专利名称：Paa蛋白及由其制备的抗体与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及Paa蛋白及由其制备的抗体与应用。
背景技术：
肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage E. coli,EHEC)是毒力最强、致病性也最强的大肠杆菌，受到广泛的关注。EHEC感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(HC)，还可引发溶血性尿毒综合症(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡，致死率达5% 10%。2011年4月，德国暴发了肠出血性大肠杆菌0104 :H4感染和溶血性尿毒综合征(HUS)疫情，蔓延到欧洲和北美洲的16个国家。同年四、五月间，日本富山地区暴发了新感染疫情，血清型为0111，某些病例在引起HUS之后，出现了神经症状，并发弥散型血管内凝血和脑病。在EHEC中，致病性强、危害大的还有0157 :H7。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。 1999年在我国江苏、安徽两省有过大规模暴发流行，患者超过2万例，死亡177例。EHEC感染已经成为欧美国家儿童肾衰的首位病因，对人们的健康构成了巨大威胁。另外，作为一种重要的人兽共患病病原体，EHEC病原菌可长期驻留于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中，造成动物的腹泻，并污染畜禽的肉奶蛋制品以及水源和农作物等，给农牧业生产造成巨大的损失。因此，EHEC感染已经成为全球性的公共卫生问题。目前，临床针对EHEC感染主要采取对症治疗，因为抗生素治疗具有加剧病情的危险性而被谨慎使用，没有可以使用的疫苗和特异治疗药物。疫苗被认为是应对EHEC暴发流行和散发感染最简单，经济，快捷的手段。如果能发现和获得核心抗原或优势保护性抗原，就可以进一步发展为新型疫苗。黏附定植是细菌感染损伤的关键环节，细菌黏附于宿主上皮细胞导致A/E(Attaching and effacing, Α/E)病变。Tir、Intimin、Map、EspF、EspG、EspH、SepZ、EspB都是已被公认的由LEE编码的效应分子，都参与EHEC的Α/E损伤。但研究人员发现仍然存在另一些非LEE编码的效应分子。Paa (porcine attaching and effacing associated)为 753bp 基因编码的27. 6kDa蛋白，序列分析发现paa基因编码蛋白的氨基酸序列在0157 H7EDL933和Saikai中完全一致。染色体定位技术发现包含paa基因的区域位于染色体上,在yciD和yciE之间。Theresa等发现paa基因的EHEC缺失突变株会降低对hela细胞的黏附，同时也会降低某些细胞表面蛋白的分泌，这些蛋白有些对EHEC的分泌系统是不可或缺的，而这些分泌系统是EHEC黏附细胞的重要保障，所以Paa与EHEC的黏附有着某些关系。目前，多国科学家针对Paa蛋白的黏附功能和分子机制正展开研究，但迄今为止，还没有从免疫学角度上证实Paa分子在细菌感染检测、免疫防护方面的作用和功能。

发明内容
本发明的一个目的是提供Paa蛋白的新用途。
本发明提供的Paa蛋白在制备具有如下I) _3)中至少一种功能的产品中的应用I)预防和/或治疗由病原菌EHEC感染或引发的疾病；2)降低病原菌EHEC对肠道感染损伤；3)降低病原菌EHEC在肠道定值力；所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述应用中,所述产品为疫苗或药物。上述应用中，所述肠道为人或动物肠道，在本发明的实施例中动物肠道为小鼠肠道；所述病原菌EHEC为EHEC 0157 :H7。 Paa蛋白作为靶标或检测标志物在开发或制备诊断感染病原菌EHEC的产品中的应用也是本发明保护的范围；在上述应用中，所述Paa蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列2。本发明的另一个目的是提供一种产品。本发明提供的产品，其活性成分为Paa蛋白；所述产品为具有如下I) -3)中至少一种功能的产品I)预防和/或治疗由病原菌EHEC引发疾病；2)降低病原菌EHEC对肠道感染损伤；3)降低病原菌EHEC在肠道定值力。4)检测病原菌EHEC的感染。由Paa蛋白作为抗原制备的抗体也是本发明保护的范围；所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。检测Paa蛋白的产品在制备用于诊断病原菌EHEC产品中的应用也是本发明保护的范围；所述病原菌EHEC具体为EHEC 0157 H7 ;上述检测Paa蛋白的产品具体为上述的抗体。上述的抗体在制备提高宿主抗病原菌EHEC感染产品或提高宿主抗病原菌EHEC黏附产品中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述宿主具体为人或动物；宿主尤其具体为人或动物内的细胞；所述病原菌EHEC具体为EHEC 0157 H7 ;在本发明的实施例中，用来证明提高宿主抗病原菌EHEC黏附是通过hela细胞作为宿主进行试验的。本发明的第三个目的是提供一种产品。本发明提供的产品，其活性成分为上述的抗体；所述产品为具有如下I) -3)中至少一种功能的产品I)用于检测病原菌EHEC ；2)提高宿主抗病原菌EHEC感染；3)提高宿主抗病原菌EHEC黏附；其中宿主具体为人或动物；宿主尤其具体为人或动物内的细胞；所述病原菌EHEC具体为EHEC 0157 H7 ;在本发明的实施例中，用来证明提高宿主抗病原菌EHEC黏附是通过hela细胞作为宿主进行试验的。本发明的实验证明，本发明通过基因工程技术克隆获取Paa蛋白的编码基因、重组表达和纯化Paa蛋白，体内外评估Paa蛋白的免疫学功能等实验研究,证实(I) Paa蛋白可被0157 :H7感染血清所特异的、高效的识别，是EHEC病原菌重要的核心抗原，可作为抗原试剂用于感染诊断；(2)Paa免疫的小鼠能够减少肠道里EHEC的定植；(3)Paa蛋白免疫的小鼠可以抵制0157 H7攻毒，表明该蛋白可以作为针对EHEC弓丨发疾病的疫苗；(4) Paa蛋白可用来制备抗体或抗血清，该抗体或抗血清可以特异识别EHEC菌体蛋白，能够作为抗体试剂检测EHEC病原菌；(5)Paa蛋白的抗体或抗血清能够拮抗EHEC病原菌对靶细胞的黏附效应，有效干预病原菌在肠道的定植，从而显著减低或几乎完全抑制病原菌感染对机体造成的损伤；(6) Paa蛋白可激发机体产生特异应答，具有高水平的免疫原性，通过诱导高效免疫效应，抵抗病原菌感染所造成的损伤或死亡。


图I为Paa的纯化蛋白及WB印迹图2为抗体效价随免疫次数及间隔时间变化监测图3为免疫小鼠血清中IgA及IgG亚型的检测·图4为攻毒后小鼠排泄物中排菌量的检测图5为抗Paa抗血清的WB检验图6为Paa抗血清对细胞的抗黏附率
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。部分材料如下I、载体与菌株EHEC 0157 :H7EDL933株可由ATCC提供，目录号700927 ;公众也可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，该菌株EDL933株记载在L. ff. Riley,R. S. Remis, S. D. Helgerson, H. B. McGee, J. G. Wells, B. R. Davis, R. J. Hebert, E.
S.Olcott, L. M. Johnson, N. T. Hargrett, P. A. Blake, M. L. Cohen, Hemorrhagic colitisassociated with a rare Escherichia coli serotype, N. Engl, J. Med. 308 (1983)681685.中。pEASY-Tl 载体、E. coli DH5a、E.coli BL21 (DE3)感受态细胞购自 TransGen 公司，pET_22b (+)购自 Novagen。2、试剂与培养基NdeI和XhoI限制性核酸内切酶及T4连接酶购自NEB公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体及HRP标记的组氨酸抗体购自Pierce公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgGl抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG2a、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG2b抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG3抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgA抗体均购自Sigma公司；PCR所用的Taq酶以及DNAmarker (DL2000)购自TransGen公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自北京博迈德公司；其他化学试剂均为化学纯或分析纯；镍柱购自GE公司。
EHEC 0157 :H7 细菌培养采用 Luria-Bertani (LB, OxoidLTD, Basingstok,Hampshire, England)液体培养基及LB平板。工程菌培养均采用含氨苄青霉素终浓度100 μ g/ml的LB液体培养基及LB平板。3、生化与分子生物学试剂山梨醇麦康凯基础琼脂及山梨醇麦康凯琼脂添加剂购自青岛高科园海博生物技术有限公司；DEME培养基购自GIBCO公司；标准胎牛血清购自Biochrom公司；双抗购自Hyclone 公司。4、配制方法LB培养基的配制方法(IL) :Nacl IOg ;酵母粉5g ;蛋白胨10g。表1SDS-PAGE分离胶与浓缩胶的配制方法
权利要求
1.Paa蛋白在制备具有如下I) -3)中至少一种功能的产品中的应用 O预防和/或治疗由病原菌EHEC感染或引发的疾病； 2)降低病原菌EHEC对肠道感染损伤； 3)降低病原菌EHEC在肠道定值力； 所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述产品为疫苗或药物。
3.根据权利要求I或2所述的应用，其特征在于所述肠道为人或动物肠道；所述病原菌EHEC 为 EHEC 0157 :H7。
4.Paa蛋白作为靶标或检测标志物在开发或制备诊断感染病原菌EHEC的产品中的应用；所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
5.一种产品，其活性成分为Paa蛋白；所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2； 所述产品为具有如下I)-4)中至少一种功能的产品 1)预防和/或治疗由病原菌EHEC引发疾病； 2)降低病原菌EHEC对肠道感染损伤； 3)降低病原菌EHEC在肠道定值力。
4)检测病原菌EHEC的感染。
6.由Paa蛋白作为抗原制备的抗体；所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
7.根据权利要6所述的抗体，其特征在于所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
8.检测Paa蛋白的产品在制备用于诊断病原菌EHEC产品中的应用；所述病原菌EHEC具体为EHEC 0157 H7 ;所述检测Paa蛋白的产品具体为所述权利要求6或7所述的抗体。
9.权利要求6或7所述的抗体在制备提高宿主抗病原菌EHEC感染产品或提高宿主抗病原菌EHEC黏附产品中的应用； 所述宿主具体为人或动物；所述病原菌EHEC具体为EHEC 0157 :H7。
10.一种产品，其活性成分为权利要求6或7所述的抗体； 所述产品为具有如下I)-3)中至少一种功能的产品 1)用于检测病原菌EHEC； 2)提高宿主抗病原菌EHEC感染； 3)提高宿主抗病原菌EHEC黏附； 所述宿主具体为人或动物；所述病原菌EHEC具体为EHEC 0157 :H7。
全文摘要
本发明公开了Paa蛋白及由其制备的抗体与应用。本发明提供Paa蛋白在制备具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用1)预防和/或治疗由病原菌EHEC引发疾病；2)降低病原菌EHEC肠道感染损伤；3)降低病原菌EHEC在肠道定值力；所述Paa蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明通过基因工程技术克隆获取Paa蛋白的编码基因、重组表达和纯化Paa蛋白，体内外评估Paa蛋白的免疫学功能等实验研究，Paa蛋白可被O157H7感染血清所特异的、高效的识别，是EHEC病原菌重要的核心抗原，可作为抗原试剂用于感染诊断；Paa蛋白免疫的小鼠可以抵制O157H7攻毒，表明该蛋白可以作为针对EHEC引发疾病的疫苗。
文档编号G01N33/569GK102940875SQ20121042855
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者王慧, 李涛, 王琴, 韩燃 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所