专利名称：生物转化反应中γ－氨基丁酸生成量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种γ-氨基丁酸生成量的检测方法。
背景技术：
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)是一种具有重要生理活性的非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统重要的神经递质，在动物体的脑、脊髓和肝脏等器官内分布比较集中，植物界也有广泛的分布。研究证实，γ-氨基丁酸具有降低血压和胆固醇，降低神经元活性，防止神经细胞过热，安神、抗除抑郁，增强脑功能和长期记忆，增加生长激素分泌，防止肥胖，健肝利肾，改善更年期综合症等功能。
生物体内γ-氨基丁酸大多由谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸脱羧产生，大豆中谷氨酸含量较高，是生物富集转化γ-氨基丁酸比较理想的原料。目前测定生物转化反应中γ-氨基丁酸的含量，主要采用氨基酸分析仪测定法、高效液相色谱法、薄层扫描法、纸层析法或比色法检测；但以上检测方法设备投资大，成本高，操作复杂，费时长(5～6h)，不适合大批量样品的定量分析。

发明内容
本发明的目的是为了解决目前γ-氨基丁酸生成量的检测方法成本高，费时长，设备投资大，操作复杂和不适合大批量样品的定量分析的缺陷，而提供的一种生物转化反应中γ-氨基丁酸生成量的检测方法。
生物转化反应中γ-氨基丁酸生成量的检测按以下步骤进行a.取1.00mL经过稀释的生物转化反应物和1.20mL、pH值为4.2的乙酸-乙酸钠缓冲液加入微量呼吸仪的反应瓶主室，再将0.30mL谷氨酸脱羧酶液加入微量呼吸仪的反应瓶侧室；b.将反应瓶浸入37℃水中10～30min，然后关闭反应瓶上检压计的三通活塞，使U形管右侧管内液柱下降至L1，5min后将U形管右侧管内液柱准确调整到L1，待U形管左侧管内液柱高度值h1稳定后记录；c.谷氨酸脱羧酶液流入反应瓶主室，37℃水浴振荡15～30min，然后准确将U形管右侧管内液柱调整到L1，待U形管左侧管内液柱高度值h2稳定后记录；d.空白对照检测取2.50mL蒸馏水放入反应瓶主室，重复操作步骤b和c，并计算出空白对照检测中U形管左侧管内液柱高度记录值之差的绝对值A；e.运用公式0.004604×0.86884×K×N×[(h2-h1)-A]×100×1000进行计算，可得出100mL生物转化反应物生成γ-氨基丁酸的量；步骤e计算公式中K为反应瓶常数，N为生物转化反应物稀释倍数。
谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸脱羧生成CO2和γ-氨基丁酸，本发明通过检测CO2的生成量就可以计算出γ-氨基丁酸的生成量。
本发明整个检测过程所需时间为40min～75min，检测只需微量呼吸仪，投资少，操作简单易行，可独立操作，灵敏度高(可检测出0.015g/100mL的γ-氨基丁酸)，重现性好，可进行大批量样品的定量分析，而且成本不到目前其它检测方法的一半。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式生物转化反应中γ-氨基丁酸生成量的检测按以下步骤进行a.取1.00mL经过稀释的生物转化反应物和1.20mL、pH值为4.2的乙酸-乙酸钠缓冲液加入微量呼吸仪的反应瓶主室，再将0.30mL谷氨酸脱羧酶液加入微量呼吸仪的反应瓶侧室；b.将反应瓶浸入37℃水中10～30min，然后关闭反应瓶上检压计的三通活塞，使U形管右侧管内液柱下降至L1，5min后将U形管右侧管内液柱准确调整到L1，待U形管左侧管内液柱高度值h1稳定后记录；c.谷氨酸脱羧酶液流入反应瓶主室，37℃水浴振荡15～30min，然后准确将U形管右侧管内液柱调整到L1，待U形管左侧管内液柱高度值h2稳定后记录；d.空白对照检测取2.50mL蒸馏水放入反应瓶主室，重复操作步骤b和c，并计算出空白对照检测中U形管左侧管内液柱高度记录值之差的绝对值A；e.运用公式0.004604×0.86884×K×N×[(h2-h1)-A]×100×1000进行计算，可得出100mL生物转化反应物生成γ-氨基丁酸的量；步骤e计算公式中K为反应瓶常数，N为生物转化反应物稀释倍数。
在谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸的生物转化反应中有1摩尔二氧化碳(在标准状况下为22.4L)生成就对应有1摩尔γ-氨基丁酸(103.12g)生成，所以通过计算可以得出每微升二氧化碳的生成相当于有0.004604毫克γ-氨基丁酸生成[103.12×103/(22.4×106)＝0.004604]。
本实施方式中由于微量呼吸仪检测谷氨酸的范围为0.06％～0.15％(w/v)，因此需将生物转化反应物稀释后检测；并且要确保检测系统的密闭性。经过多次多组平行实验证明本实施方式检测方法的测量误差小于5％。
每个微量呼吸仪的反应瓶常数(K)都是一个固定值，单位为μL/mm。
本实施方式整个检测过程所需时间为40min～75min，通过公式可以计算出每100mL生物转化反应物生成γ-氨基丁酸的量(μg)。
具体实施例方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤a中谷氨酸脱羧酶液的浓度为2％、酶比活单位为0.020～0.18U/mL。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施例方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤b反应瓶浸入37℃水中之前检压计内液柱的高度≥210mm。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施例方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤b中L1为150mm。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施例方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤a中乙酸-乙酸钠缓冲液的浓度为2.00mol/L。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施例方式
六本实施方式生物转化反应中γ-氨基丁酸生成量的检测按以下步骤进行a.取1.00mL经过100倍稀释的生物转化反应物和1.20mL、pH值为4.2、浓度为2.00mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液加入微量呼吸仪的反应瓶主室，再将0.30mL、浓度为2％、酶比活单位为0.020～0.18U/mL的谷氨酸脱羧酶液加入微量呼吸仪的反应瓶侧室；b.将反应瓶浸入37℃水中20min，然后关闭反应瓶上检压计的三通活塞，使U形管右侧管内液柱下降至150mm，5min后将U形管右侧管内液柱准确调到150mm，待U形管左侧管内液柱高度值h1稳定后记录，h1＝125mm；c.谷氨酸脱羧酶液流入反应瓶主室，37℃水浴振荡30min，然后准确将U形管右侧管内液柱调整到150mm，待U形管左侧管内液柱高度值h2稳定后记录，h2＝184mm；d.空白对照检测取2.50mL蒸馏水放入反应瓶主室，重复操作步骤b和c，并计算出空白对照检测中U形管左侧管内液柱高度记录值之差的绝对值A，A＝9mm；e.运用公式0.004604×0.86884×K×N×[(h2-h1)-A]×100×1000，可得出100mL生物转化反应物生成γ-氨基丁酸的量；步骤e计算公式中K为反应瓶常数，K＝1.6363，N为生物转化反应物稀释倍数。
0.004604×0.86884×K×N×[(h2-h1)-A]×100×1000＝0.004604×0.86884×1.6363×100×[(184-125)-9]×100×1000＝3.273×106(微克/100毫升)＝3.273克/100毫升经本实施方式检测生物转化反应物每100毫升可生成γ-氨基丁酸3.273克。
权利要求
1.生物转化反应中γ-氨基丁酸生成量的检测方法，其特征在于生物转化反应中γ-氨基丁酸生成量的检测按以下步骤进行a.取1.00mL经过稀释的生物转化反应物和1.20mL、pH值为4.2的乙酸-乙酸钠缓冲液加入微量呼吸仪的反应瓶主室，再将0.30mL谷氨酸脱羧酶液加入微量呼吸仪的反应瓶侧室；b.将反应瓶浸入37℃水中10～30min，然后关闭反应瓶上检压计的三通活塞，使U形管右侧管内液柱下降至L1，5min后将U形管右侧管内液柱准确调整到L1，待U形管左侧管内液柱高度值h1稳定后记录；c.谷氨酸脱羧酶液流入反应瓶主室，37℃水浴振荡15～30min，然后准确将U形管右侧管内液柱调整到L1，待U形管左侧管内液柱高度值h2稳定后记录；d.空白对照检测取2.50mL蒸馏水放入反应瓶主室，重复操作步骤b和c，并计算出空白对照检测中U形管左侧管内液柱高度记录值之差的绝对值A；e.运用公式0.004604×0.86884×K×N×[(h2-h1)-A]×100×1000进行计算，可得出100mL生物转化反应物生成γ-氨基丁酸的量；步骤e计算公式中K为反应瓶常数，N为生物转化反应物稀释倍数。
2.根据权利要求1所述的生物转化反应中γ-氨基丁酸生成量的检测方法，其特征在于步骤a中谷氨酸脱羧酶液的浓度为2％、酶比活单位为0.020～0.18U/mL。
3.根据权利要求1所述的生物转化反应中γ-氨基丁酸生成量的检测方法，其特征在于步骤b反应瓶浸入37℃水中之前检压计内液柱的高度≥210mm。
4.根据权利要求1所述的生物转化反应中γ-氨基丁酸生成量的检测方法，其特征在于步骤b中L1为150mm。
5.根据权利要求1所述的生物转化反应中γ-氨基丁酸生成量的检测方法，其特征在于步骤a中乙酸-乙酸钠缓冲液的浓度为2.00mol/L。
全文摘要
生物转化反应中γ－氨基丁酸生成量的检测方法，它涉及一种γ－氨基丁酸生成量的检测方法。它解决了目前γ－氨基丁酸生成量的检测方法设备投资大，成本高，费时长和操作复杂的缺陷。检测步骤a.取反应物和缓冲液加入微量呼吸仪的反应瓶主室，再将谷氨酸脱羧酶液加入反应瓶侧室；b.记录反应前平衡时左侧管内液柱高度h
文档编号G01N33/50GK101082557SQ200710072469
公开日2007年12月5日 申请日期2007年7月6日 优先权日2007年7月6日
发明者孙波, 迟玉杰, 张英华, 夏宁, 徐宁 申请人:东北农业大学