专利名称：一种基于压电传感器检测致病菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测致病菌的方法，尤其是一种基于压电传感器检测致病菌的 方法。
背景技术：
1982 年大肠杆菌 0157:H7 (Enterohemorrhagic Escherichiacoli, EHEC)首次在美
国分离并确认为一种新型的肠道致病菌。它是肠出血性大肠杆菌的一个主要菌型，可引 起人类腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征(uremic syndrome hemolytic，HUS)和血 栓形成性血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura，TTP)，个别患者可因急性或慢性
肾功能衰竭而死亡，病死率高达30%以上，是全球关注的世界性公共卫生问题。由该菌 引起的食物中毒已在世界范围内多次出现，1996年日本发生了世界上规模最大、涉及上 万人的由出血性大肠杆菌0157:Η7引起的食物中毒。我国自1986年在徐州发现感染病 人，已在全国其它城市分离到了大肠杆菌0157:Η7，而且据报道食入不足10个大肠杆菌 0157 7即可引起致病。传统的大肠杆菌0157:Η7等致病菌的检测方法主要包括山梨醇麦康凯琼脂分离 培养法，生化方法等，这些方法大多操作步骤繁琐，且耗时较长。随着科学技术的发 展，出现了一些新兴检测方法，如PCR法，ELISA法，免疫磁珠分离法，流式细胞仪法 及基因芯片法等，这些方法同样也存在着仪器昂贵，操作复杂，费时等缺点。随着科技的发展，生物传感器以其灵敏度高、分析速度快、成本低等优点开始 广泛用于大肠杆菌0157:Η7等致病菌的检测研究。压电传感器作为生物传感器的一个 重要分支，在大肠杆菌0157:Η7等致病菌的检测方法中也开展了广泛的研究。压电传 感器(Piezoelectric biosensor)是20世纪60年代建立起来的一种新型测量技术，其检测 的理论基础是固载在晶体表面的沉积物质量与晶体频率变化存在着一定的比例关系，即 Sauerbrey 方禾呈AF = -2.26X IO^6F2 Am/A,式中，F为石英晶体天然谐振频率(Hz) ； Am为 沉积在晶体表面的质量变化(g) AF为晶体频率的变化(Hz) ； A为参与晶振的面积 (cm2)；负号表示质量的增加导致频率的下降。但是目前单纯利用压电传感器进行大 肠杆菌0157:H7的检测，其灵敏度一般为105Cfu/ml。学者为了提高压电传感器的检测 灵敏度，分别借助纳米等技术对压电传感器的检测信号进行放大，使得灵敏度提高到了 IOWml0然而这还是不能达到对大肠杆菌0157:H7的检测要求。其他致病菌亦是如此，通过有效的检测方法，提高灵敏度，达到并优化致病菌 的检测要求，具有非常重要的实践意义。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于压电传感器检测致病菌的方去。。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是本发明通过借助信标免疫纳米磁颗粒和金生长技术对压电传感器的检测信号进 行多级放大，从而达到对致病菌的超灵敏检测。所述信标免疫纳米磁颗粒是指纳米磁颗 粒上同时连接能够捕获目标菌的抗体(目标抗体)和用于对检测信号进行放大的抗体(信 标抗体)。具体实现方法如下一种基于压电传感器检测致病菌的方法，具体步骤为(1)制备信标免疫纳米磁颗粒；(2)制备亲和素标记胶体金；(3)制备金生长液，确定亲和素标记胶体金在金生长液中的生长时间；(4)压电传感器的检测取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的致病菌的菌悬液中，通过超强磁 的吸引去除非目标菌；将制备好的亲和素标记胶体金加入，通过生物素-亲和素系统将 胶体金结合到信标免疫纳米磁颗粒上；将连接有信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体 金的致病菌加入金生长液中，按照步骤(3)确定的生长时间使胶体金得到生长放大，收 集该液体滴加至固定有SPA和致病菌鼠单克隆抗体并用牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异 性位点的压电传感器的石英晶振上，观察压电传感器频率的变化确定待检测样本中致病 菌的浓度。优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，具体步骤为(1)制备信标免疫纳米磁颗粒采用化学共沉淀法制备粒径为IOnm 200nm的纳米磁颗粒，将采用SPA亲和纯 化的致病菌兔多克隆抗体(目标抗体)和相同浓度的生物素标记的兔IgG(信标抗体)按 体积比为1 60混勻后，取混合抗体连接到纳米磁颗粒上制成信标免疫纳米磁颗粒；(2)制备亲和素标记胶体金胶体金采用柠檬酸钠还原法制备粒径为10nm-20nm的胶体金，将浓度为0.2mg/ mL-1.0mg/mL的亲和素连接至胶体金上，即为亲和素标记胶体金；(3)制备金生长液，确定亲和素标记胶体金在金生长液中的生长时间取氯金酸溶液加入十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶液中混勻，然后置于 100°C水浴锅中加热lOmin，颜色变为清亮的黄色，室温下冷却备用；在加入亲和素标记 胶体金溶液之前加入抗坏血酸(AA)溶液轻轻混勻，金生长液颜色即消失；取不同浓度 的亲和素标记胶体金溶液于金生长液中进行自生长，利用紫外分光度度计进行波长扫描 确定胶体金在金生长液中的生长时间；(4)压电传感器的检测①石英晶振用piranha液进行洗涤，取SPA溶液固定于压电传感器的石英晶振， 取致病菌鼠单克隆抗体溶液固定于压电传感器的石英晶振，检测频率变化，确定致病菌 鼠单克隆抗体的固定浓度和时间；②取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的致病菌的菌悬液中，通过超强 磁的吸引去除非目标菌；再借助膜将多余的信标免疫纳米磁颗粒离心去除；将步骤(2) 中制备好的亲和素标记胶体金加入，通过生物素_亲和素系统将胶体金结合到信标免疫纳米磁颗粒上，然后借助超强磁将未结合的亲和素标记胶体金去除；最后将连接有信标 免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的致病菌加入金生长液中，按照步骤(3)确定的生 长时间使胶体金得到生长放大，继续用超强磁将多余的金生长液去除；③按上述步骤(4)①确定的固定浓度和固定时间分别将SPA和致病菌鼠单克隆抗 体固定于压电传感器的石英晶振上，并用牛血清白蛋白(BSA)封闭石英晶振上非特异性 位点，将步骤(4)②中最后收集到的液体滴加至石英晶振上，观察压电传感器频率的变 化确定待检测样本中致病菌的浓度。在检测致病菌的过程中，只需更换目标抗体和固定在压电传感器电极上的抗体 即可。优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，所述致病菌所述致病菌为大 肠杆菌0157:H7、沙门氏菌或嗜肺军团菌等。优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，所述致病菌为大肠杆菌 0157:H7。优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，当致病菌为大肠杆菌 0157:H7时，具体检测方法为(1)制备信标免疫纳米磁颗粒采用化学共沉淀法制备粒径为IOnm 200nm的纳米磁颗粒，将采用SPA亲和纯 化的浓度为0.5mg/mL大肠杆菌0157:H7兔多克隆抗体(目标抗体)和相同浓度的生物素 标记的兔IgG(信标抗体)按体积比为1 60混勻后，取每0.3mL混合抗体连接到ImL 纳米磁颗粒上制成信标免疫纳米磁颗粒；(2)制备亲和素标记胶体金胶体金采用柠檬酸钠还原法制备，制备粒径为18nm的胶体金，将浓度为0.5mg/ mL的亲和素连接至胶体金上，即为亲和素标记胶体金；(3)制备金生长液，确定亲和素标记胶体金在金生长液中的生长时间取52 μ 1 0.024Μ氯金酸溶液加入5ml 0.1M十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶 液中混勻，然后置于100°c的水浴锅中加热lOmin，颜色变为清亮的黄色，室温下冷却备 用；在加入亲和素标记胶体金溶液之前加入50 μ IlM抗坏血酸(AA)溶液轻轻混勻，金生 长液颜色即消失；取100 μ 1的亲和素标记胶体金溶液于900 μ 1金生长液中进行自生长， 即待生长的亲和素标记胶体金溶液与金生长液的体积比为1 9，其中亲和素标记胶体 金溶液的浓度为对步骤(2)中亲和素标记胶体金进行对倍稀释，即1/2、1/4和1/8的浓 度，利用紫外分光度度计进行波长扫描观察胶体金在金生长液中的生长时间为15min;(4)压电传感器的检测①石英晶振用piranha液进行洗涤，取浓度为0.2mg/mL 2.0mg/mL的SPA溶 液10 μ 1固定于压电传感器的石英晶振10 90min，取浓度为O.lmg/mL 1.8mg/mL的 大肠杆菌0157:H7鼠单克隆抗体溶液10 μ 1固定于压电传感器的石英晶振10 90min ；②取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的大肠杆菌0157:H7的菌悬液 中，通过超强磁的吸引去除非目标菌；再通过0.45 μ m的膜将多余的信标免疫纳米磁颗 粒离心去除；将制备好的亲和素标记胶体金溶液加入，通过生物素-亲和素系统将胶体 金结合到信标免疫纳米磁颗粒上，然后借助超强磁将未结合的亲和素标记胶体金去除；最后将连接有信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的大肠杆菌0157:H7加入金生长 液中，按照步骤(3)确定的生长时间使胶体金得到生长放大，继续用超强磁将多余的金 生长液去除；③按上述步骤(4)①的固定浓度和固定时间分别将SPA和大肠杆菌0157:H7鼠 单克隆抗体固定于压电传感器的石英晶振上，并用牛血清白蛋白(BSA)封闭石英晶 振上非特异性位点；将步骤(4)②中最后收集到的液体滴加至石英晶振上，观察压电传 感器频率的变化确定待检测样本中大肠杆菌0157:H7的浓度。优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，所述步骤(1)中的纳米磁颗 粒粒径约为50nm，连接的大肠杆菌0157:H7兔多克隆抗体的浓度为0.5mg/mL ；步骤⑵ 中亲和素的连接量为14μ g/ml。优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，所述步骤(4)中SPA的固定 浓度和时间为1.2mg/ml、40min ；大肠杆菌0157:H7鼠单克隆抗体的固定浓度和时间为 1.0mg/ml、60min。本发明的有益效果是上述基于压电传感器检测致病菌的方法，通过抗原抗体反应(信标免疫纳米磁 颗粒)、生物素_亲和素系统(亲和素标记胶体金)和金的自生长技术(金生长液)，对 压电免疫传感器的检测信号进行了多级放大，使得本发明的检测灵敏度得到了最大限度 提高，其检测大肠杆菌0157:H7的灵敏度达到了 23CFU/ml，该方法具有灵敏度高，特异 性强、操作简便快速等特点，而且只要更换检测过程中涉及的抗体就可以检测不同的微 生物，在微生物的检测领域具有广阔的应用前景。


图1为不同体积比的大肠杆菌0157:H7信标免疫纳米磁颗粒回收率的测定图 谱；图2为SPA对传感器频率变化的影响图谱，其中a浓度、b时间；图3为大肠杆菌0157:H7鼠单克隆抗体对传感器频率变化的影响图谱，其中a浓 度、b时间；图4为大肠杆菌0157:H7菌悬液浓度与频率变化关系图谱，其中a高浓度、b低 浓度；图5为本发明所述检测方法检测大肠杆菌0157:H7的流程图。
具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方 式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。实施例1大肠杆菌0157:H7纯菌悬液的检测(1)信标免疫纳米磁颗粒①纳米磁颗粒的制备将0.7mol/L的FeCl3 · 6H20水溶液16mL与1.6mol/L FeCl2 · 4H20水溶液4mL混合，在氮气条件下，加入IOg葡聚糖T_40，混勻，60°C，水浴20min，在2000rpm的搅拌下，20min内，向混合液中滴加5mol/L的氨水40mL， 温度保持60°C，并始终通氮气，制成悬液；然后用去离子水透析24h，离心管离心， 2100rpm, 15min,保留上清(阻氧避光保存)，所制备的纳米磁颗粒粒径约为50nm ；②信标免疫纳米磁颗粒的制备游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶 层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH为7.4的O.Olmol/L磷酸盐缓冲 液，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为Smg/mL ；取葡聚糖纳米 磁颗粒悬液l.OmL，加入20mmol/LNaIO4水溶液0.25mL，150转/分钟避光阻氧震荡6h 后，力卩入2mol/L乙二醇的水溶液0.21mL终止氧化，pH为7.4的O.Olmol/L磷酸盐缓冲液 4°C透析24h，去除过量的NaIO4,使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5.5mg/mL ；取SPA 亲和纯化的大肠杆菌0157:H7兔多克隆抗体(中国公共卫生，2005; 21(6) 705-6)和 生物素化兔IgGCBBI生物公司购买)分别按体积比为1 O、1 5、1 10、1 20、
1 40、1 60、1 80和1 100的比例混合，抗体混合溶液的总体积为0.3ml，两种 抗体的浓度均为0.5mg/mL，将混合好的抗体溶液加入到步骤(1)②中的ImL纳米磁颗粒 中，混勻后，放入4°C冰箱过夜(避光)，次日，在上述溶液中加入BSA(终浓度为1%) 进行封闭，过夜，置4°C冰箱备用；③信标免疫纳米磁颗粒回收率的测定分别取20 μ 1步骤(1)②中制备的不同 体积比的大肠杆菌0157:Η7信标免疫纳米磁颗粒加入浓度为8.1X102CFU/ml的大肠杆菌 0157:H7菌悬液中，于室温下孵育15min，借助超强磁将溶液浓缩至100 μ 1 ；将此100 μ 1 溶液转移至远藤平板(BD公司产品)均勻涂布后于37°C下培养24h后计数，并将此计数 结果除以大肠杆菌0157:H7菌液的原始浓度即为信标免疫纳米磁颗粒的回收率，如图1所 示，综合考虑信标免疫纳米磁颗粒的回收率及信标抗体的后期信号放大作用，确定信标 免疫纳米磁颗粒的目标抗体与信标抗体的最佳比例为体积比1 60，且此信标免疫纳米 磁颗粒在保存1年后，其回收率基本不变。(2)亲和素标记胶体金取2.0mL的1 %氯金酸加入198mL超纯水，于沸水浴中加热IOmin ；然后迅速 加入5mL的柠檬酸三钠溶液，继续加热15min;当胶体金颜色变为葡萄酒红色时，继 续加热lOmin，冷却后用透射电镜观察其粒径大小约为18nm。用0.2% K2CO3调pH值 为6.5。利用分光光度计法测得稳定胶体金最适亲和素量为14 μ g/mL。取调好pH值的 胶体金25ml，加入浓度为0.5mg/mL的亲和素0.7ml，缓慢搅拌lOmin，加入牛血清白蛋 白(BSA)，使其终浓度为1%，继续搅拌IOmin以上。将上述初步制得的胶体金探针以 4000rpm离心20min，收集上清以IOOOOrpm 4°C离心60min ；丢弃上清，留下管底为暗红 色疏松状沉淀，沉淀用0.005mo 1/L pH为7.6的PB缓冲液(含1 % BSA, 0.02% NaN3) 重新悬浮，再同前离心洗涤一次。最后将沉淀用同前的pH为7.4的O.Olmol/L磷酸盐缓 冲液悬浮，置4°C冰箱保存备用；(3)金生长液取52 μ 1 0.024Μ氯金酸溶液加入5ml 0.1M十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶 液中混勻，然后置于100°c下的水浴锅中加热lOmin，颜色变为清亮的黄色，室温下冷却 备用；在加入胶体金溶液之前加入50 μ 1 IM抗坏血酸(AA)溶液轻轻混勻，金生长液颜 色即消失，此即为金生长液。
(4)压电传感器的检测①先将石英晶振用piranha液(浓H2S04/H2023/1，现用现配)进行洗涤，再用无 水乙醇和超纯水洗涤，每次5min，重复3次；石英晶振在固定物质之前在气相中进行基 础频率检测，固定物质之后进行洗涤，氮气吹干IOmin后在气相中进行频率检测，频率 变化稳定在士 IHz间时计数；取0.2-2.0mg/ml的SPA溶液10 μ 1滴加于石英晶振上，常温 下固定10-90min，按上述步骤进行洗涤后取0.2-2.0mg/ml的大肠杆菌0157:H7鼠单克隆 抗体溶液(专利申请号200810053955.8) 10 μ 1滴加于石英晶振上，37°C下固定10_90min， 洗涤后用1%BSA封闭，用压电传感器检测频率做为基频，根据图2和图3可确定SPA 的最佳固定浓度与时间为1.2mg/ml和40min，大肠杆菌0157:H7鼠单克隆抗体的最佳固 定浓度与时间为1.0mg/ml和60min ；②取20 μ 1信标免疫纳米磁颗粒加入Iml梯度稀释后的的大肠杆菌0157:Η7菌悬 液(9.2 X IOi-AZX 106CFU/ml)和沙门氏菌的菌悬液(7.8 X IO1-Tj X 106CFU/ml)中，轻 轻混勻后，于室温下孵育15mim，借助超强磁将溶液浓缩至100 μ 1 ；利用带0.45 μ m滤 膜的离心管(ultrafree-MC microcentrifuge filters, Sigma 公司)1500rpm 离心 IOmin 将多余
的信标免疫纳米磁颗粒去除；加入10 μ 1亲和素标记胶体金，37°C下孵育20min，用超强 磁去除未结合的亲和素标记胶体金，并将溶液定容到100 μ 1 ；将上述100 μ 1溶液加入到 90(^1的金生长液中反应151^11;再借助超强磁将多余的金生长液去除，最后将溶液定容 至Ij 10 μ 1 ；③将步骤(4)②中最后得到的10 μ 1溶液滴加到步骤(4)①中已修饰好的石英 晶振上，并将石英晶振于37°C下反应60min后，洗涤后进行频率的测定，其检测结果见 图4，可知压电免疫传感器经过信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金对检测信号进行 了多级放大，大肠杆菌0157:H7菌检测限达到了 23CFU/ml，整个检测过程控制在4h之 内。实施例2大肠杆菌0157:H7纯菌悬液的检测(1)信标免疫纳米磁颗粒①纳米磁颗粒的制备将0.7mol/L的FeCl3 · 6H20水溶液16mL与1.6mol/L FeCl2 · 4H20水溶液4mL混合，在氮气条件下，加入4g葡聚糖T_40，混勻，60°C，水浴 20min,在2000rpm的搅拌下，20min内，向混合液中滴加5mol/L的氨水40mL，温度保 持60°C，并始终通氮气，制成悬液；然后用去离子水透析24h，离心管离心，2100rpm， 15min,保留上清(阻氧避光保存)，所制备的纳米磁颗粒粒径约为200nm，按此方法制 备的纳米磁颗粒较易产生聚集，保存时间约1个月左右。②③同实施例1，制备的信标免疫纳米磁颗粒的回收率最高为52%。(2) (3) (4)同实施例1，最后检测大肠杆菌0157:H7菌灵敏度为172CFU/ml。实施例3大肠杆菌0157:H7纯菌悬液的检测(1)信标免疫纳米磁颗粒①纳米磁颗粒的制备将0.7mol/L的FeCl3 · 6H20水溶液16mL与1.6mol/L FeCl2 · 4H20水溶液4mL混合，在氮气条件下，加入4g葡聚糖T_40，混勻，60°C，水浴20min，在500rpm的搅拌下，20min内，向混合液中滴加5mol/L的氨水40mL，温度保 持60°C，并始终通氮气，制成悬液；然后用去离子水透析24h，离心管离心，2100rpm， 15min,保留上清(阻氧避光保存)，所制备的纳米磁颗粒粒径约为lOrnn。②③同实施例1，制备的信标免疫纳米磁颗粒的回收率最高为63%。(2) (3) (4)同实施例1，最后检测大肠杆菌0157:H7菌灵敏度为120CFU/ml。实施例4(1)沙门氏菌纯菌悬液的检测①游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗 粒分离，洗脱平衡液为pH7.4的O.Olmol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒冷冻干燥，使葡 聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/mL;取葡聚糖纳米磁颗粒悬液l.OmL，加入20mmol/ LNaIO4水溶液0.25mL，150转/分钟避光阻氧震荡6h后，加入2mol/L乙二醇的水溶液 0.21mL终止氧化，pH 7.4的O.Olmol/L磷酸盐缓冲液4°C透析24h，去除过量的NaIO4, 使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5.5mg/mL ；②取SPA亲和纯化的沙门氏菌兔多克隆抗体(中国公共卫生，2005 ； 21(6) 705-6)和生物素化兔IgGCBBI生物公司购买)按体积比为1 60比例混合，抗体混合溶 液的总体积为0.3ml，两种抗体的浓度均为0.5mg/mL，将混合好的抗体溶液加入到步骤 (1)①中的ImL纳米磁颗粒中，混勻后，放入4°C冰箱过夜(避光)，次日，在上述溶液 中加入BSA(终浓度为1%)进行封闭，过夜，置4°C冰箱备用。其余步骤同实施例1。(4)压电传感器的检测①先将石英晶振用piranha液(浓H2S04/H2023/1，现用现配)进行洗涤，再用无 水乙醇和超纯水洗涤，每次5min，重复3次；石英晶振在固定物质之前在气相中进行基 础频率检测，固定物质之后进行洗涤，氮气吹干IOmin后在气相中进行频率检测，频率 变化稳定在士 IHz间时计数；取1.2mg/ml的SPA溶液ΙΟμΙ滴加于石英晶振上，常温下 固定40min ；按上述步骤进行洗涤后取l.Omg/ml的沙门氏菌鼠单克隆抗体溶液(AB公司 沙门氏菌鼠单克隆抗体，货号为abl3628) 10yl滴加于石英晶振上，37°C下固定60min， 洗涤后用BSA封闭，用压电传感器检测频率做为基频；②取20 μ 1信标免疫纳米磁颗粒加入Iml梯度稀释后的的沙门氏菌菌悬液 (8.6 X Iol-S^Xio6CFUZml)和肠球菌的菌悬液(4.2X101-4.2X106CFU/ml)中，轻轻混 勻后，于室温下孵育15mim，借助超强磁将溶液浓缩至100 μ 1 ；利用带0.45 μ m滤膜的 离心管(ultrafree-MC microcentrifuge filters, Sigma 公司)1500rpm 离心 IOmin 将多余的
信标免疫纳米磁颗粒去除；加入ΙΟμΙ亲和素标记胶体金37°C下孵育20min，用超强磁 去除未结合的亲和素标记胶体金，并将溶液定容到ΙΟΟμΙ;将上述ΙΟΟμΙ溶液加入到 90(^1的金生长液中反应151^11;再借助超强磁将多余的金生长液去除，最后将溶液定容 到 10 μ 1 ；③将步骤(4)②中最后得到的10 μ 1溶液滴加到步骤⑷①中已修饰好的石英晶 振上，并将石英晶振于37°C下反应60min后，洗涤后进行频率的测定，最后检测结果为 35CFU/ml。实施例5
嗜肺军团菌纯菌悬液的检测(1)信标免疫纳米磁颗粒的制备①游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗 粒分离，洗脱平衡液为pH7.4的O.Olmol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒冷冻干燥，使葡 聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/mL;取葡聚糖纳米磁颗粒悬液l.OmL，加入20mmol/ LNaIO4水溶液0.25mL，150转/分钟避光阻氧震荡6h后，加入2mol/L乙二醇的水溶液 0.21mL终止氧化，pH 7.4的O.Olmol/L磷酸盐缓冲液4°C透析24h，去除过量的NaIO4, 使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5.5mg/mL ；②取SPA亲和纯化的嗜肺军团菌兔多克隆抗体(中国公共卫生，2005; 21(6) 705-6)和生物素化兔IgGCBBI生物公司购买)按体积比为1 60比例混合，抗体混合溶 液的总体积为0.3ml，两种抗体的浓度均为0.5mg/mL，将混合好的抗体溶液加入到步骤 (1)①中的ImL纳米磁颗粒中，混勻后，放入4°C冰箱过夜(避光)，次日，在上述溶液 中加入BSA(终浓度为1%)进行封闭，过夜，置4°C冰箱备用。其余步骤同实施例1。(4)压电传感器的检测①先将石英晶振用piranha液(浓H2S04/H2023/1，现用现配)进行洗涤，再用 无水乙醇和超纯水洗涤，每次5min，重复3次；石英晶振在固定物质之前在气相中进行 基础频率检测，固定物质之后进行洗涤，氮气吹干IOmin后在气相中进行频率检测，频 率变化稳定在士 IHz间时计数；取1.2mg/ml的SPA溶液ΙΟμΙ滴加于石英晶振上，常温 下固定40min ；按上述步骤进行洗涤后取l.Omg/ml的嗜肺军团鼠单克隆抗体溶液(AB公 司嗜肺军团鼠单克隆抗体，货号为ab8263) 10yl滴加于石英晶振上，37°C下固定60min， 洗涤后用BSA封闭，用压电传感器检测频率做为基频；②取20 μ 1信标免疫纳米磁颗粒加入Iml梯度稀释后的的嗜肺军团菌菌悬液 (Sjxiol-Sjxio6CFlVml)和大肠杆菌的菌悬液(9.3Xiol-MXio6CFUZml)中，轻轻 混勻后，于室温下孵育15mim，借助超强磁将溶液浓缩至100 μ 1 ；利用带0.45 μ m滤膜 的离心管(ultrafree-MC microcentrifuge filters, Sigma 公司)1500rpm 离心 IOmin 将多余
的信标免疫纳米磁颗粒去除；加入ΙΟμΙ亲和素标记胶体金37°C下孵育20min，用超强 磁去除未结合的亲和素标记胶体金，并将溶液定容到100 μ 1 ；将上述100 μ 1溶液加入到 90(^1的金生长液中反应151^11;再借助超强磁将多余的金生长液去除，最后将溶液定容 至Ij 10 μ 1 ；③将步骤(4)②中最后得到的10 μ 1溶液滴加到步骤⑷①中已修饰好的石英晶 振上，并将石英晶振于37°C下反应60min后，洗涤后进行频率的测定，最后检测结果为 57CFU/ml。实施例6食品样本加标大肠杆菌0157 7的检测(1)从天津某菜场购买熟牛肉作为本次实验的样本，在无菌操作下分别称取 25g样本分成2份进行检测，其中一份按照GB/T4789.36-2008进行大肠杆菌0157:H7 的检测；另外一份样本中加入225ml灭菌生理盐水进行均质后，取2.5ml已知浓度 (2.2X109CFU/ml)的大肠杆菌0157:H7的菌悬液加入，分别在加入大肠杆菌0157:H7之前与之后各取Iml样本液体利用压电免疫传感器进行大肠杆菌0157 7的检测；(2)样本利用压电免疫传感器进行大肠杆菌0157 7检测的方法同实施例1中的 步骤(1)_(4)，检测结果为未加标的样本中未检测出大肠杆菌0157:H7，加标样本中大 肠杆菌0157 7最低检测限为55CFU/ml。可见，上述基于压电传感器检测致病菌的方法在其他检测条件不变的情况下， 仅需更换目标抗体和固定在压电传感器电极上的抗体即可对各类致病菌进行检测，是可 以普遍应用于各类致病菌的检测方法。上述参照具体实施方式
对该一种基于压电传感器检测致病菌的方法进行的详细 描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不 脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于具体步骤为(1)制备信标免疫纳米磁颗粒；(2)制备亲和素标记胶体金；(3)制备金生长液，确定亲和素标记胶体金在金生长液中的生长时间；(4)压电传感器的检测取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的致病菌的菌悬液中，通过超强磁的吸 引去除非目标菌；将制备好的亲和素标记胶体金加入，通过生物素-亲和素系统将胶体 金结合到信标免疫纳米磁颗粒上；将连接有信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的 致病菌加入金生长液中，按照步骤(3)确定的生长时间使胶体金得到生长放大，收集该 液体滴加至固定有SPA和致病菌鼠单克隆抗体并用牛血清白蛋白封闭非特异性位点的压 电传感器的石英晶振上，观察压电传感器频率的变化确定待检测样本中致病菌的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于具体步 骤为(1)制备信标免疫纳米磁颗粒采用化学共沉淀法制备粒径为IOnm 200nm的纳米磁颗粒，将采用SPA亲和纯化 的致病菌兔多克隆抗体和相同浓度的生物素标记的兔IgG按体积比为1 60混勻后，取 混合抗体连接到纳米磁颗粒上制成信标免疫纳米磁颗粒；(2)制备亲和素标记胶体金胶体金采用柠檬酸钠还原法制备粒径为10mn-20nm的胶体金，将浓度为0.2mg/ mL-1.0mg/mL的亲和素连接至胶体金上，即为亲和素标记胶体金；(3)制备金生长液，确定亲和素标记胶体金在金生长液中的生长时间取氯金酸溶液加入十六烷基三甲基浴溴化胺溶液中混勻，然后置于100°C水浴锅中加 热lOmin，颜色变为清亮的黄色，室温下冷却备用；加入抗坏血酸溶液轻轻混勻至金生 长液颜色消失；取不同浓度的亲和素标记胶体金溶液于金生长液中进行自生长，利用紫 外分光度度计进行波长扫描确定胶体金在金生长液中的生长时间；(4)压电传感器的检测①石英晶振用piranha液进行洗涤，取SPA溶液固定于压电传感器的石英晶振，检测 频率变化，确定SPA的固定浓度和时间后，取致病菌鼠单克隆抗体溶液固定于压电传感 器的石英晶振，检测频率变化，确定致病菌鼠单克隆抗体的固定浓度和时间；②取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的致病菌的菌悬液中，通过超强磁的 吸引去除非目标菌；再借助膜将多余的信标免疫纳米磁颗粒离心去除；将步骤(2)中制 备好的亲和素标记胶体金加入，通过生物素_亲和素系统将胶体金结合到信标免疫纳米 磁颗粒上，然后借助超强磁将未结合的亲和素标记胶体金去除；最后将连接有信标免疫 纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的致病菌加入金生长液中，按照步骤(3)确定的生长时 间使胶体金得到生长放大，继续用超强磁将多余的金生长液去除；③按上述步骤(4)①的固定浓度和固定时间分别将SPA和致病菌鼠单克隆抗体固定 于压电传感器的石英晶振上，并用牛血清白蛋白封闭石英晶振上非特异性位点，将步骤 (4)②中最后收集到的液体滴加至石英晶振上，观察压电传感器频率的变化确定待检测样 本中致病菌的浓度。
3.根据权利要求2所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于所述致 病菌为大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌或嗜肺军团菌。
4.根据权利要求2或3所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于所述 致病菌为大肠杆菌0157:H7。
5.根据权利要求4所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于具体检 测方法为(1)制备信标免疫纳米磁颗粒采用化学共沉淀法制备粒径为IOnm 200nm的纳米磁颗粒，将采用SPA亲和纯化 的浓度为0.5mg/mL大肠杆菌0157:H7兔多克隆抗体和相同浓度的生物素标记的兔IgG按 体积比为1 60混勻后，取每0.3mL混合抗体连接到ImL纳米磁颗粒上制成信标免疫纳 米磁颗粒；(2)制备亲和素标记胶体金胶体金采用柠檬酸钠还原法制备，制备粒径为18nm的胶体金，将浓度为0.5mg/mL 的亲和素连接至胶体金上，即为亲和素标记胶体金；(3)制备金生长液，确定胶体金在金生长液中的生长时间取52 μ 1 0.024Μ氯金酸溶液加入5ml 0.1M十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶液中 混勻，然后置于100°C的水浴锅中加热lOmin，颜色变为清亮的黄色，室温下冷却备用； 加入50 μ IlM抗坏血酸溶液轻轻混勻至金生长液颜色消失；取每100 μ 1的亲和素标记胶 体金溶液于900 μ 1金生长液中进行自生长，其中亲和素标记胶体金溶液的浓度为对步骤 (2)中亲和素标记胶体金溶液进行对倍稀释，利用紫外分光度度计进行波长扫描观察胶体 金在金生长液中的生长时间为15min ；(4)压电传感器的检测①石英晶振用piranha液进行洗涤，取浓度为0.2mg/mL 2.0mg/mL的SPA溶液 10 μ 1固定于压电传感器的石英晶振10 90min，取浓度为O.lmg/mL 1.8mg/mL的大 肠杆菌0157:H7鼠单克隆抗体溶液10 μ 1固定于压电传感器的石英晶振10 90min ；②取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的大肠杆菌0157:H7的菌悬液中，通 过超强磁的吸引去除非目标菌；再通过0.45 μ m的膜将多余的信标免疫纳米磁颗粒离心 去除；将制备好的亲和素标记胶体金溶液加入，通过生物素-亲和素系统将胶体金结合 到信标免疫纳米磁颗粒上，然后借助超强磁将未结合的亲和素标记胶体金去除；最后将 连接有信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的大肠杆菌0157:H7加入金生长液中， 按照步骤(3)确定的生长时间使胶体金得到生长放大，继续用超强磁将多余的金生长液 去除；③按上述步骤(4)①的固定浓度和固定时间分别将SPA和大肠杆菌0157:H7鼠单克 隆抗体固定于压电传感器的石英晶振上，并用牛血清白蛋白封闭石英晶振上非特异性 位点；将步骤(4)②中最后收集到的液体滴加至石英晶振上，观察压电传感器频率的变 化确定待检测样本中大肠杆菌0157:H7的浓度。
6.根据权利要求5所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于所述步 骤(1)中的纳米磁颗粒粒径约为50nm，连接的大肠杆菌0157:H7兔多克隆抗体的浓度为 0.5mg/mL ；步骤(2)中亲和素的连接量为14yg/ml。
7.根据权利要求5所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于所述步 骤⑷中SPA的固定浓度和时间为1.2mg/ml、40min ；大肠杆菌0157:H7鼠单克隆抗体 的固定浓度和时间为1.0mg/ml、60min。
全文摘要
本发明提供了一种基于压电传感器检测致病菌的方法，通过抗原抗体反应(信标免疫磁颗粒)、生物素-亲和素系统(金标亲和素)和金的自生长技术(金生长液)，对压电免疫传感器的检测信号进行了多级放大，使得本发明的检测灵敏度得到了最大限度提高，其检测大肠杆菌0157:H7的灵敏度达到了23CFU/ml，该方法具有灵敏度高，特异性强、操作简便快速等特点，而且只要更换检测过程中涉及的抗体就可以检测不同的微生物，在微生物的检测领域具有广阔的应用前景。
文档编号G01N27/00GK102012384SQ20101055011
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者李君文, 王新为, 王景峰, 谌志强, 邱志刚, 金敏, 陈照立 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所