专利名称：基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法
技术领域：
本发明属于转基因植物的检测领域，尤其涉及基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法。
背景技术：
水稻是我国第一大粮食作物，年产量约占粮食总产量的38%，其生产关系着 国家的粮食安全。转基因技术突破了水稻传统育种的限制，为保障我国的粮食安全提供了新的途径。随着水稻基因工程技术的飞速发展，转基因水稻的研究成果斐然。近20年来，利用转基因技术已成功研发出抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆境和高产优质的转基因水稻，获得了大量目标性状遗传和表达稳定、农艺性状优良的转基因水稻株系。随着大量转基因作物逐步走向市场，转基因作物和转基因作物加工的食物的安全性问题也开始受人们的关注。从本质上讲，转基因作物和常规育成的作物品种没有差别。常规育种一般是通过有性杂交来实现，而植物基因工程则是用农杆菌、基因枪、电激、微注射等技术将外源重组DNA导入植物基因组中，尽管从理论上讲，转基因的遗传特性及表型应该可以更加精确地预测，在应用上更为安全，但对转基因作物进行安全性仍然很有必要。转基因成分检测方法，可分为定性检测法和定量检测法。目前常用的转基因作物检测方法有PCR检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、外源基因整合鉴定法、Westren杂交法、生物测定检测法等。常规的一些转基因植物的检测方法已经不能满足目前快速、准确检测的需要，这些方法有的需要转膜、杂交，操作繁琐、费用高，有的不适合批量样本的检测，严重限制了其应用。转基因检测技术的发展趋势是操作简便、费用较低、适用性强。申请公布号为CN 102081075A的发明专利申请公开了一种鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，包括(I)分别测定非转基因水稻C418和待检测水稻限定条件下人工培养生长6周叶中莽草酸和半乳糖醛酸的含量；(2)如果待检测水稻的莽草酸和半乳糖醛酸的含量相比非转基因水稻的莽草酸和半乳糖醛酸的含量有显著性下降，则待检测水稻是转基因水稻；由于莽草酸和半乳糖醛酸的检测方法较为复杂，致使此发明操作步骤繁琐，耗时长。

发明内容
本发明提供了基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，该方法能够快速、无损、简便的鉴别转基因水稻和非转基因水稻。一种基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，包括以下步骤(I)向水稻种子样本发射波数范围为4000 lOOOOcnT1的近红外光谱，并采集所有水稻种子样本的漫反射光谱信息；(2)分别对所有的水稻种子样本的漫反射光谱信息进行预处理，利用主成分分析法提取特征光谱区段中的光谱特征信息，选取主成分，并获取各个主成分的得分；(3)以所有水稻种子样本光谱信息对应的各个主成分得分作为输入，以水稻种子样本对应的水稻种子类型设定值作为输出，建立模型；(4)按照步骤(I) (2)的操作获取待测水稻种子光谱的各个主成分得分，将其带入(3)中所述模型，获得待测水稻种子类型。漫反射光是近红外光进入待测样品内部后，经过多次反射、折射、衍射、吸收，与待测样品内部分子发生了相互作用后返回至检测器的光，因此漫反射光谱信息负载了待测样品的结构和组成信息。由于转基因水稻种子和非转基因水稻种子内部的结构和组成有所差另O，结合光谱信息处理技术，可提取出差别信息，并通过有效的数据处理方法将光谱图像信息间的细小差异进一步突出显示，转变为可识别的信号，用于转基因水稻与非转基因水稻的鉴别。
步骤(I)中，所述水稻种子样本为转基因水稻种子样本和非转基因水稻种子样本，转基因水稻为转蛋白基因水稻或转调控基因水稻。步骤(2)中，为了去除高频随机噪声、基线漂移、样本不均匀等因素的影响，需要对光谱进行预处理。光谱预处理方法的选取影响着预处理效果以及光谱有效信息的提取，通过比较分析，预处理方法优选为标准正态变换法。所述特征光谱区段是指转基因水稻种子和非转基因水稻种子光谱信息中存在较为明显区别的区段，通过对光谱区段光谱信息进行数字化处理，可实现转基因水稻种子和非转基因水稻种子的鉴别；本发明中所述特征光谱区段优选为波数范围为4000 lOOOOcnT1 或 4000 8000CHT1 的光谱区段。利用主成分分析法提取光谱特征信息，主成分分析(PCA)的目的是将光谱数据降维，把原变量转换成一组彼此正交的新变量的线性组合，消除了多变量共存中相互重叠的信息，同时，新变量能最大限度地表征原变量的数据结构特征。由于主成分分析法的新变量数量少、彼此不相关，更有利于对光谱信息的分析。主成分分析方法可在Unscrambler软件(由美国CAMO制造)上实现。主成分的选取与原始信息的有效提取密切相关，在选择主成分时，取累计贡献率>85%，但主成分选取不宜过多，否则会引入不必要的噪声并造成过拟合；采用的标准正态变换进行预处理时，通过比较分析，主成分数优选为4 8。步骤(2)优选为利用标准正态变换法分别对所有的水稻种子样本的漫反射光谱图进行预处理，利用主成分分析法提取预处理后的波数范围为4000 SOOOcnT1光谱信息中的光谱特征信息，选取5个主成分，并获取各个主成分的得分。步骤(2)优选为利用标准正态变换法分别对所有的水稻种子样本的漫反射光谱图进行预处理，利用主成分分析法提取预处理后的波数范围为4000 lOOOOcnT1光谱信息中的光谱特征信息，选取6个主成分，并获取各个主成分的得分。步骤(3)中，水稻种子样本对应的水稻种子类型为转基因和非转基因，在模型中可设置转基因和非转基因的设定值分别为-I和I。所述模型优选为偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型，PLS-DA法是基于PLS回归的一种判别分析方法，在构造因素时因考虑到了辅助矩阵以代码形式提供的类成员信息，因此具有闻效的鉴别能力，可提闻水稻类型鉴别的精确度。相对于现有技术，本发明的有益效果为
(I)本发明操作简单、省时省力，仅需获取水稻种子的近红外光谱，即可进行转基因与非转基因水稻的鉴别；(2)本发明鉴别精度高、结果可靠，可实现转基因与非转基因水稻的快速、无损鉴别。


图I为实施例I验证集中转基因水稻和非转基因水稻预测值和实际值回归图。
具体实施例方式实施例II、建立模型 (I)分别选取80粒转基因水稻种子和40粒非转基因水稻种子作为水稻种子样本，利用Nicolet Nexus870 (Thermo Corporation USA)傅里叶变换近红外光谱仪向水稻种子样本发射波数范围为4000 lOOOOcnT1的近红外光谱，利用OMNIC 6. O软件采集所有水稻种子样本的漫反射光谱图；设置近红外光谱仪扫描次数32次，分辨率4CHT1。采集时室温控制在25 °C左右，湿度保持稳定。以上转基因水稻为转TCTP基因水稻和转0smil66基因水稻，其获取方法可为转基因材料分别采用水稻的成熟胚为外植体诱导、培养愈伤组织，挑选胚性愈伤组织作为转化受体，通过包含植物表达载体P1301-TCTP和pl301-mil66的根癌农杆菌EHA105转化到水稻愈伤中，经一系列筛选分化得到转基因水稻。非转基因水稻为中花11水稻。(2)利用标准正态变换法分别对所有的水稻种子样本的漫反射光谱图进行预处理，得到预处理后的光谱信息；利用Unscrambler软件中的主成分分析法提取各个预处理后的波数范围为4000 lOOOOcnT1光谱信息中的光谱特征信息,选取主成分数为6,获取各个主成分的得分(如表I所示)；(3)以所有水稻种子样本光谱信息对应的各个主成分得分作为输入，以水稻种子样本对应的水稻种子类型设定值作为输出，建立PLS-DA模型；水稻种子样本对应的水稻种子类型设定值设置如下转TCTP基因水稻和转mi 166基因水稻设定为-I，非转基因水稻设定为I。限于篇幅，仅将其中20粒水稻种子样本的数据列于此，见表I。表I用于模型建立的部分数据库
Πζ ΠζΓΤ5 Πζ
~ I. 3530-O. 79300. 77001.08200. 3880-O. 1170
~2I. 17000. 58900. 7120-0.85400.8270-O. 5790
32.04501.2560-0.0391-0.97100. 5480-O. 7620
~-0.4370-O. 15201.08500.48200.4580-O. 3600
权利要求
1.一种基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)向水稻种子样本发射波数范围为4000 lOOOOcnT1的近红外光谱，并采集所有水稻种子样本的漫反射光谱信息； (2)分别对所有的水稻种子样本的漫反射光谱信息进行预处理，利用主成分分析法提取预处理后的特征光谱区段中的光谱特征信息，选取主成分，并获取各个主成分的得分； (3)以所有水稻种子样本光谱信息对应的各个主成分得分作为输入，以水稻种子样本对应的水稻种子类型设定值作为输出，建立模型； (4)按照步骤(I) (2)的操作获取待测水稻种子光谱的各个主成分得分，将其带入(3)中所述模型，获得待测水稻种子类型。
2.如权利要求I所述的基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中，预处理方法为标准正态变换法。
3.如权利要求I所述的基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述特征光谱区段为波数范围为4000 lOOOOcnT1的光谱区段。
4.如权利要求I所述的基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述特征光谱区段为波数范围为4000 SOOOcnT1的光谱区段。
5.如权利要求I所述的基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中，主成分数为4 8。
6.如权利要求3或4所述的基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(2)中，主成分数为5。
7.如权利要求I所述的基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述模型为偏最小二乘判别分析模型。
全文摘要
本发明公开了一种基于近红外光谱鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，包括以下步骤(1)向水稻种子样本发射近红外光谱，并采集所有水稻样本的漫反射光谱信息；(2)分别对所有的水稻种子样本的漫反射光谱信息进行预处理，利用主成分分析法提取预处理后的特征光谱区段的光谱特征信息，选取主成分，并获取各个主成分的得分；(3)以所有水稻种子样本光谱信息对应的各个主成分得分作为输入，以水稻种子样本对应的水稻种子类型设定值作为输出，建立模型；(4)获取待测水稻种子光谱的各个主成分得分，将其带入(3)中所述模型，获得待测水稻种子类型。本发明鉴别精度高、操作简单、成本低，可实现转基因水稻和非转基因水稻的快速、无损鉴别。
文档编号G01N21/35GK102841072SQ20121028638
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月13日 优先权日2012年8月13日
发明者朱诚, 张龙, 丁艳菲, 王珊珊 申请人:中国计量学院