专利名称：高浓度的溶液中大分子的可逆缔合的表征方法
高浓度的溶液中大分子的可逆缔合的表征方法
背景技术：
大分子，例如蛋白质、多糖、合成聚合物等，在溶液中进行不同类型的相互作用。 这些相互作用中的非特异性的以及排斥的一些相互作用通常被称为“热动力学非理想性 (thermodynamic non-ideality)”。一些相互作用——无论是特异还是非特异的——有吸 引力，并引起可逆缔合，其中单体和缔合的复合物的浓度分数比达到平衡状态，这取决于溶 液中分子的总浓度、分子的特异性质、以及溶剂。可逆缔合状态进而影响溶液的功能。例 如，在制药工业中，可逆抗体低聚物的存在可增加溶液粘稠度，其不利地影响包含这些抗体 的药物的生产和输送。低聚物形式的抗体药物可呈现增加的免疫原性风险。这种大分子的 缔合状态的确定——以平衡缔合常数和缔合的化学计量的形式——在理解和控制潜在的 相互作用中是重要步骤。表征溶液中的非可逆聚集体或高度结合的复合物的标准方法，诸如分子排阻色谱 (SEC)、SEC结合多角度静态光散射(SEC-MALS)、或者沉积速度(SV)，不适用于弱可逆缔合， 因为这些表征技术导致复合物的稀释、解离，由此从平衡偏离。用于表征强相互作用可逆缔合的常用方法包括沉积平衡(SE)、等温滴定测热法 (ITC)、以及组成梯度多角度静态光散射(CG-MALS)。在SE中，分子的溶液被放置在分析超 离心机中，以及在极高的速度下旋转以形成平衡分布，其被记录和分析。分布的具体形状包 含自缔合单体和复合物的量以及缔合化学计量的信息。在ITC中，在自缔合的情况下，溶液 被相对于溶剂进行滴定，或者在异缔合的情况下，初始仅仅包含一种大分子的溶液被相对 于第二大分子进行滴定，以及溶液释放或吸收的热量被测量。该热量测量和对应的滴定曲 线的形状，即，热量相比于滴定体积和浓度，包含关于相互作用强度和缔合化学计量的必要 信息，尽管通常仅仅一个化学计量可以被表征。在CG-MALS中，一系列稀释液被准备，以及 被输送到MALS检测器。散射光强度对浓度的依赖性可以被分析以测定缔合化学计量和平 衡缔合常数。由于不要求非常长的沉积平衡的平衡时间，CG-MALS是特别有用的技术。另 外，其在测定导致多个低聚状态以及同时的自缔合和异缔合的缔合中优于ITC。当缔合的相 互作用强时，溶液通常在低浓度表征。然而，当缔合的相互作用弱时，如通常对于抗体药物 配方设计的情况，溶液必须在高浓度下表征，一般在10-100g/L的范围。在lg/L以上的分子浓度，非特异的，通常是排斥的相互作用变得显著，并将影响 SE、ITC和CG-MALS的可逆缔合测量。因此，弱缔合的表征必须经常在分析时必须考虑非特 异相互作用的浓度范围中进行。描述由溶液中进行非特异相互作用的多个物质的静态光散射的理论被称为“起伏 理论”,其由 Kirkwood 和 Goldberg 在 J. Chem. Phys. 18,54-59(1950)中描述。稀释条件下 的光散射的起伏理论应用到单个非缔合物质是周知的，仅仅涉及三个参数——摩尔质量、 均方半径、以及第二维里系数。随着溶液浓度增加，更高阶的维里系数必须被包括，使得分 析持续变得困难。Minton在Biophys. J. 93，1321-1328 (2007)中描述的简化，被称为“有 效硬球近似(effective hard sphere approximation) ”或EHSA，假设分子之间的非特异 相互作用等价于不可穿过的球体的所述作用，其有效半径可以不同于分子的实际半径。在溶液检测的过量瑞利比， 农度[C1, C2, C3...]；过量
瑞利比是溶液瑞利比和纯溶剂瑞利比之间的差；溶液的瑞利比是S ； I是由于入射强度I
Iv
从散射点距离rs处观察的每单位立体角的散射光的强度；ν是散射量；Z =； n0是
ΝΑλ
溶液的折射率；ΝΑ是阿伏伽德罗数；λ ^是入射光在真空中的波长；m和η代表存在的不同物 质，包括自由单体和复合物；cn是第η个物质的重量浓度，以每单位体积的质量单位计；Qu,

发明内容
本发明提供一种以非常易处理的形式表示来自高浓度的可逆缔合溶液的CG-MALS 数据的方法，适用于复合物多个化学计量的简化分析。另外，使用本发明的方法提供了利用上述易处理的表示、经CG-MALS测定平衡缔 合参数，即高浓度的大分子溶液的缔合复合物的化学计量、平衡缔合常数、以及存在的不强 干(无能力的，incompetent)部分的测量。

以及意图。
附图简述


图1是表示可逆自缔合物质溶液的非理想性的方法的流程图； 图2是表示形成可逆复合物的两种组成物质的溶液的非理想性的方法的流程图3是用于测定经历可逆缔合的一种或更多种物质的平衡缔合参数的设备的示
发明详述 理论描述
…·一.....................议相对于入射光的方向成θ 假设入射光是竖直平β偏振的，以及在水平平β中丨 角度进行观察，对于多组分静态光散射广义起伏理论的结果是
=Σ
dndnV dc m JIdc η J
κ\￥m,n{6)\ 在此，R(cx, θ )代表在任何散射角度从组成cx的大: 其中χ代表各种单体物质，以及Ci代表每个物质的总重量/笔
10-150g/L的高浓度下CG-MALS和其他数据的解析中EHSA框架有用，否则其是难处理的。 Fernandez 和Minton，Biophysical J. 96，1992-1998 (2009)已经示出起伏理论结合EHSA可 以成功地应用于大至70g/L浓度下蛋白质可逆自缔合为一个或两个低聚状态的CG-MALS分 析。尽管起伏/EHSA理论的组合是精确的，但是如果必须应对包括单体和复合物的两 种或三种物质则在数学上变得非常复杂。然而，很多重要的系统呈现多个缔合的化学计量， 即，同时地在单体和多个复合物之间获得平衡。一个示例是逐步自缔合，形成二聚物、三聚 物、四聚物或更高级的低聚物。另一示例是同时自缔合和异缔合。就下面等式1的复杂等 式而言，仅仅写出针对这些情况的完整的起伏理论等式将是非常难的，更不要说分析数据。因此，使用CG-MALS在高浓度下分析大分子的可逆缔合的方法——其采用热动力 学非理想性的更易处理的表示但仍准确地测定缔合常数和化学计量——将是有利的。
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8 是散射角θ的一些函数，其总体上取决于m和η分子的大小和质量分布，以及随着θ接 近零或总大小比小很多，接近值1 ’Ψ— {θ) = ‘+Q，其中如果m = n，则
权利要求
一种表示来自高浓度的自缔合溶液的CG MALS数据的方法，考虑高度简化形式的热动力学非理想性，根据等式中M是单体的摩尔质量；i是每个缔合i mer的阶；ci是i mer的部分平衡浓度；λ是所述照明光束的波长；是i mer的均方半径；n是所述溶液的折射率；NA是阿佛加德罗数；dn/dc是所述溶液中的所述大分子的折射增量；ctot是溶液中的分子的总重量浓度；以及A2和A3分别是所述单体的第二维里系数和第三维里系数。FSA00000178595700011.tif,FSA00000178595700012.tif,FSA00000178595700013.tif,FSA00000178595700014.tif
2.根据权利要求1所述的方法，其中^ \针对R(c，θ)的等式的分母中的全部i-mer设定为零，导致更简单的形式
3.根据权利要求2所述的方法，其中 < 针对R(c，θ)的等式的分母和分子中的全部 -mer设定为零，导致更简单的形式
4.根据权利要求1所述的方法，其中A3被设定为零。
5.—种表示来自高浓度的可逆异缔合大分子X和Y的溶液的CG-MALS数据的方法，考虑高度简化形式的热动力学非理想性，根据等式 f ，其中Mx和My是X和Y单体 的摩尔质量，i和j是XiYj复合物的化学计量阶；Mij = iMx+jMY摩尔质量，以及Cij是XiYj复
6.根据权利要求5所述的方法，其中〈Γ》,在分母中针对全部ij设定为零，导致更简J 的等式形式
7.根据权利要求6所述的方法，其中 ,,在分子中被设定为零，导致更简单的等式形式
8. —种表征溶剂中的高浓度的溶液中可逆缔合大分子的自缔合的方法，包括以下步1.引入浓度cf，f = 1. . . k的感兴趣分子的溶液的一系列k等分试样到光散射光度计， 由此所述光散射光度计1.用光束照射每个注入的稀释的等分试样 .在设置光灵敏检测器的一个或更多个角度位置θ检测从其散射的光的强度；2.测定每个稀释的等分试样f的浓度Cf；3.由所述检测的散射光强度形成过量瑞利比R(cf，θ)；4.依照所述k个稀释液cf，f= 1. . . k表示所述过量瑞利比，以校正热动力学非理想 性，如下
9.根据权利要求8所述的方法，其中基于从分子结构导出的分子半径r的估计量， 被估计为排除的体积值，
10.根据权利要求8所述的方法，其中A2被估计为排除体积值，
11.根据权利要求8所述的方法，其中A3设定为零。
12.根据权利要求8所述的方法，其中针对全部i-mer，〈rg2〉,设定为零。
13.根据权利要求8所述的方法，其中针对仅仅R(cf，θ)的分子中的全部i-mer，〈/；2〉, 设定为零。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述等分试样被人工制备，以及通过闪烁管引入 检测器。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述等分试样被人工制备，以及通过泵引入检测
16.根据权利要求8所述的方法，其中所述等分试样通过稀释最高要求浓度的原液的 双泵被自动地准备和弓I入检测器。
17.根据权利要求8所述的方法，其中所述浓度的所述测定由如下组成a.与散射光度计串联放置浓度检测器；b.注射足够体积的稀释等分试样以填充光散射光度计和浓度检测器的流量室；c.检测来自所述浓度检测器的信号；d.基于大分子的已知响应因子将所述信号转换为浓度。
18.根据权利要求8所述的方法，其中所述浓度的所述测定由如下组成a.在浓度检测器中测量所述高浓度溶液的浓度；b.由所述稀释步骤的参数计算每个稀释的等分试样的浓度Cj。
19.根据权利要求8所述的方法，其中所述浓度检测器包括UV/可见光吸收光度计，以 及所述响应因子是吸收系数。
20.根据权利要求8所述的方法，其中所述浓度检测器包括差示折光计，以及所述响应 因子是折射增量。
21.根据权利要求8所述的方法，其中所述拟合包括Levenberg-Marquardt非线性最小 二乘方拟合。
22.—种表征溶剂中高浓度溶液中的两个可逆缔合大分子物质的异缔合的方法，包括 以下步骤`1`.制备包含每个大分子物质的高浓度溶液的容器和包含所述溶剂的其他容器；`2.通过混合所述高浓度溶液的等分试样和所述溶剂制备所述高浓度溶液的一系列k 组合物等分试样[cxf，cxf]，f = 1. . . k，其中每个组合物等分试样包括浓度Cxf的大分子X和 浓度cYf的大分子Y ；`3.顺序地注射所述组合物等分试样到光散射光度计，由此所述光散射光度计i.通过光束照射每个注射的稀释液； .在设置光灵敏检测器的一个或更多个角度位置检测从其散射的光的强度；`4.通过浓度检测器和所述溶液中的所述大分子的响应因子测定每个组合物等分试样 f 的组成[cxf，cYf]；`5.由所述检测的散射光强度形成过量瑞利比R(cxf，cYf，Θ)；`6.依照所述k个稀释液cf，f= 1. . . k表示所述过量瑞利比，以校正热动力学非理想 性，如下
23.根据权利要求22所述的方法，其中A2,x和Α2,γ分别被估计为排除体积值
24.根据权利要求22所述的方法，其中A2,x和Α2,γ分别被估计为排除体积值
25.根据权利要求22所述的方法，其中在R(cf，θ)的分母中针对全部^〈 2〉"被设定为零。
26.根据权利要求22所述的方法，其中在R(cf，θ)的分子和分母中针对全部ij，〈rg2〉y, 被设定为零。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述等分试样由人工制备，以及通过闪烁管引 入检测器。
28.根据权利要求22所述的方法，其中所述等分试样由人工制备，以及通过泵引入检 测器。
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述等分试样通过吸取最高要求浓度的分子X 和Y的原液和溶剂的三泵自动地制备和引入检测器；混合这些溶液为要求的组合物；以及 随后输送所述等分试样到检测器。
30.根据权利要求22所述的方法，其中所述组合物的所述测定由如下组成a.与所述光散射光度计串联放置浓度检测器；b.注射足够体积的组合物等分试样以填充光散射光度计和浓度检测器的流量室；c.检测来自所述浓度检测器的信号；d.基于大分子的已知响应因子以及混合步骤限定的它们的比将信号转换为组成[Cxf，Y π C fJ。
31.根据权利要求22所述的方法，其中所述组合物的所述测定由如下组成a.与所述光散射光度计串联放置浓度检测器，其中所述浓度检测器对所述分子的两个独立的性质灵敏；b.注射足够体积的组合物等分试样以填充所述光散射光度计和所述浓度检测器的流量室；c.检测来自所述浓度检测器的所述信号；d.基于所述大分子对所述独立性质的已知响应因子将信号转换为组成[CXf，CYf]。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述两个性质是在两个不同波长的光谱吸收率。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述两个性质是在一个波长的光谱吸收率，以及折射增量。
34.根据权利要求22所述的方法，其中所述组合物的所述测定由如下组成a.在浓度检测器中测量每个高浓度溶液；b.由等分试样混合步骤的参数计算每个组合物等分试样的组成[cxf，cYf]。
35.根据权利要求22所述的方法，其中所述浓度检测器包括UV/可见光吸收光度计，以 及所述响应因子是吸收系数。
36.根据权利要求22所述的方法，其中所述浓度检测器包括差示折光计，以及所述响 应因子是折射增量。
37.根据权利要求22所述的方法，其中所述拟合包括Levenberg-Marquardt非线性最 小二乘方拟合。
全文摘要
本发明提供一种表征高浓度的大分子溶液的缔合性质的方法。在浓度范围上分布的样品等分试样被顺序地注入光散射光度计。平衡缔合常数和缔合化学计量由散射信号的角度和浓度依赖性的分析导出。热动力学非理想性，其在高浓度下变得重要，在简化形式的分析中被处理，其可应用于多个缔合的物质。
文档编号G01N21/33GK101936901SQ20101022145
公开日2011年1月5日 申请日期2010年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者D·I·萨姆 申请人:怀亚特技术公司