专利名称：检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物鼠疫疫情监测与鼠疫诊断技术领域，是一种检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒。
背景技术：
鼠疫是我国《传染病法》规定的甲类传染病之一，是由鼠疫杆菌引起的一种动物源性烈性传染病，啮齿类是鼠疫的主要宿主动物和传染源。我国已发现鼠疫自然疫源地12个类型，分布于19个省区、近300个县(市)，面积130多万km2，动物间鼠疫处于持续活跃状态，人间鼠疫连年发生，远距离传播的危险性增加。我国在疫源地内设有专业鼠疫监测机构，监测结果是实施鼠疫控制措施的重要依据，免疫学方法检测鼠疫Fl抗体是鼠疫监测工作的重要内容，并己列入了《鼠疫诊断标准》WS279-2008。鼠疫监测工作中检测Fl抗体的标本主要是釆自野生动物，多数是各种小型啮齿类动物，野外工作条件差，很难保证标本质量，腐败变质的标本也要进行检验，间接血凝试验检测腐败变质标本常出现假阳性反应，有时高滴度非特异性凝集反应掩盖阳性反应，导致阳性标本出现阴性结果；胶体金试验检测鼠疫抗体不能定量，只有定性的意义；已知200余种动物可自然感染鼠疫，酶联免疫吸附试验间接法一种酶标第二抗体只能检测一种动物的抗体，全面监测疫源地内的动物，就要制备多种酶标第二抗体，不仅工作量大，而且不同种动物的酶标第二抗体间效价差异大，很难比较不同种动物间的鼠疫抗体含量，影响疫情监测工作中对动物鼠疫流行强度的评估。

发明内容
本发明提供了一种检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒，克服了现有鼠疫监测与诊断技术中存在的问题，本发明是通过应用酶联免疫吸附试验夹心法(以下简称ELISA夹心法)，用于检测各种动物血清、胸腔心血洗液、脏器组织浸液中的鼠疫菌的Fl抗体的方法，经多次改进，现己制成具体有效的检测动物鼠疫抗体的ELISA夹心法试剂盒，为动物鼠疫监测和诊断提供了准确、稳定、简便的检测试剂盒。
本发明的技术方案是通过以下措施来实现的一种检测动物鼠疫抗体的ELISA夹心法试剂盒，其包括酶标记鼠疫抗原1支、鼠疫Fl抗原包被板1块、抑制用冻干鼠疫Fl抗原 1支、酶标记物保存液2ml X 1支、10 XPBS. T20ml X 1支、鼠疫Fl抗体阳性对照2ml X 1支、 阴性对照2ml X 1支、显色液A液6ml X 1支、显色液B液6ml X 1支、显色终止液6ml X 1支、
硫柳汞2mlXl支；所述抗原包被板为鼠疫Fl抗原包被酶标板，所述酶标记抗原为冻干辣根过氧化物酶标记鼠疫Fl抗原。
对上述本发明的技术方案可进一步进行如下的选择或/和优化 上述鼠疫Fl抗原包被酶标板按下述方法得到
(1)包被用试剂包被缓冲液0. 05mol/LNa2C03溶液4份与0. 05mol/LNaHC036份混合；
包被液含鼠疫Fl抗原浓度0. 1-0. 5 μ g/ml (即微克/毫升)的包被缓冲液；饱和包被液包被缓冲液1000ml，加牛血清白蛋白0. Ig或新生小牛血清20ml ； PBS. T 10XPBS. T 用 0. 9% NaCl 稀释 10 倍；
(2)鼠疫Fl抗原包被酶标板测定包被液适用鼠疫Fl抗原浓度，每管加包被液200μ 1 (即微升)，28-37°C湿盒放置4小时，4-10°C放置4_16小时；
(3)饱和包被甩弃酶标板管内的包被液，每管加饱和包被液200μ1(即微升)，28-37°C 湿盒放置3小时；
(4)甩弃酶标板管内饱和包被液，在吸水纸上拍去管中水珠；每管加PBS.T200 μ 1 (即微升)浸洗，28-37°C湿盒放置3小时；甩弃PBS. T，流水冲洗5次，在吸水纸上用力拍打酶标板，直到酶标板管内外无可见水珠；
(5)酶标板直立放入37°C温箱，每30分钟鼓风或开门通风1次，6-12小时干燥后取出， 酶标板经上述处理后即为鼠疫Fl抗原包被酶标板；
(6)将鼠疫Fl抗原板装入塑料袋，封口；4-10°C干燥保存； 在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
上述冻干辣根过氧化物酶标记鼠疫Fl抗原即HRP-Fl按下述方法得到
(1)过碘酸钠活化辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶的RZ> 3. 0简称HRP，称取HRP5mg 装入12X 120mm试管，加入蒸溜水1ml，摇动使HRP溶解；加入新鲜配制的1. 3%过碘酸钠水溶液0. 5ml，混勻置4-10°C30分钟；加入浓度按容量/容量的的乙二醇水溶液0. 5ml，室温20-37°C放置30分钟；
(2)透析法标记鼠疫Fl抗原纯化的5mg/ml鼠疫Fl抗原溶液1ml，与活化的HRP混勻，装入透析袋，用0. 05mol/LpH9. 6碳酸盐缓冲液4-10°C透析12-16小时；加入0. 5%硼氢化钠溶液0. 2ml,置4-10°C冰箱中2小时；
(3)纯化酶标记物透析袋移入0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液即PBS200ml中透析 6-12小时，换PBS液2次；3000 X g离心10分钟取上清，上清即为酶标记鼠疫Fl抗原溶液， ELISA夹心法测定效价，效价应在1 :6000以上；
(4)分装冻干酶标记鼠疫Fl抗原溶液用容量/容量含50%新生小牛血清的0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀释到效价1 :100，分装，冻干，_20°C保存；
在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
本发明的有益效果间接法一种酶标记第二抗体只能检测一种动物的抗体；本发明检测动物鼠疫抗体ELISA夹心法试剂盒的有益效果是，被测物是鼠疫Fl抗体，标本经高浓度杀菌剂杀菌，检测过程安全；被测抗体经包被抗原和酶标抗原两次特异性选择结合，提高了检测的特异性；酶标仪检测OD值具有定量的意义，目测判定结果，可在无电源的野外现场应用；增加了抑制试验程序，排除了非特异性反应对阳性结果的干扰，保证检测结果的准确性。ELISA夹心法检测动物鼠疫抗体，酶标记鼠疫Fl抗原替代酶标记第二抗体，一种酶标记物可以检测各种动物的鼠疫Fl抗体，减少了制备多种酶标第二抗体的麻烦及其质量差异对结果的影响，特别适用于鼠疫疫源地调查和疫情监测。
具体实施例方式 本发明不受下述实施例的限制，可依据本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
下述实施例中，无特别说明均为常规方法；溶液浓度除注明外均为重量/容量。
实施例1 检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒制备一、检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒制备
(一)检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒的组成
1.鼠疫Fl抗原板8管X 12条 1块
2.酶标记鼠疫Fl抗原冻干 1支 3.抑制用鼠疫Fl抗原冻干 1支
4.酶标记物保存液2ml 1支
5.10 X PBS. T20ml 1 瓶
6.鼠疫Fl抗体阳性对照2ml 1支
7.鼠疫Fl抗体阴性对照2ml 1支
8.TMB显色液A液6ml 1瓶B液6ml 1瓶
9.显色终止液6ml 1瓶
10.硫柳汞2ml 1瓶
(二)各组分的制备方法 1.鼠疫Fl抗原板制备
(1)包被用试剂包被缓冲液0. 05mol/LNa2C03溶液4份与0. 05mol/LNaHC036份混合。
包被液含鼠疫Fl抗原浓度0. 1-0. 5 μ g/ml (即微克/毫升)的包被缓冲液； 饱和包被液包被缓冲液1000ml，加牛血清白蛋白0. Ig或新生小牛血清20ml ； PBS. T 10XPBS. T 用 0. 9% NaCl 稀释 10 倍。
(2)鼠疫Fl抗原包被酶标板测定包被液适用鼠疫Fl抗原浓度，每管加包被液 200 μ 1 (即微升)，28-37°C湿盒放置4小时，4_10°C放置4-16小时；
(3)饱和包被甩弃酶标板管内的包被液，每管加饱和包被液200μ1(即微升)，28-37°C 湿盒放置3小时；
(4)甩弃酶标板管内饱和包被液，在吸水纸上拍去管中水珠；每管加PBS.T200 μ 1 (即微升)浸洗，28-37°C湿盒放置3小时；甩弃PBS. T，流水冲洗5次，在吸水纸上用力拍打酶标板，直到酶标板管内外无可见水珠；
(5)酶标板直立放入37°C温箱，每30分钟鼓风或开门通风1次，6-12小时干燥后取出， 酶标板经上述处理后即为鼠疫Fl抗原包被酶标板；
(6)将鼠疫Fl抗原板装入塑料袋，封口；4-10°C干燥保存； 在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
2.辣根过氧化物酶标记鼠疫Fl抗原即HRP-Fl制备
(1)过碘酸钠活化辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶的RZ> 3. 0简称HRP，称取HRP5mg 装入12X 120mm试管，加入蒸溜水1ml，摇动使HRP溶解；加入新鲜配制的1. 3%过碘酸钠水溶液0. 5ml，混勻置4-10°C30分钟；加入浓度按容量/容量的的乙二醇水溶液0. 5ml，室温20-37°C放置30分钟；
(2)透析法标记鼠疫Fl抗原纯化的5mg/ml鼠疫Fl抗原溶液1ml，与活化的HRP混勻，装入透析袋，用0. 05mol/LpH9. 6碳酸盐缓冲液4-10°C透析12-16小时；加入0. 5%硼氢化钠溶液0. 2ml,置4-10°C冰箱中2小时；
(3)纯化酶标记物透析袋移入0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液即PBS200ml中透析 6-12小时，换PBS液2次；3000 X g离心10分钟取上清，上清即为酶标记鼠疫Fl抗原溶液， ELISA夹心法测定效价，效价应在1 :6000以上；
(4)分装冻干酶标记鼠疫Fl抗原溶液用容量/容量含50%新生小牛血清的0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀释到效价1 :100，分装，冻干，_20°C保存；
在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
3.抑制用鼠疫Fl抗原0. lmol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液30ml，加硫柳汞0. lg，新生小牛血清20ml，加鼠疫Fl抗原2. 5mg，混勻，分装，每支0. 2ml，冻干，_20°C保存。
4.酶标记物保存液即甘油.PB制备0. lmol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液与等量丙三醇混合。
5. 10 X PBS. T 制备0· lmol/LNa2HP048 份和 0. lmol/LNaH2P042 份混合，每 1000ml， 加吐温-200. 5ml，新生小牛血清10ml，硫柳汞0. lg。
6.鼠疫Fl抗体阳性对照制备0. 01mol/LpH7. 2PBS480ml，加新生小牛血清10ml， 效价1 8000鼠疫Fl抗体血清10ml，硫柳汞0. lg。
7.阴性对照制备0. 01mol/LpH7. 2PBS500ml，加新生小牛血清IOml,加硫柳汞 0. Ig0 8. TMB显色液制备
A 液0. 2mol/LNa2HP04500ml 与 0. lmol/L 柠檬酸 500ml 混合，加 30%的双氧水 0. 5ml, 硫柳汞0. Igo B液3. 3-5. 5_四甲基联苯胺250mg，无水乙醇100ml，加水900ml，硫柳汞0. lg。
9.显色终止液制备蒸馏水450ml加硫酸50ml。
10. 硫柳汞硫柳汞lg，NaCllg，加蒸馏水至100ml。
上述制备好的各种试剂定量分装，装入检测鼠疫抗体的ELISA夹心法试剂盒。
(三)试剂盒质量标准按说明书配制试剂，并按ELISA夹心法程序检测，检测0. 01 μ g/ml鼠疫Fl抗体液， OD值> 0. 2 ；检测阴性标本，OD值< 0. 1。
实施例2 检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒的应用方法一、ELISA夹心法检测鼠疫Fl抗体的器材准备与试剂配制
1. PBS. T 10 XPBS. T 用 0. 9%NaCl 稀释 10 倍。
2. HRP-Fl贮存液每支HRP-Fl (冻干剂)加酶标记物保存液溶解，混勻，_20°C保存，有效期6个月。
HRP-Fl应用液=HRP-Fl贮存液按说明书规定的量用PBS. T稀释，4°C可保存10天， 室温1天内使用。
3.抑制用鼠疫Fl抗原按说明书规定的量用PBS. T溶解混勻。
4.显色液显色液A液和B液等量混合，避光保存1小时内使用。
二、ELISA夹心法检测鼠疫抗体的标本准备
1.动物采血，分离血清，加硫柳汞或升汞杀菌防腐。
2.死亡小型动物，剪开胸腔，剪碎心脏，吸出胸腔心血洗液，2000X g离心5分钟或静置1小时后取上清液，紧急情况下，可用注射器针头插入棉球抽滤。加硫柳汞或升汞杀菌防腐；
3.装血清、胸腔心血洗液试管封口后，用消毒液浸泡消毒试管外部，供免疫学检验。
三、ELISA夹心法检测鼠疫抗体初筛(定性)试验
1.排列鼠疫Fl抗原包被酶标板(兰头)反应小管根据标本和阳性、阴性对照的数量，把小管安装在编号的酶标反应板支架上，每管加PBS. T50 μ 1。
2.加标本按登记编号位置每管加1份标本50 μ 1，置于湿盒内。适宜温度为28°C， 静置90分钟，甩去反应液。20-40°C均可进行，低于28°C时，温度每低1°C延长反应时间2 分钟，可获得与适宜温度基本相同的结果。
3.冲洗流水冲洗鼠疫Fl包被酶标板，甩去反应液，立即给每小管注满水，甩去 7jC，再注满水，再甩去水，如此反复冲洗5次；酶标板管□向下，在吸水纸、滤纸上拍去鼠疫 Fl包被酶标板孔内与表面水珠。野外可用水壶、洗瓶装煮沸冷却澄清的泉水、河水冲洗反应板，方法同上。
4.加酶标记鼠疫Fl抗原应用液鼠疫Fl抗原板每小管加酶标记鼠疫Fl抗原应用液ΙΟΟμΙ，加盖、置于湿盒内。反应温度同3. (2)，反应时间60分钟，冲洗方法同3。
5.显色鼠疫Fl抗原包被酶标板每小管加TMB显色液的A液和B液各50 μ 1，反应20分钟，阳性反应呈兰色；阴性反应为无色或显色很淡。
6.终止显色每小管加显色终止液50 μ 1，显色液兰色变为黄色，阴性仍为无色或颜色很淡。
7.观测记录试验结果目测平持反应板，距白色背景15_20mm，从板的正上方向下观察。阴性(一)无色或颜色很淡；阳性(+ )颜色明显可见，(++)浅黄棕色，(+++)与阳性对照颜色相同，(++++)深棕黄色比阳性对照颜色深。
比色计比色TMB显色液用波长450nm，阴性标本为对照，标本OD > 0. 20为阳性。
8.登记检验结果
四、检测反应滴度试验与抑制试验(复试)
检测鼠疫Fl抗体初筛显色(+ )、(++)、(+++)、(++++)标本，全部要同步做检测反应滴度试验和抑制试验。
(一 )检测反应滴度试验
1.阳性标本按(+ )、(++)、(+++)、(++++)分别排列，并详细记录。排列小管根据标本数和反应强弱排列小管，每小管加PBS. TlOOul。一般(+)，(++)用4个小管；(+++)用6-8 个小管；(++++)用8-12个小管，亦可将(++++)标本稀释32-64倍后再测反应滴度。
2.每排首管加1份待检标本lOOul，吹吸3次，移入第2管，如此连续2倍稀释到最末管；阳性对照标本同步稀释，加盖、置于湿盒内反应。
3-8.操作步骤同初筛试验，(+ )为阳性反应滴度终点。
( 二)抑制试验
1.初筛阳性的标本都要做抑制试验，抑制试验和测反应滴度试验同步进行。
2.抑制试验与测反应滴度试验的不同之处为PBS. T含鼠疫Fl抗原1_2 μ g/ml。
(三)观测登记检验结果 1.观测检验结果目测阳性(+)颜色明显可见的最高稀释度为反应滴度终点。
比色计比色标本OD > 0. 20的最高稀释度为反应滴度终点。
2.检测滴度试验、抑制试验反应滴度用1 :2n表示，η为2的倍数。
3.标本的抑制试验反应滴度比检测滴度试验反应滴度低2个或2个以上滴度为抑制试验阳性，抑制试验阳性的标本才能判定为检测鼠疫Fl抗体试验阳性。
权利要求
1.一种检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒，其特征在于包括酶标 记鼠疫抗原1支、鼠疫Fl抗原包被板1块、抑制用冻干鼠疫Fl抗原1支、酶标记物保存液 2ml X 1支、10 X PBS. T20ml X 1支、鼠疫Fl抗体阳性对照2ml X 1支、阴性对照2ml X 1支、显 色液A液6ml X 1支、显色液B液6ml X 1支、显色终止液6ml X 1支、1 %硫柳汞2ml X 1支； 所述抗原包被板为鼠疫Fl抗原包被酶标板，所述酶标记抗原为冻干辣根过氧化物酶标记 鼠疫Fl抗原。
2.根据权利要求1所述的检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒，其特 征在于鼠疫Fl抗原包被酶标板按下述方法得到(1)包被用试剂包被缓冲液0.05mol/LNa2C03溶液4份与0. 05mol/LNaHC036份混合；包被液含鼠疫Fl抗原浓度0. 1-0. 5微克/毫升的包被缓冲液；饱和包被液包被缓冲液1000ml，加牛血清白蛋白0. Ig或新生小牛血清20ml ；PBS. T 10XPBS. T 用 0. 9% NaCl 稀释 10 倍；(2)鼠疫Fl抗原包被酶标板测定包被液适用鼠疫Fl抗原浓度，每管加包被液200微 升，28-37°C湿盒放置4小时，4-10°C放置4-16小时；(3)饱和包被甩弃酶标板管内的包被液，每管加饱和包被液200微升，28-37°C湿盒放 置3小时；(4)甩弃酶标板管内饱和包被液，在吸水纸上拍去管中水珠；每管加PBS.T200微升浸 洗，28-37°C湿盒放置3小时；甩弃PBS. T，流水冲洗5次，在吸水纸上用力拍打酶标板，直到 酶标板管内外无可见水珠；(5)酶标板直立放入37°C温箱，每30分钟鼓风或开门通风1次，6-12小时干燥后取出， 酶标板经上述处理后即为鼠疫Fl抗原包被酶标板；(6)将鼠疫Fl抗原板装入塑料袋，封口；4-10°C干燥保存；在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
3.根据权利要求1所述的检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒，其特 征在于冻干辣根过氧化物酶标记鼠疫Fl抗原按下述方法得到(1)过碘酸钠活化辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶的RZ> 3. 0简称HRP，称取HRP5mg 装入12X 120mm试管，加入蒸溜水1ml，摇动使HRP溶解；加入新鲜配制的1. 3%过碘酸钠水 溶液0. 5ml，混勻置4-10°C30分钟；加入浓度按容量/容量的的乙二醇水溶液0. 5ml，室 温20-37°C放置30分钟；(2)透析法标记鼠疫Fl抗原纯化的5mg/ml鼠疫Fl抗原溶液1ml，与活化的HRP混 勻，装入透析袋，用0. 05mol/LpH9. 6碳酸盐缓冲液4-10°C透析12-16小时；加入0. 5%硼氢 化钠溶液0. 2ml,置4-10°C冰箱中2小时；(3)纯化酶标记物透析袋移入0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液200ml中透析6_12小 时，换PBS液2次；3000 Xg离心10分钟取上清，上清即为酶标记鼠疫Fl抗原溶液，ELISA 夹心法测定效价，效价应在1 :6000以上；(4)分装冻干酶标记鼠疫Fl抗原溶液用容量/容量含50%新生小牛血清的0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀释到效价1 :100，分装，冻干，-20°C保存；在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
全文摘要
本发明涉及动物鼠疫疫情监测与鼠疫诊断技术领域，是一种检测动物鼠疫抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)夹心法试剂盒，包括酶标记抗原、抗原包被酶标板、抑制用鼠疫F1抗原；所述抗原包被酶标板为鼠疫F1抗原包被酶标板，所述酶标记抗原为冻干辣根过氧化物酶标记鼠疫F1抗原。间接法一种酶标记第二抗体只能检测一种动物的抗体；本发明检测动物鼠疫抗体ELISA夹心法试剂盒的有益效果是，被测物是鼠疫F1抗体，标本经高浓度杀菌剂杀菌，检测过程安全；被测抗体经包被抗原和酶标抗原两次特异性选择结合，提高了检测的特异性；酶标仪检测OD值具有定量的意义，可在野外现场应用；增加了抑制试验程序，提高了检测结果的准确性。
文档编号G01N33/535GK101846682SQ20101020199
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者徐兵, 热娜·吐尔地, 雷刚, 蒋卫, 丁雄杰, 唐建国 申请人:新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心