专利名称：测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用标记的快速延迟校正钾通道(IKR)的封阻剂，例如[3H]-多非利特或[3H]-MK-499，以确定化合物在″ether-a-go-go″(ERG)钾(K+)通道，特别是人ERG(hERG)钾通道的亲和力的测定法。这种测定法可用于鉴定对人心脏复极化具有不良效果，特别是延长心电图QT间隔，有可能导致扭转峰值倾向的化合物。
近年来，一些被建议作为治疗用途的化合物的开发，由于在晚期药物开发中检测到对人心脏复极化具有不良效果而被放弃。这些药物的效果是在心电图(ECG)的QT间隔方面被评估的。QT间隔是ECG的一部分，代表了从心室去极化开始到心室复极化结束的时间。因为QT间隔可以受到心率的影响，随心率下降而变长，并随心率升高而缩短，所以QT经常针对心率进行校正，产生QTc间隔。在罕见的情况下，一些药物分子的给药导致人ECG QT间隔的延长。这些患者的ECGs与患有公知为长QT综合症的遗传病症的个体的心电图类似。在这些情况下，药物诱导的心室纤维性颤动可最终导致突然死亡(Morganroth Jet al.(1993)Am J Cardiol.72，26B-31B；De Ponti F.et al.，(2000)Eur J.Clin.Pharmacol.56，1-18)。许多药物分子，包括E-403 1、西沙必利和特非那定，已知都可以延长人心电图的QT间隔(Fuliki A，et al.(1994)，Cardiovascular Pharmacol.23374-378；Van Haarst AD et al.，(1998)Clin Pharmacol.Ther.64542-546；Honig P.K.et al.(1993)J.A.M.A.269；1513-1518)。
带有未被发现的潜在心脏毒副作用的新药的上市可能具有危险的后果，并可能引发患者致命的心脏节律失调。由具有药理学重要性的化合物诱导的QT延长的晚期检测能够阻止药物发现和开发项目，并因而对项目的结果产生深远的影响。所以，人们期望能够在药物开发的早期阶段测试化合物潜在的心脏毒副作用。
根据本发明，提供了包含或由以下步骤组成的一种测定方法a)在存在或不存在不同量的测试化合物或者测试化合物混合物的情况下，在测定缓冲液中温育表达ERG的细胞、或者来自于ERG表达细胞的膜、或者来自于ERG表达组织的膜和标记的IKR封阻剂；b)测定特异性结合的标记的IKR封阻剂；c)计算测试化合物或者测试化合物混合物对标记的IKR封阻剂结合的抑制。
这种测定可用作为鉴定具有延长人QT间隔倾向的化合物的临床使用前的预测性指标。这种测定法是一种测量测试化合物或者化合物混合物自ERG K+通道(ether-a-go-go K+通道，本文称之为ERG)置换标记的IKR封阻剂能力的竞争性结合测定。这种测定法可以在高通量的测试系统中进行。连同结构-活性关系(SAR)，使用标记的IKR封阻剂的配体结合测定法可被用来帮助设计对ERG，特别是人ERG(hERG)没有或者具有降低的亲和力的新药。
所用的测定缓冲液对于优化IKR封阻剂或测试化合物对ERG的结合尤为重要。已发现在使用以Tris为基础的含有钾离子(K+)的缓冲液时(室温下pH7.2到7.6，优选pH7.4)可达到最佳的测定性能。测定缓冲液中的钾离子可以，例如作为氯化钾(KCl)提供。测定缓冲液中的钾离子浓度决定了该测定的预测值。在含有7.5到12.5mM KCl、优选8.5到11.5mM KCl、最优选10mM KCl的测定缓冲液中进行的测定尤其可用来提供预测QT延长发作的IC20值。
本发明的测定缓冲液优选包含或由Tris·Cl和KCl组成。可选地，测定缓冲液中可以包括MgCl2。
测定缓冲液中的Tris·Cl浓度优选为30mM到l00mM Tris·Cl，更优选30mM到70mM Tris·Cl，但是更优选40mM到60mM Tris·Cl，进一步优选45mM到55mM Tris·Cl，最优选50mM Tris·Cl。
测定缓冲液中的KCl浓度优选为5到20mM KCl，更优选6到15mMKCl，但是更优选7.5到12.5mM KCl，进一步优选8.5到11.5mM KCl，最优选10mM KCl。
在特别优选的实施方案中，测定缓冲液包含或由30mM到100mMTris·Cl和5到20mM KCl组成，优选30mM到70mM Tris·Cl或30mM到100mM Tris·Cl和6到15mM KCl，但是更优选40mM到60mM Tris·Cl和7.5到12.5mM KCl，进一步优选45mM到55mM Tris·Cl和8.5到11.5mM KCl。
特别优选测定缓冲液包含或由50mM Tris·Cl和10mM KCl组成。
如果测定缓冲液中包括MgCl2，MgCl2的浓度优选为0.6mM到2.0mMMgCl2，更优选0.6mM到1.6mM MgCl2，但是更优选0.8mM到1.4mM MgCl2，进一步优选0.9mM到1.3mM MgCl2，但是更进一步优选1.0mM到1.2mMMgCl2，最优选1.0mM到1.2mM MgCl2。
在优选的实施方案中，测定缓冲液包含或由30mM到100mMTris·Cl、5到20mM KCl和0.6mM到2.0mM MgCl2组成；优选30mM到100mM Tris·Cl或30mM到70mM Tris·Cl、6到15mM KCl和0.6mM到1.6mM MgCl2；但是更优选40mM到60mM Tris·Cl、7.5到12.5mM KCl和0.8mM到1.4mM MgCl2；进一步优选45mM到55mM Tris·Cl、8.5到11.5mM KCl以及0.9mM到1.3mM MgCl2或1.0mM到1.2mM MgCl2。
测定缓冲液可以包含或由50mM Tris·Cl、10mM KCl和1.0mM MgCl2；或者50mM Tris·Cl、10mM KCl和1.2mM MgCl2组成。
优选测定缓冲液室温下的pH在7.2和7.6之间；特别优选测定缓冲液室温下的pH为7.4。
ERG基因(cDNA)可以是脊椎动物或无脊椎动物来源的；对于脊椎动物，ERG基因可以是哺乳动物来源的(如人、类人猿、牛、猪、犬、兔、豚鼠、大鼠或小鼠)，或者无脊椎动物来源例如昆虫来源(如果蝇)。可以利用哺乳动物ERG的原核同源生物。优选ERG基因为哺乳动物ERG，特别是人ERG(hERG)或犬ERG(cERG)。
ERG基因可以表达于哺乳动物细胞系中，如HEK-293(人胚胎肾)细胞，CHO(中国仓鼠卵巢)细胞；CHL(中国仓鼠肺)细胞，COS(猴)细胞；或者表达于昆虫细胞系如SF9中。杆状病毒载体系统可用于在适配的昆虫细胞系中表达ERG。替代地，ERG可以表达于酵母或细菌细胞中。优选ERG基因是hERG或cERG，并在HEK-293、CHO或CHL细胞中表达。
测定可利用表达ERG的全细胞，或者来自ERG表达细胞的膜制备物，或者来自ERG表达组织的膜制备物进行。
多非利特是IKR封阻剂(延迟校正钾离子电流中快速组份的选择性抑制剂)，它以浓度依赖性的方式延长动作电位时间和有效不应期。临床研究已证明多非利特可以有效地治疗具有房性心率失常以及室性心率失常的患者。多非利特具有如下的结构式I。
结构式I
多非利特被要求保护，并且它的制备描述在欧洲专利EP 0245997中。
MK-499(Merck)是起IKR封阻剂作用的甲基磺胺类抗心率失常药物。MK-499具有下面所示的结构式II。
结构式II 测定中所用的IKR封阻剂用可检测的标记，例如放射性标记或者荧光标签标记。在本发明优选的实施方案中，测定中所用的标记的IKR封阻剂是标记的多非利特，优选放射性标记的多非利特，更优选氚化的多非利特([3H]-多非利特)。在本发明另一个实施方案中，测定中所用的标记的IKR封阻剂是标记的MK-499，优选放射性标记的MK-499，更优选氚化的MK-499([3H]-MK-499)。
优选的测定形式包括过滤结合技术，其中结合和未结合的标记的IKR封阻剂如标记的多非利特或标记的MK-499；优选放射性标记的多非利特或放射性标记的MK-499；最优选[3H]-多非利特或[3H]-MK-499是通过过滤分离的。测定可以使用闪烁亲近测定法(SPA)技术，利用放射性标记的IKR封阻剂例如放射性标记的多非利特或放射性标记的MK-499，优选[3H]-多非利特或[3H]-MK-499进行。
在过滤结合技术中，ERG表达细胞或来自ERG表达细胞的膜或者来自ERG表达组织的膜在缓冲液中与标记的IKR封阻剂例如[3H]-多非利特或[3H]-MK-499，在存在(测试)或者不存在(对照)测试化合物或者测试化合物混合物的条件下温育。温育优选在室温下进行60到120分钟，优选90分钟。非特异性结合在存在未标记的IKR封阻剂，例如，10μM多非利特或10μMMK-499的条件下测定。结合的标记IKR封阻剂通过过滤垫或者在多孔过滤板上经过滤与未结合的IKR封阻剂分离。洗涤过滤垫或板以除去未结合的标记IKR封阻剂，而结合的标记IKR封阻剂，如对于氚化的IKR封阻剂例如[3H]-多非利特或[3H]-MK-499，利用适当的放射性计数器通过闪烁光谱定量。
在闪烁亲近测定法TM(SPA)系统(Amersham Biosciences)中，利用珠子结合ERG表达细胞或来自ERG表达细胞的膜或来自ERG表达组织的膜。许多类型的珠子适合用于根据本发明的SPA测定，这些珠子包括PVT麦胚凝集素、三氧化二钇聚赖氨酸珠子、或者硅酸钇珠子(YSi)(Amersham Biosciences)例如YSi聚赖氨酸或者YSi麦胚凝集素。用于本发明的SPA测定的最佳珠子类型取决于所用的细胞或细胞膜；可以评价珠子对细胞或珠子对膜的结合以鉴定所用的细胞或细胞膜的最佳珠子类型。结合于ERG材料(全细胞、细胞膜制备物或组织膜制备物)的珠子在测定缓冲液中与标记的IKR封阻剂，例如[3H]-多非利特或[3H]-MK-499，在存在(测试)或者不存在(对照)测试化合物或者测试化合物混合物的条件下温育。测试化合物或测试化合物混合物取代结合的放射性标记的IKR封阻剂的能力通过检测光发射，例如利用能够和SPA技术一起应用的标准计数器来确定。
测定还可以包括如下的一个或多个步骤计算给出多非利特结合20％抑制(IC20)的测试化合物的浓度，计算给出多非利特结合50％抑制(IC50)的测试化合物的浓度，计算记作Ki的化合物亲和力或者计算记作pKi的化合物亲和力。
利用本发明的测定，自IKR封阻剂结合，例如[3H]-多非利特结合的竞争性取代所产生的IC20值，和与人QT延长相关的游离药物浓度不相上下。因此这种测定可用于预测可能导致不良心脏副作用的化合物的浓度。
为评价一种化合物或化合物的混合物是否可能延长人心电图QT间隔，进行了以下步骤a)根据本发明进行测定。
b)获得IC20值；这预示了真实或预测的会发生人QT延长的游离药物浓度；c)将IC20值与化合物或化合物混合物在体内预期的治疗效果所需的游离药物浓度相比较。
如果化合物或化合物混合物预期的治疗效果所需的游离药物浓度在该测定中化合物或化合物混合物IC20值的10到30倍的范围之内，则该化合物或化合物混合物很可能表现出人QT间隔的延长。
与现存的测定例如HERG膜片钳测定相比，本发明的测定是药物分子体内QT延长效应的一个较好的预测方法。
附图清单

图1表示[3H]-多非利特在(a)过滤结合中，(b)SPA 96孔形式中以及(c)SPA 384孔形式中结合HERG的饱和曲线数据。
图2比较从过滤结合和SPA结合测定中获得的pKi值的关系图(a)96孔hERG[3H]-多非利特SPA测定与放射配体结合测定之间的相关性，(b)96孔和384孔hERG[3H]-多非利特SPA测定间的相关性。
图3(a)E-4031，(b)多非利特，(c)特非那定和(d)西沙必利对[3H]-多非利特结合hERG的抑制、hERG膜片钳、以及诱导人QT间隔延长的已知游离药物浓度之间的比较。
图4在由人ERG(hERG(▲))或犬ERG(cERG(■))转染的HEK-293细胞的细胞膜中进行的多非利特结合测定中多非利特IC50的比较。
图5cERG或hERG转染的HEK-293细胞膜中多非利特结合测定中特非那定IC50的比较。
图6cERG或hERG转染的细胞HEK-293膜中多非利特结合测定中E4031 IC50的比较。
图7(a)多非利特和(b)双苯丁胺在氚化多非利特SPA测定中使用50mM Tris·Cl、10mM KCl、pH7.4的测定缓冲液时的平均(n＝2)浓度效应曲线。
实施例实施例1从表达人或犬ERG的HEK-293细胞制备膜一个表达人ERG的粘附HEK-293细胞系(Zhou，Zet al(1998)Biophys.J.74，230-241)由美国威斯康新大学的Craig January博士提供；这个细胞系被命名为“January”细胞系。一个替代的粘附HEK-293细胞系，命名为细胞系15(293S-HERG克隆15)是按照Zhou，Z等(1998)描述的方法制备的。全长的人ERG cDNA被插入pcDNA3.1(Invitrogen)的CMV启动子下游，该载体还具有驱动新霉素抗性基因表达的SV40启动子。这种构建物被转染进人胚胎肾293S(HEK-293)细胞中。利用G418(Gibco)选择稳定的转化子。虽然细胞系15比January细胞系具有稍微较低的hERG表达，但是它具有改善的生长特征。
细胞系15(293S-HERG(克隆15))于2002年6月26日按照布达佩斯条约1977的条款保藏于ECACC(CAMR Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，UK)，保藏号为02062678。
表达人ERG的粘附HEK-293细胞培养于补充有10％胎牛血清(PAALaboratories)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)、1mM丙酮酸钠(Sigma)、0.4mg/ml G418(Life Technologies)并添加1×非必需氨基酸(LifeTechnologies)的MEM Earles培养基(Life Technologies)中。细胞在T225cm3烧瓶里在具有5％CO2的潮湿气氛中于37℃生长。在达到80％融合后用细胞离散液(Sigma，目录号C5914，2001)将细胞按1∶3到1∶5分裂，随后在不存在G418的条件下接种到850cm2的CO2通气滚瓶(Corning，目录号430849，2001)中。
为制备膜，通过刮除从滚瓶中收集细胞并重悬于PBS(LifeTechnologies目录号14190-094，2001)中。使所有的细胞沉淀、用PBS洗涤两次，并在干冰上快速冷冻，之后于-80℃贮存备用。
表达犬ERG的HEK-293细胞系通过HEK-293细胞瞬时转染制备。cERG cDNA的完整编码序列(Zenelein et al(2001)Pflugers Archiv.European Journal of Physiology.442(2)188-191)由德国海丁堡大学的Zehelein教授提供在pBluescript载体(Stratagene)中。在pBluescript构建物中，cERG cDNA侧接BamH I位点。最初的实验显示了将cERG BamH I片段直接插入所需载体pcDNA3.1的较低的插入效率。为克服这点，利用克隆载体pSP73(Promega)设计了间接克隆法。cERG/pBluescript构建物和pSP73载体经BamH I消化，以减少连接反应中因pBluescript BamH I片段的存在而造成的干扰，cERG/pBluescript BamH I消化物还经Sca I消化以切割pBluescript并确保cERG BamH I在琼脂糖凝胶上更有效的分离。限制性酶切混合物经琼脂糖凝胶电泳，含cERG和pSP73 BamH I片段的条带在用溴化乙锭染色和UV光照之后显现。cERG和pSP73条带被切下，并根据制造商的说明利用QIAgen MinElute凝胶抽提试剂盒从凝胶中洗脱出来。为防止连接反应期间pSP73 DNA BamH I端点的重连，质粒DNA片段利用标准方案经CIP处理。cERG BamH I片段利用标准连接方案连接到pSP73 BamH I片段上。反应后，连接混合物利用标准转化方案转化到cJM109感受态大肠杆菌细胞中。转化子通过涂板含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂(Millers)挑选并于37℃过夜孵育。利用转化细胞的过夜培养物根据制造商的说明使用QIAgen Miniprep试剂盒制备cERG/pSP73 DNA小量产物。所得的DNA经限制性酶切消化和琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。
cERG cDNA作为Xho I(5’)EcoR I(3’)片段从cERG/pSP73中切割下来，该片段被连接到反向多聚接头形式的pcDNA3.1的Xho I/EcoRI片段中，pcDNA3.1(-)xho I/EcoR I。在这个例子中使用反向多聚接头形式是因为所选的cERG/pSP73克隆含有反向cERG。连接到pcDNA3.1(-)中以后，cERG 5’端的定位毗邻来自人巨细胞病毒(CMV)的增强子-启动子序列。连接混合物利用标准转化方案转化到cJM109感受态大肠杆菌细胞中，转化子通过与所需的对照-起涂板含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂(Millers)并于37℃过夜孵育挑选。从cERG/pcDNA3.1(-)平板中随机挑取的集落被接种到含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml LB培养基中并于37℃、200rpm过夜孵育。随后利用这些过夜培养物使用QIAgen Miniprep试剂盒制备DNA小量产物。所得的DNA经Xho I和EcoR I双重消化，并在1％琼脂糖凝胶上测定。由于连接反应中插入效率低，加上只有来自少数克隆的DNA利用小量制备法予以测定的事实，没有鉴定到阳性cERG/pcDNA3.1(-)克隆。因此利用集落PCR法从较大数目的集落中筛选阳性克隆。
集落PCR方案允许迅速检测cERG/pcDNA3.1(-)克隆。设计并制备了3个引物用于该PCR方案
引物1‘CERG01’(SEQ ID NO1)，它与cERG在编码序列601-620的核苷酸位置杂交5’-ACCACATCCACCAGGCACAG-3’引物2‘NHE PCDNA3’(SEQ ID NO2)，它与pcDNA3.1(-)在886-910的核苷酸位置(在侧接Nhe I克隆位点的多克隆位点内)杂交5’-CCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACGG-3’引物3‘T7 SP73’(SEQ ID NO3)，它被用作为对照，并用作为已知产生cERG/pSP73的集落的对照。它与pSP73在98-121的核苷酸位置，在T7聚合酶启动子序列内杂交5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’从LB琼脂转化板上挑取95个cJM109集落，并转移到无菌深孔96孔板中，含1ml/孔补充有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB肉汤。作为对照，已知含有cERG/pSP73质粒的集落被转移到含有LB-amp肉汤的最后的第96孔中。该板被盖上并于37℃在200rpm过夜孵育。一份70μl的每种小量培养物被转移到96孔PCR板中(0.5ml/孔)，并置于Beckman Allegra 6R离心机中2800rpm室温下离心10分钟。弃上清，并且板被抽干3分钟。如下建立PCR反应混合物并添加到含有细菌沉淀的PCR板中测试孔 对照孔cERG/pSP73Taqman Gold缓冲液(×10)10.0μl10μl
dNTPs(×10，2mM/dNTP)2.0μl 2μlTaqman Gold聚合酶(5单位/μl) 0.5μl 0.5μlCERG01(引物1-25μM) 2μl 2μlNHE PCDNA3(引物2-25μM) 2μl -T7 SP73(引物3-25μM) -2μl无核酸酶的水 83.5μl 83.5μl细菌沉淀重悬于PCR反应混合物中。PCR反应如Taqman Gold PCR试剂盒的制造商方案中所说明的(Applied Biosystems，1990版)这样进行温度 时间步骤1-热启 95℃ 6分步骤2-变性 95℃ 1分步骤3-退火 60℃ 1分步骤4-延伸 72℃ 1分 转步骤2，35个循环后转步骤5步骤5-变性 95 ℃ 45秒步骤6-退火 60℃ 45秒步骤7-延伸 72 ℃ 5分然后每孔的PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上利用100bp的DNA阶梯标记物(ladder marker)通过于1×TAE缓冲液中在100V电泳25分钟分离，并利用UV光显现。鉴定推定的阳性克隆，来自这些PCR反应混合物的样品在第二个分离1.5％琼脂糖凝胶上于100V跑1小时以检查PCR产物的大小。
给出扩增的PCR产物的小量培养物分别从原始的深孔96孔板上接种到装有含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB肉汤的无菌试管中，并于37℃在200rpm过夜孵育。然后利用过夜培养物使用QIAgen Miniprep试剂盒制备DNA小量产物。所得的DNA经xho I和EcoR I双重消化，以检查cERG/pcDNA 3.1(-)的存在。限制性酶消化产物通过和1kb的DNA阶梯标记物(20μl样品加载2μl凝胶上样液)在1％琼脂糖凝胶上于100V跑1小时进行测定。进行进一步限制性酶消化测定，以确认来自转化子的纯化质粒确实是cERG/pcDNA3.1(-)。
未转染的HEK-293细胞通常保持在补充有10％(v/v)胎牛血清(FCS)、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM非必需氨基酸的50ml基本必需培养基(MEM)中。细胞接种到225cm2通气的有塞烧瓶里，并保持在含5％CO2的潮湿气氛中。本研究所用的HEK-293细胞传代数目在39-48之间。细胞典型地每三天以1∶3的比例自80-90％融合的烧瓶中传代；当用10ml PBS洗涤两次并且利用细胞离散液与烧瓶分离开之后加入新鲜培养基。
cERG/pcDNA3.1(-)构建物利用以下方法转染到在225cm2通气烧瓶里生长至80-95％融合的HEK-293细胞中。无细菌内毒素的cERG/pcDNA3.1(-)DNA(94μg)和Lipofectamine2000(Gibco BRL)(94μg)被添加到无菌10ml离心管中的2.25ml OPTIMEM-I培养基中(Gibco BRL)中；室温温育5分钟之后进行混合。Lipofectamine2000/DNA/OPTIMEM-I混合物接着在室温下温育20分钟，之后另外加入10.5ml OPTIMEM-I。HEK-293细胞用10ml PBS洗涤，然后加入Lipofectamine2000/DNA/OPTIMEM-I混合物，并在含5％CO2的潮湿气氛中于37℃孵育3.5小时。孵育后，加入50ml MEM(补充有10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1mM非必需氨基酸)。HEK-293细胞于37℃孵育24小时。24小时后通过用PBS洗涤、将细胞刮到10ml PBS中、并在1000rpm于室温离心5分钟收集转染的细胞。所得的cERG/pcDNA3.1(-)转染的HEK-293细胞沉淀在-80℃贮存备用。
从表达人或犬ERG的HEK-293细胞制备膜细胞膜碎片从冷冻的小份细胞中制备。所有操作除非另外陈述都在4℃进行。冷冻的小份细胞在室温下融化，并重悬于测定缓冲液(例如50mM Tris·Cl，10mM KCl，1到1.2mM MgCl2，pH7.4，或者50mM Tris·Cl，10mM KCl，pH7.4)中。然后在0mni LabTek匀浆机中通过在20,000rpm匀浆30秒裂解细胞。匀浆在48,000×g离心20分钟(4℃，SorvallRC5B离心机)，并除去上清。所得的沉淀重悬于测定缓冲液中，并如上所述匀浆10秒。通过离心收集沉淀，并且将最终的沉淀重悬于测定缓冲液中。蛋白含量利用考马斯亮蓝为基础的蛋白测定试剂盒测定。小份在-80℃贮存备用；当在这些条件下贮存时，细胞膜碎片的结合能力被证明至少在4个月内是稳定的。
实施例2[3H]-多非利特过滤结合测定[3H]-多非利特(80-83 Ci/mmol)通过催化氚化合成(例如，由Amersham Life Science提供的客户服务)。不过，熟练技术人员公知的其它可检测标记可以被用来替代3H，例如荧光标签、其它放射性标记、抗体等。
在测定当天，测试化合物以1mM溶于50％DMSO或100％DMSO中，然后在测定缓冲液中稀释到所需浓度(例如直到100μM，或者直到该化合物的溶解度界限)。对于最佳的测定条件而言，测定温育液中DMSO的终浓度优选1.0到1.5％或者更低。
除非另外指出，温育在测定缓冲液(50mM Tris·Cl，10mM KCl，1.0mM到1.2mM MgCl2，pH7.4)中包括50μg/ml的膜匀浆、[3H]-多非利特(4到7nM)以及测试化合物或测试化合物混合物或者对照介质。过滤测定在室温下温育90分钟。非特异性结合在存在10μM多非利特的条件下测定，并且通常低于总结合的15％。结合配体通过，利用例如Brandel细胞收集器迅速过滤通过GF/B玻璃纤维过滤垫，或者利用Packard Filermate 96收集器过滤到GF/B单过滤96孔过滤板(Packard)上与游离配体分离。过滤垫和板预先浸泡在5％PEI(w/v)中60分钟，并在收集后用3次×1ml冰冻测定缓冲液洗涤。单过滤板在加入Microscint-O(Packard)之前于37℃空气中干燥最低限度1.5小时。结合的[3H]-多非利特利用适当的计数器通过液体闪烁光谱，例如对于单过滤板来说，在Packard TopCount闪烁计数器(NXT计数器)或Wallac计数器(Trilux)中，而当利用过滤垫时，在Wallac大斑点计数器中测定。
在每一个实验中，按常规进行三份测定，并将数据平均化。特异性结合利用GraphPad Prism软件(Graphpad，San Diego)通过非线性回归拟合进行测定。IC50值利用PRISM来自于一个4参数的对数拟合，并利用Cheng & Prusoff方程式换算为Ki值；IC20值是从图中推断出来的。
实施例3闪烁亲近测定法闪烁亲近测定法(SPA)在由50mM Tris·Cl，10mM KCl，1.0mM到1.2mM MgCl2，pH7.4组成的测定缓冲液中，或者使用由50mM Tris碱，10mM KCl，pH7.4组成的测定缓冲液进行。评价珠子对膜的结合，以确定所用的细胞系的最佳珠子类型。YSi麦胚凝集素珠子被用于来自January HEK-293 hERG表达细胞系的细胞膜；YSi聚赖氨酸珠子被用于使用来自细胞系15(HEK-293 hERG表达细胞系)的膜的研究中。在描述ERG药理学特征之前，有关珠子和细胞膜匀浆的浓度条件被优化。温育液(对于96孔板每孔总共200μl，而对于384孔板每孔总共60μl)包括25μg细胞膜匀浆每mg珠子。膜匀浆用YSi麦胚凝集素或者YSi聚赖氨酸珠子悬液于4℃在滚轮振荡器上预偶联大约2小时。为进行竞争性结合测定，膜匀浆珠子悬液在白色透明底的96或384孔板中与5nM[3H]-多非利特在不存在或存在竞争物即测试化合物或测试化合物混合物的情况下温育。板在室温下温育，并振荡大约1小时。允许珠子静置最少30分钟，之后在TopCount NXT闪烁计数器上计数板上保留的放射性。非特异性结合即背景计数，通过添加10μM多非利特测定。背景计数通常小于总结合的15％。对于饱和度研究，[3H]-多非利特的特异性结合在一个浓度范围内(5到500nM)在不存在或存在冷(即未标记的)10μM多非利特的条件下测定。
实施例4测定的优化a)基于Hepes和基于Tris的缓冲液对多非利特结合的影响为优化多非利特对含ERG细胞膜匀浆的特异性结合，[3H]-多非利特与细胞膜制备物的相互作用在存在基于Hepes的缓冲液(25mM Hepes，135mM NaCl，5mM KCl，1mM MgSO4，50mM CaCl2，pH7.4)和基于Tris的缓冲液(50mM Tris·Cl，10mM KCl，1mM或1.2mM MgCl2)的条件下进行检测。这些缓冲液中特异性结合的比较揭示，在基于Tris和基于Hepes的缓冲液中的百分比特异性结合是类似的。不过，如表1所示，在基于Tris的缓冲液中特异性计数比在基于Hepes的缓冲液中所检测到的高两倍。
表1.基于Tris和基于Hepes的缓冲液对[3H]-多非利特结合表达hERG的细胞膜匀浆的比较效果缓冲液 25mM HEPES 自由酸，135mM 50mM Tris，10mM KClNaCl，5mM KCl，1mM MgSO4，50μM及1.0或1.2mM MgCl2CaCl2pH7.4室温pH7.4室温总结合(ccpm) 8510±669 19627±1189非特异性结合(ccpm) 321±27 315±23
特异性结合(ccpm) 8189 19312％特异性结合 9698总结合和非特异性结合数据代表在75μg/ml的蛋白浓度和平均6.7nM的[3H]-多非利特浓度时进行的两次测定中每份缓冲液分离液的14个单独孔的算术平均值±标准误差平均数。温育在室温下进行60分钟。ccpm＝每分钟的校正计数。
因此最大特异性结合窗口是能够实现的；实施例1到8中所用的测定缓冲液是Tris为基础的温育缓冲液(50mM Tris·Cl，10mM KCl，1mM MgCl2)。此外，还进行了优化用于过滤和SPA结合测定的细胞膜蛋白浓度和珠子浓度的实验。
b)饱和度结合作出时间曲线以确定结合活性的最佳温育时间。温育时间对于过滤结合和SPA测定是相似的。过滤结合测定在90分钟内达到平衡，SPA需要60分钟。过滤结合及闪烁亲近测定法中[3H]-多非利特与ERG的结合都是可饱和的，对于过滤结合KD为5.08±1.0nM，而对于96和384孔形式的闪烁亲近测定法KD值分别为8.9±0.6 nM和9.1±1.8nM(图1a-c，其中图1a显示过滤结合测定的结果，图1b是SPA96孔形式的结果，而图1c显示SPA384孔形式的结果)。这个数据的非线性曲线拟合表明结合是单一位点的。从过滤结合中获得的Bmax为7.4±0.7pmol[3H]-多非利特/mg蛋白(图1)。由于闪烁亲近测定法没有给出dpm(每分钟衰变数)值的精确测定，对SPA未引用Bmax。
c)SPA和过滤结合技术的比较SPA和过滤结合技术的比较显示了结果的精彩相关性。两种类型测定的亲和力值之间表现出精彩的相关性，并且化合物亲和力的数量级是相同的，如图2所示(比较从过滤结合及SPA结合测定中获得的pKi值的相互关系图)。
d)竞争性结合研究检测了一系列化合物，包括已知延长人QT间隔的hERG封阻剂，对[3H]-多非利特的竞争性取代。E4031、多非利特、特非那定、以及西沙必利产生了特异性结合的完全抑制，具有一系列总结于表2的计算的亲和力值。
表2.针对[3H]-多非利特HERG过滤和SPA结合测定的测试化合物的亲和力值化合物 过滤结合 SPA96 SPA384pKipKipKi多非利特 8.22±0.048.05±0.54 8.26±0.12E4031 7.82±0.037.81±0.05 7.89±0.11特非那定 7.53±0.097.75±0.07 7.72±0.41西沙必利 7.34±0.057.15±0.04 7.55±0.22格列本脲 ＜5 ＜5 ＜5D-甲磺胺心定 ＜5 ＜5 ＜5数据表达为pKi值(取代50％5nM[3H]-多非利特结合的竞争性配体的摩尔浓度的负对数)。数据是至少n＝3次实验的平均值。
实施例5化合物对人QT间隔延长效应的预测如图3所示，对于一系列化合物来说，利用本发明的测定方法从[3H]-多非利特结合竞争性取代中得到的IC20值和与人QT延长相关联的游离药物浓度相当，包括E-4031(图3a)、多非利特(图3b)、特非那定(图3c)和西沙必利(图3d)。对于每一种化合物，结合测定(过滤结合技术)以及hERG膜片钳测定中的多非利特结合抑制都和与人QT间隔延长相关联的游离药物浓度相比较(FulikiA，et al.(1994)Cardiovascular Pharmacol，23374-378；Van Haarst AD et al.(1998)Clin Pharmacol.Ther.64542-546；Honig PK，et al.(1993)J.A.M.A.2691513-1518)。
ERG膜片钳测定提供了通过ERG通道的电流的测量值，并显示了细胞中存在的离子通道的数目。不过，由于膜片钳研究(Walker，B.D.etal(1999)British J.Pharmacol 128，444-450)中所观察到的-通过许多已知具有在体内延长QT间隔倾向的hERG封阻剂所呈现的-状态依赖性封阻现象，配体结合测定提供了比hERG膜片钳技术更好的关于药物在体内的QT延长效应的指标(图3d)。
为评价一种化合物或化合物的混合物是否可能延长人心电图QT间隔，进行了以下步骤a)根据本发明进行结合测定，举例来说，象实施例2或实施例3所描述的那样，测试化合物或化合物混合物对ERG，优选hERG或cERG的亲和力；b)获得IC20值，例如象实施例2末尾所描述的那样；该IC20是真实或预测的会发生人QT延长的游离药物浓度；c)将IC20值与化合物在体内预期的治疗效果所需的游离药物浓度相比较。
如果化合物预期的治疗效果所需的游离药物浓度在本发明测定中化合物IC20值的10到30倍的范围之内，则该化合物非常可能导致人QT间隔的延长。
实施例6利用转染了cERG或hERG的HEK-293细胞中进行的多非利特结合测定的比较如实施例2所述利用转染了人ERF或者犬ERG的HEK 293细胞进行多非利特结合测定。结果示于图4，从中可以看出，犬和人ERG的多非利特IC50是相似的，分别为13.9nM和15.6nM。犬和人ERG的多非利特IC20值分别为1.92nM和2.15nM。
实施例7利用转染了cERG或hERG的HEK-293细胞进行的特非那定竞争性测定的比较利用特非那定作为测试化合物进行多非利特结合测定。瞬时转染的cERG HEK-293细胞膜(200μg/孔)，或者稳定的hERG HEK-293细胞膜(100μg/孔)与12种不同浓度的特非那定和5nM[3H]-多非利特在室温下温育90分钟。总结合及非特异性结合通过与10％DMSO和10μM未标记的多非利特在200μl的测定总体积中温育测量。膜用Packard单过滤器细胞收集器通过过滤收集，并测量放射性(cpm)。对cERG和hERG表达细胞膜样品各自进行两个饱和度实验。每个实验平行进行三份。图5显示了每种细胞类型的(cERG或hERG转染的)实验平均值，并表明cERG和hERG的特非那定IC50相似，分别为77.2nM和88.9nM。犬和人ERG的特非那定IC20值分别为10.7nM和12.3nM。
实施例8转染了cERG或hERG的HEK-293细胞中E4031竞争性测定的比较利用E4031作为测试化合物进行多非利特结合测定。瞬时转染的cERG HEK-293细胞膜(200μg/孔)，或者稳定的hERG HEK-293细胞膜(100μg/孔)与12种不同浓度的E4031和5nM[3H]-多非利特在室温下温育90分钟。总结合及非特异性结合通过与10％DMSO和10μM未标记的多非利特在200μl的测定总体积中温育测量。膜用Packard单过滤器细胞收集器通过过滤收集，并测量放射性(cpm)。对cERG和hERG表达细胞膜样品各自进行两个饱和度实验。每个实验平行进行三份。图6显示了每种细胞类型的(cERG或hERG转染的)实验平均值，并表明cERG和hERG的E4031 IC50相似，分别为27.3nM和35.4nM。犬和人ERG的E4031 IC20值分别为3.8nM和4.9nM。
当比较测试化合物的IC50(或IC20)值的时候，发现它们对于cERG和hERG是相似的。这表明hERG或cERG都可以用于本发明的测定，来预测人QT延长的发作。
实施例9进一步测定优化研究为进一步优化多非利特对含hERG细胞膜匀浆的特异性结合测定，以SPA测定形式利用以Tris为基础的含KCl或MgCl2的缓冲液研究[3H]-多非利特与细胞膜制备物的相互作用。SPA测定根据实施例3在作为测定缓冲液的50mM Tris·Cl，10mM KCl，pH7.4或者50mM Tris·Cl，1mM MgCl2，pH7.4中进行。测定利用多非利特或双苯丁胺作为测试化合物进行。在这些缓冲液条件中所检测到的特异性结合的比较揭示当所用的测定缓冲液为50mM Tris·Cl，1mM MgCl2，pH7.4时未观察到特异性结合；在由50mM Tris·Cl，10mM KCl，pH7.4组成的测定缓冲液观察到特异性结合。对于在作为测定缓冲液的50mM Tris·Cl，10mMKCl，pH7.4中进行的测定，得到了每个测试化合物的IC50和IC20。多非利特的平均IC50值为8.69±0.45nM，双苯丁胺的平均IC50值为1.87±0.00μM。多非利特的平均IC20值为1.2nM，双苯丁胺的平均IC20值为0.248μM。
序列表<110>辉瑞大药厂(CA，EP除了EP(GB)，JP，US.之外)辉瑞有限公司(EP(GB)).
<120>测定<130>PCS 22042<150>GB 0121440.2<151>2001-09-04<150>US 60/323973<151>2001-09-20<160>3<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>犬<400>1accacatcca ccaggcacag 20<210>2<211>25<212>DNA<213>pcDNA3.1(-)载体<400>2cccaagctgg ctagcgttta aacgg25<210>3<211>23<212>DNA<213>pSP73载体<400>3taatacgact cactataggg aga 2权利要求
1.一种测定方法，包括或由下列步骤组成a)将表达ERG的细胞、或者来自于ERG表达细胞的膜、或者来自于ERG表达组织的膜和标记的IKR封阻剂在测定缓冲液中，在存在或不存在测试化合物或者测试化合物混合物的条件下温育；b)测定特异性结合的标记的IKR封阻剂；c)计算测试化合物或者测试化合物混合物对标记IKR封阻剂结合的抑制。
2.根据权利要求1的测定方法，其中测定缓冲液是以Tris为基础的含有KCl的缓冲液。
3.根据权利要求2的测定方法，其中测定缓冲液包含或由30到100mM Tris·Cl、5到20mM KCl和可选地0.6到2.0mM MgCl2组成。
4.根据权利要求2的测定方法，其中测定缓冲液包含或由30到70mM Tris·Cl、6到15mM KCl和可选地0.6到1.6mM MgCl2组成。
5.根据权利要求2的测定方法，其中测定缓冲液包含或由40到60mM Tris·Cl、7.5到12.5mM KCl和可选地0.8到1.4mM MgCl2组成。
6.根据权利要求2的测定方法，其中测定缓冲液包含或由45到55mM Tris·Cl、8.5到11.5mM KCl和可选地0.9到1.3mM MgCl2或1.0到1.2mM MgCl2组成。
7.根据权利要求2的测定方法，其中测定缓冲液包含或由50mMTris·Cl和10mM KCl组成。
8.根据权利要求2的测定方法，其中测定缓冲液包含或由50mMTris·Cl、10mM KCl和1.0mM MgCl2；或者50mM Tris·Cl、10mM KCl和1.2mM MgCl2组成。
9.根据前述权利要求中任何一项的测定方法，其中测定缓冲液室温下pH是在7.2和7.6之间。
10.根据权利要求9的测定方法，其中测定缓冲液pH是7.4。
11.根据前述权利要求中任何一项的测定方法，其中ERG是人ERG。
12.根据前述权利要求中任何一项的测定方法，其中标记的IKR封阻剂是标记的多非利特或标记的MK-499。
13.根据权利要求12的测定方法，其中标记的多非利特或标记的MK-499是放射性标记的。
14.根据权利要求13的测定方法，其中放射性标记是氚(3H)。
15.根据前述权利要求中任何一项的测定方法，具有下列额外的步骤(d)计算测试化合物或测试化合物混合物的IC20，以及可选地，(e)将测试化合物或测试化合物混合物的IC20值与化合物在体内预期的治疗效果所需的浓度相比较。
16.根据前述权利要求中任何一项的测定方法，其中测定作为过滤结合测定进行。
17.根据权利要求1至15中任何一项的测定方法，其中测定作为闪烁亲近测定法进行。
全文摘要
本发明涉及利用标记的内部校正钾通道(IKR)的封阻剂确定化合物在“ether－a－go－go”(ERG)钾(K
文档编号G01N33/68GK1708689SQ02818592
公开日2005年12月14日 申请日期2002年9月4日 优先权日2001年9月4日
发明者P·M·格林格拉斯, M·斯图尔特, C·M·伍德 申请人:辉瑞大药厂