专利名称：孕早期唐氏综合征产前筛查试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于唐氏综合征产前筛査的试剂盒。
技术背景-
唐氏综合征(Down' s syndrome, DS),又称21三体综合征或先天愚型，是 人类最常见的一种染色体疾病，也是造成先天智力低下的主要原因，该病的临床 主要表现为严重的智力低下，独特的面部和身体畸形(如宽眼距，低鼻梁，肌 无力，肢体短小及通贯手等)，先天性心脏病，消化道畸形等；按比例计算，其 出生率约占活产新生儿的l/600 l/800;此外，与一般的基因病(如常染色体 显/隐性遗传，或性染色体显/隐性遗传)不同，DS这类染色体病是偶发的，每 个孕妇都有一定的危险性，而且一般没有种族或家族积聚的现象。
唐氏综合征的患儿多数寿命较短，生活自理性差，给家庭和社会造成极大的 经济负担和精祌压力。近年来随着环境污染加重，该病有上升的趋势。目前尚缺 乏有效的治疗手段，只有通过产前诊断，终止妊娠，才能达到优生的目的。由于 DS的产前诊断必须依靠侵入性的基因诊断技术如羊膜腔穿刺取羊水细胞进行遗 传学检查、绒毛活检等，而侵入性操作可导致1% 2%的流产率，且有羊膜腔束 带综合征，截肢损伤等副作用，此外产前诊断技术要求及所需费用高，而DS的 发生率毕竟为1.5%左右，因此不可能对每位孕妇都进行诊断。所以，这就需要 通过产前筛查来提高产前诊断的效率。

发明内容
本法发明的目的是提供一种操作简单、灵敏度高、特异性好、无污染的孕早 期唐氏综合征产前筛查试剂盒。主要解决现有侵入性的基因诊断技术容易导致流 产的技术问题。
为实现上述目的，本发明通过以下方案实施 一种孕早期唐氏综合征产前筛查试剂盒，其特征在于试剂盒由PAPP-A (妊娠
相关血浆蛋白A)包装盒、fhCGP (游离人绒毛膜促性腺激素l3亚单位)包装盒，所述PAPP-A包装盒内有PAPP-A校准品、PAPP-A单克隆抗体包被板条、PAPP-A
铕标记物、分析缓冲液、荧光增强液、浓縮洗液、样本稀释液、板架组成；所述
fhCGe包装盒内有fhCGe校准品、fhCG p单克隆抗体包被板条、fhCGe铕标记
物、分析缓冲液、荧光增强液、浓縮洗液、板架组成。
所述PAPP-A、 fhCGP单克隆抗体包被板条的制备方法将PAPP-A或fhCGP单 克隆抗体以碳酸盐缓冲液稀释适当比例后加入微孔板内，过夜后洗涤、封 闭、干燥，而后将包被板条装入铝箔袋内，冷藏备用。 所述PAPP-A、 fhCGe铕标记物的制备方法将PAPP-A或fhCGe单克隆抗体 以碳酸盐缓冲液透析后与DTTA-Eu(Nl-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙 酸铕钠)以3: 1比例混合，静置24小时，后经S印hacryl S-200(聚丙烯 酰胺葡聚糖S-200)分离柱分离DTTA-Eu与Ab-Eu (铕标记抗体)，获得铕 标记过的单克隆抗体。
所述PAPP-A、 fhCGP校准品的制备方法将PAPP-A浓度为80000 mlU/L溶液以 稀释液稀释至10、 40、 200、 800、 2000mIU/L，以0. 5ml装量冻干即可。将fhCG e浓度为100000ng/mL溶液稀释成2、 5、 20、 100、 200ng/mL，以0. 5ml装量冻 干即可。
所述荧光增强液的配制方法，以无水乙醇溶解e-NTA (e-萘酰三氟丙酮)、TOPO (三辛基氧化膦)，再加邻苯二甲酸氢钾和三蒸水，40°(:溶解后，加入乙酸、1>".加 x-ioo (壬-(乙二醇)苯辛基醚)，调ra值至3.2，并定容。
所述使用方法包括以下步骤
fhCGe测定
A. 使用前将浓縮洗液以蒸馏水按1: 25 (体积比)稀释，加入洗板机洗涤瓶中。
B. 每瓶校准品中精确加入O. 5ml蒸馏水，轻摇混匀，室温(+20°C +25°C)放置
30分钟。
C. 将分析缓冲液、待测样品、校准品和所需数量的微孔反应板条平衡至室温(+20
°C +25°C)。
D. 使用前一小时内，根据所需用量以分析缓冲液将铕标记物稀释50倍。
E. 在微孔底部依次加入lOw 1校准品(双孔)或待测样品。
4F. 将稀释后的铕标记物按200U 1/微孔加入(弃去第一次溶液)。
G. 于室温(+20°C +25°C)下于慢档振动60分钟(士5分钟)。
H. 以洗液洗涤各板条6次，洗涤后若有少量液体残留，将板条在干净无尘的吸水
纸上拍干。
I. 采用干净的专用取样头移取增强液，按200yl/微孔加入(弃去第一次溶液)，
于慢档振动5分钟。 J.选择相应程序测量荧光，荧光测量仪将自动处理数据并打印分析结果。
PAPP-A测定
A. 使用前将浓縮洗液以蒸馏水按l: 25 (体积比)稀释，加入洗板机洗涤瓶中。
B. 每瓶校准品以及铕标记物中精确加入0. 5ml蒸馏水，轻摇混匀，室温(+20°C
+25°C)放置30分钟。
C. 将分析缓冲液、待测样品、校准品和所需数量的微孔反应板条平衡至室温(+20
。C +25。C)。
D. 以样本稀释液将样本稀释5倍，即40u 1样本+160ii 1样本稀释液，充分混匀。
E. 使用前一小时内，根据所需用量以分析缓冲液将铕标记物稀释20倍，g[』在950
y 1分析缓冲液中加入50 y 1铕标记物。
F. 在微孔底部依次加入50 y 1校准品(双孔)或稀释后待测样品。
G. 将稀释后的铕标记物按100y 1/微孔加入(弃去第一次溶液)。
H. 于室温(+20°C +25°C)下于慢档振动60分钟(士5分钟)。
I. 以洗液洗涤各板条6次，洗涤后若有少量液体残留，将板条在干净无尘的吸水
纸上拍干。
J.采用干净的专用取样头移取增强液，按150u 1/微孔加入(弃去第一次溶液)，
于慢档振动5分钟。 K.选择相应程序测量荧光，荧光测量仪将自动处理数据并打印分析结果
本发明试剂盒具有以下优点1、 以DTTA-Eu为标记物，采用时间分辨荧光检测的方式，使检测灵敏度更高；
2、 以PAPP-A、 fhCGe作为孕早期筛査唐氏综合征的生化指标，更早的实现了产 前筛查，为产前诊断提供了更多的时间。
具体实施例方式
一种孕早期唐氏综合征产前筛查试剂盒，包括PAPP-A包装盒、fhCGP包装 盒，所述PAPP-A包装盒内有PAPP-A校准品、PAPP-A单克隆抗体包被板条、PAPP-A 铕标记物、分析缓冲液、荧光增强液、浓縮洗液、样本稀释液、板架组成；所述 fhCGP包装盒内有fhCGP校准品、fhCGP单克隆抗体包被板条、fhCGe铕标记 物、分析缓冲液、荧光增强液、浓縮洗液、板架组成。
所述PAPP-A、 fhCGP单克隆抗体包被板条的制备将PAPP-A或fhCGe单克隆 抗体以碳酸盐缓冲液稀释适当比例后加入微孔板内，过夜后洗涤、封闭、 千燥，而后将包被板条装入铝箔袋内，冷藏备用。
所述PAPP-A、 fhCGP铕标记物的制备将PAPP-A或fhCGf3单克隆抗体以碳 酸盐缓冲液透析后与DTTA-Eu以3: 1比例混合，静置24小时，后经 S印hacryl S-200分离柱分离DTTA-Eu与Ab-Eu，获得铕标记过的单克隆 抗体。
所述PAPP-A、 fhCGP校准品的制备将PAPP-A浓度为80000 mlU/L溶液以稀释 液稀释至10、 40、 200、 800、 2000mlU/L，以0. 5ml装量冻干即可。将fhCG J3浓 度为100000ng/mL溶液稀释成2、 5、 20、 100、 200ng/mL，以0. 5ml装量冻干即 可。
所述荧光增强液的配制，以无水乙醇溶解e-NTA 、 TOPO，再加邻苯二甲酸氢钾 和三蒸水，4(TC溶解后，加入乙酸、Triton X_100，调PH值至3.2，并定容。 所述使用方法包括以下歩骤 fhCGP测定
A. 使用前将浓縮洗液以蒸馏水按1 :25 (体积比)稀释，加入洗板机洗涤瓶中。
B. 每瓶校准品中精确加入0.5ml蒸馏水，轻摇混匀，室温(+20°C +25°C)放置
30分钟。
C. 将分析缓冲液、待测样品、校准品和所需数量的微孔反应板条平衡至室温(+20°C +25°C)。
D. 使用前一小时内，根据所需用量以分析缓冲液将铕标记物稀释50倍。
E. 在微孔底部依次加入IOU 1校准品(双孔)或待测样品。
F. 将稀释后的铕标记物按200y 1/微孔加入(弃去第一次溶液)。
G. 于室温(+20°C +25°C )下于慢档振动60分钟(±5分钟)。
H. 以洗液洗涤各板条6次，洗涤后若有少量液体残留，将板条在干净无尘的吸水
纸上拍干。
I. 采用干净的专用取样头移取增强液，按200yl/微孔加入(弃去第一次溶液)，
于慢档振动5分钟。 J.选择相应程序测量荧光，荧光测量仪将自动处理数据并打印分析结果。 PAPP-A测定
A. 使用前将浓縮洗液以蒸馏水按l: 25 (体积比)稀释，加入洗板机洗涤瓶中。
B. 每瓶校准品以及铕标记物中精确加入0. 5ml蒸馏水，轻摇混匀，室温(+20°C
+25°C)放置30分钟。
C. 将分析缓冲液、待测样品、校准品和所需数量的微孔反应板条平衡至室温(+20
。C +25。C)。
D. 以样本稀释液将样本稀释5倍，即40u 1样本+160u 1样本稀释液，充分混匀。
E. 使用前一小时内，根据所需用量以分析缓冲液将铕标记物稀释20倍，B卩在
950 ti 1分析缓冲液中加入50 u 1铕标记物。
F. 在微孔底部依次加入50 y 1校准品(双孔)或稀释后待测样品。
G. 将稀释后的铕标记物按100" 1/微孔加入(弃去第一次溶液)。
H. 于室温(+20°C +25°C)下于慢档振动60分钟(士5分钟)。
I. 以洗液洗涤各板条6次，洗漆后若有少量液体残留，将板条在干净无尘的吸水
纸上拍干。
J.采用干净的专用取样头移取增强液，按150u 1/微孔加入(弃去第一次溶液)，
于慢档振动5分钟。 K.选择相应程序测量荧光，荧光测量仪将自动处理数据并打印分析结果。
权利要求
1.一种孕早期唐氏综合征产前筛查试剂盒，其特征是试剂盒由妊娠相关血浆蛋白A校准品、妊娠相关血浆蛋白A单克隆抗体包被板条、妊娠相关血浆蛋白A铕标记物、游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位校准品、游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体包被板条、游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位铕标记物、分析缓冲液、荧光增强液、浓缩洗液、样本稀释液、板架组成。
2. 根据权利要求i所述的孕早期唐氏综合征产前筛查试剂盒，其特征是所述妊娠相关血浆蛋白a、游离人绒毛膜促性腺激素e亚单位单克隆抗体包被板条的获得:将妊娠相关血浆蛋白a或游离人绒毛膜促性腺激素e亚单位单克 隆抗体以碳酸盐缓冲液稀释适当比例后加入微孔板内，过夜后洗涤、封 闭、干燥，而后将包被板条装入铝箔袋内，冷藏备用。
3. 根据权利要求1所述的孕早期唐氏综合征产前筛查试剂盒，其特征是所述妊娠相关血浆蛋白a、游离人绒毛膜促性腺激素e亚单位铕标记物的获得将妊娠相关血浆蛋白a或游离人绒毛膜促性腺激素e亚单位单克隆抗体以 碳酸盐缓冲液透析后与N1-(p-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠以 适当比例混合，静置 一段时间后经聚丙烯酰胺葡聚糖S-200分离柱分离 Nl-(p-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠与铕标记抗体，获得铕标记过的单克隆抗体。
4. 根据权利要求1所述的孕早期唐氏综合征产前筛查试剂盒，其特征是所述妊娠相关血浆蛋白a、游离人绒毛膜促性腺激素e亚单位校准品的获得分 别将妊娠相关血浆蛋白a、游离人绒毛膜促性腺激素e亚单位高浓度溶液以稀释液稀释至所需浓度，以0. 5ml装量冻干即可。
5. 根据权利要求1所述的孕早期唐氏综合征产前筛查试剂盒，其特征是所述 荧光增强液的获得以无水乙醇溶解e-萘酰三氟丙酮、三辛基氧化膦，再加邻苯二甲酸氢钾和三蒸水，4crc溶解后，加入乙酸、壬-(乙二醇)苯辛基醚， 调ra值至3.2，并定容。
全文摘要
本发明目的在于提供一种孕早期唐氏综合征的产前筛查试剂盒，试剂盒由PAPP-A校准品、PAPP-A单克隆抗体包被板条、铕标记PAPP-A单克隆抗体、fhCGβ校准品、fhCGβ单克隆抗体包被板条、铕标记fhCGβ单克隆抗体、分析缓冲液、荧光增强液、浓缩洗液、样本稀释液、板架组成，应用铕标记与时间分辨免疫荧光定量检测技术，结合时间分辨荧光检测仪，定量检测血清中的PAPP-A和fhCGβ，采用产前筛查软件对检测结果进行分析，从而得到风险率，实现孕早期筛查唐氏综合征的目的。本发明适合产前筛查使用。
文档编号G01N33/74GK101614750SQ20081004355
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者吴冯波, 蒋云霞 申请人:上海新波生物技术有限公司