专利名称：一种质粒dna定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生化分析领域，具体涉及一种质粒DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
质粒DNA是游离于染色体外的小型(l_200kb)的共价、闭合、环状的双链DNA分子，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。它通常编码一些酶基因，如产生抗生素、抗生素抗性、限制酶、修饰酶等有利于宿主的酶基因。由于它分子小、能够自主复制并且稳定遗传，因此是分子生物学、基因工程技术中常用的载体。在分子生物学领域进行DNA分析时常常需要对质粒DNA进行准确定量，如进行克隆文库构建时的酶切和连接操作，以及对质粒DNA进行测序时，为了得到良好的后续实验结果，都需要对质粒DNA的浓度进行准确测定。因此对质粒DNA定量有着广泛的应用。 采用Pic0Green荧光染料法对核酸进行定量，因其方法的灵敏度高、线性范围广，因此应用非常广。然而，PicoGreen荧光染料法在对DNA进行定量时的局限性表现为，第一，方法的准确度高低取决于试剂盒中DNA标准品含量的准确度，而目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，S卩？ ng/ml，这个值一般是通过紫外吸收(0D260)确定的，该值也没有相关的不确定度信息和溯源性。第二，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异，如果依据定量的DNA标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏差很大，而目前商业化的试剂盒中均只有一个分子大小的DNA标准，即Lambda噬菌体DNA标准(48. 5K)。有报道称以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量，测定结果会比真实结果偏低。因此，如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏,现有的商业化的试剂盒还无法满足要求。因为PicoGreen荧光染料法对质粒DNA定量需要具有准确量值的质粒DNA标准物质，而目前并没有含有准确量值的质粒DNA标准可用作PicoGreen法定量质粒的标准。由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低，因此要研制质粒DNA标准品，必须选择准确度高，溯源途径清晰的DNA绝对定量方法。对质粒DNA进行绝对定量的方法有基于单分子扩增的数字PCR方法、有依赖于磷元素标准的电感耦合等立体发射光谱法。我们建立了一种基于核苷酸标准品的超声波-同位素质谱法，可对质粒DNA进行绝对定量，从而为PicoGreen荧光染料法提供DNA标准。

发明内容
本发明的目的是提供一种质粒DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒，该方法灵敏度高，线性范围广，准确度高，精密度好。本发明首次建立了质粒DNA荧光染料法定量检测方法，采用质粒DNA标准，利用PicoGreen法对质粒DNA进行准确定量,本发明人进行了如下研究工作
I、质粒DNA浓度与荧光信号强度是否存在线性关系(见实施例I)将构建的5k大小的质粒稀释成不同浓度的DNA样品，稀释后的质粒DNA与PicoGreen突光染料结合后,测定突光信号。结果发现质粒DNA浓度与荧光信号成正比，线性相关系数为O. 99。因此可以以荧光信号强度测算质粒DNA浓度。本研究为确定本方法的可行性打下了基础。2、不同分子量大小的DNA与荧光信号强度的线性关系差别(见实施例3)选择了分子大小分别为5k，9k，48k的质粒/基因组分子作为研究对象，分别将DNA进行梯度稀释，稀释后的DNA与PicoGreen荧光染料结合后，测定荧光信号。
结果发现4种不同分子量的DNA，浓度与荧光信号均成正比，且线性相关性都很好，相关系数均>0. 99。但不同分子量大小的DNA与荧光信号的线性关系(斜率)不同，分子量越大，直线的斜率越大。以商业化试剂盒lambda DNA作为标准(48k)测定2k IOk的质粒DNA,结果偏差较大，具体见表2。此研究结果表明，测定质粒DNA浓度应选择分子量差别不大的质粒DNA标准品。3、研究了对质粒DNA定量的线性范围(见实施例2)将质粒DNA稀释至O. Olng/mL^lOOOOng/mL,与荧光染料结合后，测定荧光信号值，结果发现DNA浓度在O. 25ng/mL 1000ng/mL之间时，荧光强度与DNA浓度成正比。此研究确定了荧光染料法定量检测DNA的浓度范围是O. 25ng/mL 1000ng/mL。3、研究了对质粒DNA的检测灵敏度(见实施例2)由于最低检测到的荧光信号对应的DNA浓度为O. 01ng/mL，加样量100 μ L，因此计算出该方法的灵敏度为lpg。4、定量限(见实施例2)根据最低定量的线性范围，定量限为25pg。根据上述实验结果，本发明提供了一种质粒DNA荧光染料法定量检测方法，其特征为用不同浓度的质粒DNA标准品与Pi coGreen荧光染料混合，分别测定荧光信号强度，绘制浓度一荧光信号强度标准曲线；然后将待测质粒DNA样品稀释至0. 25ng/mL^lOOOng/mL,与荧光染料混合后，测定荧光信号强度；根据所绘制标准曲线计算待测质粒DNA样品的DNA浓度。待测质粒DNA的分子大小为2k 10k。具体操作步骤如下I)配制合适浓度的荧光染料用工作液稀释PicoGreen荧光染料至O. 6^1. O μ M浓度；2)制备不同浓度的标准品检测液用工作液对标准品进行梯度稀释，得到4 8个浓度的稀释液；如浓度为Ing/ μ L、0. 5ng/ μ L、0. 25ng/ μ L、0. lng/ μ L、0. Olng/ μ L ；取每一种浓度的标准品稀释液100 μ L分别与100 μ L步骤I)得到的荧光染料混匀；
3)制备待测物检测稀释液A将待测质粒DNA样品用紫外法测定大致浓度范围后，用工作液稀释至浓度为O.25ng/mL^1000ng/mL ；B取稀释好的样品100 μ L与100 μ L步骤I)得到的荧光染料混匀；4)测定不同浓度标准品的荧光信号，绘制浓度一荧光信号强度曲线A将上述不同浓度的标准品检测稀释液转移至同一个96孔酶标板上，利用酶标仪分别读取每种浓度标准品的荧光信号强度；设置酶标仪激发波长480nm，吸收波长为520nm ；B以标准品每种DNA浓度为横坐标，以相应的突光信号值为纵坐标绘制“突光信号
值-DNA浓度”标准曲线；5)测定待测物荧光信号方法同步骤4) A ;6)计算待测样品浓度将待测样品荧光信号值代入步骤4) B得到的标准曲线，得出待测样品的浓度。以上方法中，所述工作液的成分是IOmM Tris-HCl，含ImM EDTA, pH=8. O。本发明用超声波一同位素稀释质谱方法验证了本方法的准确度(见实施例3)。本方法的创新点是I、首次采用标准质粒作为荧光染料法中的DNA标准对质粒样品进行定量；2、灵敏度高可检测低至Ipg的DNA ；3、方法线性范围广可检测O. 25ng/mL 1000ng/mL的DNA，跨越4个数量级；4、准确度高首次采用高准确度的超声波-同位素稀释质谱法对标准质粒进行定量，得到的量值不确定度低，准确度高。本发明还提供了一种质粒DNA荧光染料定量检测试剂盒，试剂盒中包括质粒DNA标准品，PicoGreen荧光染料和工作液，其特征为工作液成分为IOmM Tris-HCl，含 ImM EDTA, ρΗ=8· O ；质粒DNA标准品为具有准确浓度定量值的环状质粒分子DNA，浓度范围是Ing/μ L 300ng/ μ L本发明中所用的质粒DNA标准品用超声波-酶解-同位素稀释质谱法确定量值，方法为将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱分离单核苷酸并准确定量；所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段，然后进行酶解，条件为I)超声波处理强度5，时间25min，上样量为IOOyL, DNA浓度10-50ng/yL,工作循环10%，爆破/循环200，温度4° C ；2)所述酶是磷酸二酯酶；活性浓度为O. 02-0. 025U/ μ L ；3)磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为IOOmin以上。本试剂盒的优点是I、弥补了现有商业化突光染料试剂盒中不能对质量DNA进行定量的缺点；
2、灵敏度高可检测低至Ipg的DNA ；3、检测范围广可检测O. 25ng/mL 1000ng/mL的DNA，跨越4个数量级；4、操作简便、需要的检测仪器设备常规；5、标准品准确度高。


图1为质粒DNA浓度(O. 25ng/mL IOOOng / mL)与PicoGreen突光信号强度的关系;图2为质粒DNA浓度(O. 01ng/mL IOOOOng / mL)与PicoGreen突光信号的关系;图3为PicoGreen荧光染料法对质粒DNA定量的线性范围；图4为PicoGreen荧光染料法对不同分子大小的DNA定量的线性相关性；图5为超声波处理质粒PNK603的结果图；图6为标准品色谱分离图；图7为质粒经过超声和水解后样品的色谱分离图；图8水解样品的总离子流图；图9 提取离子色谱图((I)dCMP，(II)LdCMP, (III) dTMP, (IV) LdTMP, (V) dGMP, (VI)LdGMP, (VII)dAMP，(VIII)LdAMP)；图10为两种方法(PicoGreen突光染料法与超声波_同位素稀释质谱法)测定结果比较。
具体实施例方式实施例I质粒DNA与PicoGreen荧光信号的关系一、实验目的探索质粒DNA浓度与PicoGreen荧光信号是否有线性关系二、材料与方法1.质粒DNA pBAZS :通过在载体pEASY_T3上连接4个外源基因片断(扩增所用引物见表I)得到。2. PicoGreen突光染料购自life technology公司。用IxTE按照1:200进行稀释。3.将质粒DNA配置成10000ng/mL的保存浓度，然后用IxTE稀释至1000ng/mL、750ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/mL。4.取稀释好的DNA溶液0.1mL与O.1mL的稀释好的PicoGreen染料混合,转移至96孔酶标板。5.将酶标板置于酶标仪上,选择激发波长480nm,发射波长520nm进行突光信号的米集。6.标准曲线的绘制以质粒DNA浓度为横坐标，以荧光信号为纵坐标进行曲线绘制，所得到的标准曲线见图1。三、实验结果
由图1可知，质粒DNA与PicoGreen荧光染料结合后，DNA浓度与荧光信号成正比，线性相关系数为O. 996。四、实验结论质粒DNA浓度与荧光强度具有线性关系，证明PicoGreen荧光染料法可以对质粒DNA进行定量。其他的实例不用包括试验目的、结论等全部写么？实施例2PicoGreen法对质粒DNA定量的线性范围及定量限和检测灵敏度的确定一、材料与方法1.将质粒DNA配置成10000ng/mL的保存浓度，然后用IxTE稀释至5000ng/mL、2500ng/mL、2000ng/mL、1000ng/mL、750ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 05ng/mL、0. 01ng/mLo2.取稀释好的DNA溶液0.1mL与O.1mL的稀释好的PicoGreen染料混合,转移至96孔酶标板。其它操作同实施实例I中的5和6。二、实验结果1. PicoGreen荧光染料法测定质粒DNA的线性范围为了测定PicoGreen荧光染料法测定质粒定量的线性范围，将DNA进行了 14个不同浓度梯度的稀释，所有DNA浓度与荧光信号的关系见图2，由图2可知，在实验的范围内荧光轻度与DNA浓度不完全成正比，当浓度超过1000ng/mL或O. 25ng/mL时，荧光强度与DNA浓度已经不再是直线关系了。因此将浓度超过1000ng/mL和浓度低于O. 25ng/mL的点去掉后所得到的即为PicoGreen对质粒DNA的定量线性范围，即O. 25ng/mL 1000ng/mL，见图3。2. PicoGreen荧光染料法测定质粒DNA的定量限根据上述的线性范围，最低定量浓度O. 25ng/mL，加样量为O.1mL,因此可计算出PicoGreen荧光染料法测定质粒DNA的定量限为25pg。3. PicoGreen荧光染料法测定质粒DNA的检测灵敏度由于可检测的最低信号值对应的浓度为O. Olng/mL，加样量为O.1mL,因此可计算出PicoGreen突光染料法测定质粒DNA的检测限为lpg。实施例3对不同分子大小DNA采用PicoGreen荧光染料法进行定量一、实验目的研究市售检测试剂Lambda DNA是否可作为荧光染料法测定质粒DNA的标准品。二、材料与方法1.选择不同分子大小的DNA:lambda基因组DNA，大小48502bp，购自TAKARA公司，9000bpDNA :采用EcoRI限制性内切酶将Lambda基因组DNA进行酶切，通过琼脂糖凝聚电泳回收纯化得到；pBAZS质粒DNA，如上所述。nosZPCR产物以构建的质粒为模板，以引物nosZ-F/R扩增得到，具体的引物序列见表I。表I引物序列
权利要求
1.一种质粒DNA定量检测试剂盒，试剂盒中具有标准品、工作液和染料，其特征为 1)所述标准品为具有准确DNA浓度定量值的环状质粒分子DNA，浓度范围是lng/yL 300ng/u L ； 2)所述工作液成分为IOmM Tris-HCl，含 ImM EDTA, pH=8. 0 ； 3)所述染料是PicoGreen荧光染料。
2.权利要求I所述的试剂盒，所述标准品浓度的定量方法为将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱法分离单核苷酸并准确定量；其特征为，所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段，然后进行酶解。
3.权利要求2所述的试剂盒，所述前处理条件为 1)超声波处理米用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度5，时间25min,上样量为100iiL，DNA 浓度10-50ng/iiL，工作循环10%，爆破 / 循环200，温度4° C ； 2)所述酶是磷酸二酯酶；活性浓度为0.02-0. 025U/ u L ； 3)磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为IOOmin以上。
4.一种质粒DNA荧光染料法定量检测方法，其特征为 用不同浓度的质粒DNA标准品与PicoGreen荧光染料混合，分别测定荧光信号强度，绘制浓度一荧光信号强度标准曲线；然后将待测质粒DNA样品稀释至0. 25ng/mL 1000ng/mL，与荧光染料混合后，测定荧光信号强度；根据所绘制的标准曲线计算待测质粒DNA样品的DNA浓度。
5.权利要求4所述的方法，具体操作步骤如下 1)配制合适浓度的荧光染料 用工作液稀释PicoGreen荧光染料至0. 6^1. OuM浓度； 2)制备不同浓度的标准品检测液 用工作液对标准品进行梯度稀释，得到4 8个浓度的稀释液；取每一种浓度的标准品稀释液100 u L分别与100 u L步骤I)得到的荧光染料混匀； 3)制备待测物检测稀释液 A将待测质粒DNA样品用紫外法测定大致浓度范围后，用工作液稀释至浓度为0. 25ng/mL lOOOng/mL ； B取稀释好的样品100 ii L与100 u L步骤I)得到的荧光染料混匀； 4)测定不同浓度标准品的荧光信号，绘制浓度一荧光信号强度曲线 A将上述不同浓度的标准品检测稀释液转移至同一个96孔酶标板上，用酶标仪分别读取每种浓度标准品的荧光信号强度； B以标准品每种DNA浓度为横坐标，以相应的荧光信号值为纵坐标绘制“荧光信号值一DNA浓度”标准曲线； 5)测定待测物荧光信号 方法同步骤4) A ; 6)计算待测样品浓度 将待测样品荧光信号值代入步骤4) B得到的标准曲线，得出待测样品的浓度； 所述工作液的成分是IOmM Tris-HCl，含ImM EDTA, pH=8. O。
6.权利要求5所述的方法，测定荧光信号时，设置酶标仪激发波长480nm，吸收波长为520nmo
全文摘要
本发明首次提供了一种质粒DNA定量检测试剂盒，具有采用高准确度的超声波-同位素稀释质谱法准确定量的质粒DNA标准品，弥补了现有试剂盒不能对质粒DNA进行定量的缺点。本发明还提供了一种质粒DNA定量检测方法，分别测定不同浓度的质粒DNA标准品的荧光信号强度，绘制浓度—荧光信号强度标准曲线；然后测定待测质粒DNA样品荧光信号强度，根据所绘制标准曲线可准确计算出待测样品的DNA浓度。本方法和试剂盒首次采用标准质粒作为荧光染料法中的DNA标准进行定量，灵敏度高，可检测低至1pg的DNA；线性范围广，可检测0.25ng/mL~1000ng/mL的质粒DNA；对标准质粒采用超声波-同位素稀释质谱方法定量，得到的量值不确定度低，准确度高。
文档编号G01N21/64GK102980878SQ20121054144
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者董莲华, 孟盈, 王晶, 傅博强, 高运华, 张玲 申请人:中国计量科学研究院