专利名称：一种基于银增强的甲羟孕酮的检测方法
技术领域：
一种基于银增强的甲羟孕酮的检测方法，属于分析化学技术领域。
背景技术：
食品安全问题是关系国计民生的大问题。近年来，食品安全事件频繁发生，对食品 安全检测人员提出了更高的要求。ELISA以及金标试纸条的出现，一定程度上极大地解决了 食品安全快速现场检测的需求。然而，随着科技的进步，对于食品中超痕量的有毒有害物质 的检验，仍然没有得到很好的解决。诸如液相色谱，气相色谱能够在一定程度上满足超灵敏 检测，但由于昂贵的价格及专业的操作要求，使得不能很好的满足现场快速超灵敏检测的 要求。纳米技术的快速发展及在各个领域的广泛运用产生了很多交叉学科的新技术。美 国的Mirkin等人利用金纳米粒子的独特的光学性质，建立了基于金纳米粒子的比色分析 法。国内的樊春海等人利用金纳米粒子的标记作用，建立了基于金纳米粒子的电化学检测 方法。美国哈佛医学院建立了基于磁性纳米粒子的核磁共振免疫分析方法，实现了高通量 超灵敏检测。到目前，仍未见将纳米技术与ELISA技术结合的检测方法。本发明报道了将 纳米标记技术与传统的ELISA技术相结合的超灵敏检测方法的建立。研究结果表明基于金 纳米粒子标记及后续的银沉积增强的研究，能够很好地提高检测灵敏度，从而为食品安全 检测提供了行之有效的超灵敏检测新方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种基于纳米金标记及银沉积增强的超灵敏食品安全检测 方法。本发明的技术方案一种基于银增强的甲羟孕酮的检测方法，基于胶体金标记及 银沉积增强检测信号的超灵敏检测方法，共分5个步骤(1)胶体金的制备，(2)抗体的胶 体金标记，(3)胶体金表面银原位沉积、溶解及测定，(4)建立标准曲线，(5)实现实际样品 中甲羟孕酮MPA的检测；
(1)胶体金的制备
向处理过的干净的三角烧瓶中加入50 mL质量浓度为0. 01%的氯金酸溶液，搅拌，加 热至沸腾，保持5min ；—次性加入质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液2mL，边加热保持沸腾边 搅拌，溶液颜色从淡黄色依次变成浅蓝黑色，至深蓝黑色最后变成酒红色，当颜色不再变化 后，继续加热沸腾15 min使反应充分完全；最后，在搅拌的条件下，溶液冷却至室温，加蒸 馏水定容到50mL，得胶体金溶液，4°C保藏备用；
利用Frens法制备18nm左右的胶体金，此法简便，粒径均勻；
(2)抗体的胶体金标记
用0. IM的1(20)3溶液调节胶体金溶液的pH值为9.0，然后向其中加入羊抗兔二抗抗体， 使羊抗兔二抗抗体的浓度为100 μ g/mL,并在室温下反应4h后，离心并重新分散于0. OlMPH7. 4的PBS缓冲溶液中，得50 μ g/mL的金标羊抗兔二抗，4°C保存备用；
(3)胶体金表面银原位沉积、溶解及测定
用100 mL MPA-OVA的包被原包被96孔板，4°C过夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包 被原；用含1% BSA的0. 01 M PBS封闭96孔板，在37°C孵育Ih，用PBST溶液洗板3次；向 96孔中加入不同浓度MPA的标准溶液或实际样品溶液，加MPA的兔一抗，并在37°C孵育池； 用PBST溶液洗板5次后，每孔加入100 μ L的50 μ g/mL金标羊抗兔二抗，在37°C条件下 孵育池；用PBST溶液3次洗板之后，每孔加入100 μ L的银还原体系反应30min，用PBST溶 液洗板5次后，向每孔加入200 μ L的浓硝酸，然后震荡反应池，提取每孔的银溶液后，用原 子吸收光谱进行定量分析；
所述银还原体系由(a)质量浓度洲的明胶溶液6mL，(b)质量浓度5. 7%对苯二酚 3mL，(c) pH 3.5柠檬酸缓冲液lmL，和(d)质量浓度洲AgNO3溶液200 μ L四种溶液组 成的银还原体系；
(4)建立标准曲线根据步骤(3)所述由原子吸收光谱测定的银的浓度值，建立MPA的 浓度与银的浓度值(吸光度值)之间的关系，建立标准曲线；
(5)实现实际样品中MPA的检测步骤(3)中的由实际样品溶液所测得的银的浓度值 (吸光度值)与标准曲线对照，确定实际样品中MPA的浓度。本发明的有益效果本发明是在ELISA方法的基础上，利用金标记二抗代替传统 的酶标二抗，然后再利用银沉积在金纳米粒子的表面增强最后的检测信号，将沉积在金纳 米粒子表面的银溶解后，通过原子吸收光谱实现溶液中银含量的定量检测，从而实现样品 中有毒有害物质的超灵敏检测。该方法在传统的ELISA基础上进行改进，基于快速超灵敏 等特点，在食品安全检测等领域具有广泛的应用潜力。


图 1 15nm 金的 TEM 图。图2检测标准曲线。
具体实施例方式实施例1
(1)胶体金的制备
向处理过的干净的三角烧瓶中加入50 mL浓度为0. 01%的氯金酸溶液，搅拌，加热至沸 腾，保持5min，一次性加入1%的柠檬酸三钠溶液2mL，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色依 次变成浅蓝黑色，至深蓝黑色最后变成酒红色，当颜色不再变化后，继续加热15 min使反应 充分完全。最后，在搅拌的条件下，溶液冷却至室温，定容到50mL，4°C保藏备用。用TEM进 行粒径表征。(2)抗体的胶体金标记
用0. IM的1(20)3溶液调节胶体金溶液的PH值为9.0，然后向其中加入羊抗兔二抗抗体， 使羊抗兔二抗抗体的浓度为100 μ g/mL,并在室温下反应4h后，离心并重新分散于0. OlM PH7. 4的PBS缓冲溶液中，得50 μ g/mL的金标羊抗兔二抗，4°C保存备用；
(3)用100 mL MPA-OVA的包被原包被96孔板，4°C过夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包被原。用含1% BSA的0. 01 M PBS封闭96孔板，在37°C孵育lh。用PBST溶液洗板3 次。向96孔中加入不同浓度MPA的标准溶液或实际样品溶液，加MPA的兔一抗，并在37°C 孵育池。用PBST溶液洗板5次后，每孔加入100 μ L的50 μ g/mL金标羊抗兔二抗，在37°C 条件下孵育池。用PBST溶液洗板3次洗板之后，每孔加入100 μ L由(a) 2% (m/v)明 胶 6mL，(b) 5. 7% (m/v)对苯二酚 3mL，(c) pH 3. 5 柠檬酸缓冲液 lmL，和(d) 2% (m/v) AgNO3,溶液200 μ L这四种溶液组成的银还原体系，反应30min。用PBST溶液洗板5次后， 向每孔加入200 μ L的浓硝酸，然后震荡反应池，提取每孔的银溶液后，用原子吸收光谱进 行定量分析。(4)根据原子吸收光谱测定的银的浓度值，建立MPA的浓度与银的浓度值(吸光度) 之间的关系，建立标准曲线。(5)用该方法实现实际样品中MPA的检测步骤(3)中的由实际样品溶液所测得的 吸光度值与标准曲线对照，确定实际样品中MPA的浓度。
权利要求
1. 一种基于银增强的甲羟孕酮的检测方法，其特征在于基于胶体金标记及银沉积增强 检测信号的超灵敏检测方法，共分5个步骤(1)胶体金的制备，(2)抗体的胶体金标记，(3) 胶体金表面银原位沉积、溶解及测定，(4)建立标准曲线，(5)实现实际样品中甲羟孕酮MPA 的检测；(1)胶体金的制备向处理过的干净的三角烧瓶中加入50 mL质量浓度为0. 01%的氯金酸溶液，搅拌，加 热至沸腾，保持5min ；—次性加入质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液2mL，边加热保持沸腾边 搅拌，溶液颜色从淡黄色依次变成浅蓝黑色，至深蓝黑色最后变成酒红色，当颜色不再变化 后，继续加热沸腾15 min使反应充分完全；最后，在搅拌的条件下，溶液冷却至室温，加蒸 馏水定容到50mL，得胶体金溶液，4°C保藏备用；(2)抗体的胶体金标记用0. IM的K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值为9. 0，然后向其中加入羊抗兔二抗抗体， 使羊抗兔二抗抗体的浓度为100 μ g/mL,并在室温下反应4h后，离心并重新分散于0. OlM PH7. 4的PBS缓冲溶液中，得50 μ g/mL的金标羊抗兔二抗，4°C保存备用；(3)胶体金表面银原位沉积、溶解及测定用100 mL MPA-OVA的包被原包被96孔板，4°C过夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包 被原；用含1% BSA的0. 01 M PBS封闭96孔板，在37°C孵育lh，用PBST溶液洗板3次；向 96孔中加入不同浓度MPA的标准溶液或实际样品溶液，加MPA的兔一抗，并在37°C孵育池； 用PBST溶液洗板5次后，每孔加入100 μ L的50 μ g/mL金标羊抗兔二抗，在37°C条件下孵 育池；用PBST溶液3次洗板之后，每孔加入100 μ L的银还原体系反应30min，用PBST溶液 洗板5次后，向每孔加入200 μ L的浓硝酸，然后震荡反应池，提取每孔的银溶液后，用原子 吸收光谱进行定量分析；所述银还原体系由(a)质量浓度洲的明胶溶液6mL，(b)质量浓度5. 7%对苯二酚 3mL, (c) pH 3. 5柠檬酸缓冲液ImLjP (d)质量浓度m AgNO3溶液200 μ L四种溶液组成 的银还原体系；(4)建立标准曲线根据步骤(3)所述由原子吸收光谱测定的银的浓度值，建立MPA的 浓度与银的浓度值之间的关系，建立标准曲线；(5)实现实际样品中MPA的检测步骤(3)中的由实际样品溶液所测得的银的浓度值与 标准曲线对照，确定实际样品中MPA的浓度。
全文摘要
一种基于银增强的甲羟孕酮的检测方法，属于分析化学技术领域。本发明为基于胶体金标记及银沉积增强检测信号的超灵敏检测方法，共分5个步骤(1)胶体金的制备，(2)抗体的胶体金标记，(3)胶体金表面银原位沉积、溶解及测定，(4)建立标准曲线，(5)实现实际样品中甲羟孕酮MPA的检测。主要内容是在ELISA方法的基础上，利用金标记二抗代替传统的酶标二抗，然后再利用银沉积在金纳米粒子的表面增强最后的检测信号，将沉积在金纳米粒子表面的银溶解后，通过原子吸收光谱实现溶液中银含量的定量检测，从而实现样品中有毒有害物质的超灵敏检测。该方法在传统的ELISA基础上进行改进，基于快速超灵敏等特点，在食品安全检测等领域具有广泛的应用潜力。
文档编号G01N33/532GK102128931SQ201010597019
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者匡华, 孙凤霞, 彭池方, 朱颍越, 王利兵, 胡拥明, 胥传来, 陈伟 申请人:江南大学