专利名称：呋喃唑酮代谢物衍生物的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是呋喃唑酮代谢物衍生物的单克隆抗体及其应用，属于免疫化学技术领域。
背景技术：
呋喃唑酮(Furazolidone, FZ),又名痢特灵,是一种人工合成的硝基呋喃类广谱抗菌药，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及某些原虫和真菌具有抑制或杀灭效果，而且药效稳定，在畜禽和水产养殖中得到了广泛的应用。但毒理学研究发现，呋喃唑酮及其代谢物3-氨基-2-恶唑烧酮(3-amino-2_oxazolidinone, Α0Ζ)均有很强的毒副作用，可致癌、 致突变，可引起溶血性贫血、血小板减少性紫癜、多发性神经炎等多种疾病。1995年欧盟首先禁止呋喃唑酮在畜禽和水产养殖中使用，随后美国、日本、澳大利亚等国家将呋喃唑酮列为禁用药，我国农业部2002年3月颁布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》(农牧发[2002] I号)中将呋喃唑酮列为禁用药。欧盟委员会于2003年通过了 2003/181/EC委员会决议，建立了用于检测禽肉产品和水产品中总硝基呋喃类药物的代谢物的各种方法的最小要求性能限值(Minimum Required Performance Limits,MRPL)为 I Ug/kg,即欧盟从第三国进口的动物性产品中硝基呋喃类药物的代谢物的含量不得超过I μ g/kg。2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃唑酮。因此呋喃唑酮在食品动物中的残留不仅直接危害使用者的身体健康，同时还严重制约我国动物性食品出口，造成了巨大的经济损失。
目前，用于AOZ残留检测的方法主要有理化分析法和酶联免疫分析法(ELISA)等。 理化分析法主要是高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱联用(LC-MS )等。理化分析法灵敏度高，结果准确，但是样品需经一系列复杂的处理净化，繁琐费时，所需仪器设备价格昂贵， 只有特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场检测，时效性差，难以推广。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术(ELISA)具有快速、灵敏度高、操作简单、专一性好等优点，适合高通量的样品筛选，申请人检索发现，申请号为200610041480. I，名称为《单克隆抗体介导的呋喃唑酮残留检测方法及应用》的一篇中国发明专利申请中采用ELISA法检测呋喃唑酮的残留，由于呋喃唑酮在动物体内很快代谢为AOZ，AOZ与组织蛋白结合且在体内滞留时间长，被视为呋喃唑酮残留的标示物。仅通过检测母体药物并不能判定呋喃唑酮的实际残留情况。发明内容
本发明要解决技术问题是针对以上现有技术存在的缺点，提出一种呋喃唑酮代谢物衍生物的单克隆抗体，并将该单克隆抗体应用于检测呋喃唑酮代谢物。该方法具有操作简便、成本低廉、高通量、特异性强的特点。
本发明所涉及的杂交瘤细胞株1C3已于2011年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No. 5071，分类命名为抗呋喃唑酮代谢物衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
由上述杂交瘤细胞株1C3产生的单克隆抗体命名为1C3’，其制备方法包括以下步a.制备免疫原和包被原采用间醛基苯甲酸法将载体蛋白与呋喃唑酮代谢产物小分子偶联，合成免疫原和包被原；b.动物免疫注射以Balb/c鼠作为免疫动物，免疫途径为颈背部皮下多点注射，融合前的超强免疫途径为腹腔免疫；c.筛选动物免疫血清用间接酶联免疫吸附法和竞争间接酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；d.制备杂交瘤细胞取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经过亚克隆获得可以稳定分泌抗呋喃唑酮代谢物衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C3 ；e.制备并纯化单克隆抗体对小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1C3，采集腹水，对腹水进行液相层析纯化，获得呋喃唑酮代谢物衍生物单克隆抗体1C3’。
其中，步骤a所述载体蛋白为牛血清白蛋白和卵清白蛋白，对应的免疫原为 A0Z-BSA，包被原为AOZ-OVA ;所述间醛基苯甲酸法中，交联剂活化小分子衍生物的时间为 1-2小时，用呋喃唑酮代谢物小分子衍生物与载体蛋白偶联反应10-15小时。所述步骤b中的各次免疫注射剂量为100 μ g/只。所述步骤e中对免疫小鼠腹腔进行单克隆抗体细胞株的注射量为(1-5) X IO6个/只。
通过亚型鉴定得出本发明单克隆抗体的亚型为IgGl型。
通常制备呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的方法主要是通过药物的羧基与载体蛋白的氨基偶联，本发明将呋喃唑酮代谢物小分子通过间醛基苯甲酸进行衍生化并将衍生化产物的羧基通过混合酸酐法与载体蛋白的氨基偶联，这样，该法合成的完全抗原，通过交联臂间醛基苯甲酸的作用，可以将呋喃唑酮代谢物小分子充分暴露出来，使机体更容易识别抗原决定簇，提高抗原的免疫原性，在后期筛选过程中可以获得针对呋喃唑酮代谢物衍生物的抗体。呋喃唑酮代谢物结构式如下
权利要求
1.一种产生呋喃唑酮代谢物衍生物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C3，是小鼠杂交瘤细胞系 CGMCC No. 5071。
2.根据权利要求I所述杂交瘤细胞株1C3产生的单克隆抗体1C3’。
3.根据权利要求2所述单克隆抗体1C3’，其特征在于所述单克隆抗体亚型为IgGl型。
4.根据权利要求2所述单克隆抗体1C3’在检测呋喃唑酮代谢物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是呋喃唑酮代谢物衍生物的单克隆抗体及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明的呋喃唑酮代谢物单克隆抗体1C3’是由小鼠杂交瘤细胞株1C3产生，其亚型是IgG1型。本发明的有益效果是通过小鼠杂交瘤细胞株1C3产生的单克隆抗体1C3’，能够大量生产，可用于制备检测呋喃唑酮代谢物(AOZ)的酶联免疫分析法试剂盒和胶体金试纸条，达到快速且灵敏地检测肌肉、肝脏、及水产品中的呋喃唑酮药物代谢物的目的，为检测呋喃唑酮代谢物残留的试剂盒、胶体金产品研制奠定基础。
文档编号G01N33/577GK102936582SQ20121033594
公开日2013年2月20日 申请日期2012年9月12日 优先权日2011年9月23日
发明者唐宏, 崔迎利, 王晓艳 申请人:泰州康正生物技术有限公司