，涡流振荡混匀。再次37°C水浴孵育，同时振摇15min以终止反应，此反应溶液可用作MVAL含量测定。标准品(待测样品)为羟基洛伐他汀酸溶液，体积均为1000 μ L，其配制的浓度如下面的表I所示表I :作为标准品的10个羟基洛伐他汀酸溶液样品及其浓度
权利要求
1.一种测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，包括下述步骤 1)建立如下的HMG-CoA还原酶酶促反应体系 加入待测样品的待测样品反应体系，和 加入与待测样品相同体积去离子水的阴性对照反应体系； 2)通过HPLC-MS/MS法测定所述待测样品反应体系和所述阴性对照反应体系中MVAL各自的浓度； 3)通过式子 HMG-CoA还原酶抑制率=[(MVAL在所述阴性对照反应体系中的浓度-MVAL在所述待测样品反应体系中的浓度)/MVAL在所述阴性对照反应体系中的浓度]X 100%, 计算得到HMG-CoA还原酶抑制率。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述待测样品为HMG-CoA还原酶抑制剂，例如羟基洛伐他汀酸。
3.根据权利要求I所述的方法，其中，步骤2)中通过HPLC-MS/MS法測定所述阴性对照反应体系和所述待测反应体系中MVAL各自的浓度，包括如下步骤 A.向所述阴性对照反应体系和所述待测反应体系中分别加入盐酸，并混匀，静置，使MVA转化为MVAL ； B.用甲醇和O.IN的盐酸依次预处理ENV-SPE小柱； C.将步骤A中得到样品溶液分别上ENV-SPE小柱； D.用O.IN的盐酸和去离子水依次洗脱ENV-SPE小柱； E.用甲醇洗脱步骤D处理后的ENV-SPE小柱，富集流分，得到洗脱液； F.将步骤E中得到的洗脱液进行干燥，得到干燥物； G.将步骤F中得到的干燥物用氨水重新溶解,混匀,静置,使MVAL转化为MVA； H.将步骤G中得到的样品进样HPLC-MS/MS系统。
4.根据权利要求3所述的方法，其满足如下的(1)-(5)项中的一项或者多项 (1)步骤A中的静置为30分钟； (2)步骤F中的干燥通过在40°C下，氮气吹干进行； (3)步骤G中的氨水的浓度为O.2% ; (4)步骤G中的静置为30分钟； (5)步骤H中，样品在15°C自动进样器中稳定24小吋。
5.根据权利要求3所述的方法，其中， HPLC条件如下 流动相IOmM甲酸铵(ρΗ8· O)こ腈，70/30 (ν/ν) 流速O. 8mL/min (无分流) 洗针溶液50 : 50甲醇/水(ν/ν) 进样体积30 μ L 数据采集时间3min柱温室温 自动进样温度室温； 转换阀的转换时间Tl设置在第一个色谱峰出峰前O. 5分钟，转换时间T2设置在最后一个色谱峰出峰至少0. 5分钟后； MS/MS条件 MVA 极性负模式 母离子质荷比(m/z) 147.0 子离子质荷比59. I 延滞时间200msec 停顿时间5msec 保留时间约1.8min;MVA-d7 极性负模式 母离子m/z154.0 子离子m/z59. I 延滞时间200msec 停顿时间5msec 保留时间约1.8min。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，通过如下方法计算MVAL的浓度 确定色谱峰保留时间和峰面积，以峰面积比率和浓度得到曲线，由该曲线计算出MVAL的浓度，即采用线性回归根据以下公式计算出MVAL的浓度y = ax+b 其中 y = MVA与内标物MVA-d7的峰面积比率， b =曲线的截距， a =曲线的斜率， X = MVAL的浓度。
7.一种测定待测样品中HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法，包括下述步骤 I)根据权利要求1-6中任一项所述的方法测得n组不同已知浓度的羟基洛伐他汀酸溶液对应的HMG-CoA还原酶抑制率，n大于等于5 ； II)制作步骤I)中HMG-CoA还原酶抑制率y-羟基洛伐他汀酸溶液浓度X的曲线方程； III)根据权利要求1-6中任一项所述的方法测得待测样品的HMG-CoA还原酶抑制率I ; IV)将步骤III)中测得的HMG-CoA还原酶抑制率y代入步骤II)中的曲线方程，计算得到的羟基洛伐他汀酸浓度X即为待测样品中HMG-CoA还原酶抑制剂的浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤II)中，通过软件0rigin7.5制作曲线方程。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤II)中的曲线方程如下 HMG-CoA还原酶抑制率y-羟基洛伐他汀酸浓度X的曲线方程y = A2+(A1-A2)/[1+(X/X0)P] 其中， X为羟基洛伐他汀酸的浓度或者抑制剂的浓度(ng/mL)-5 ≤ A1 < A2≤ 115A15A25Xtl和P来自软件Origin 7. 5中的原始参数。
全文摘要
本发明属于酶学和药物化学领域，涉及一种测定HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法，以及一种测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法。具体地，所述测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，包括下述步骤1)建立如下的HMG-CoA还原酶酶促反应体系不加待测样品的阴性对照反应体系，和加入与待测样品相同体积去离子水的阴性对照反应体系；2)通过HPLC-MS/MS法测定阴性对照反应体系和待测反应体系中MVAL各自的浓度；3)通过式子HMG-CoA还原酶抑制率＝[(MVAL在阴性对照反应体系中的浓度-MVAL在待测反应体系中的浓度)/MVAL在阴性对照反应体系中的浓度]×100％，计算得到HMG-CoA还原酶抑制率。该方法能够精确地测定HMG-CoA还原酶抑制率。
文档编号G01N30/02GK102621238SQ20111003424
公开日2012年8月1日 申请日期2011年2月1日 优先权日2011年2月1日
发明者李雪梅, 段震文, 郭树仁 申请人:北京北大维信生物科技有限公司