专利名称：一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成及应用，合成的抗原用紫外分光光度法进行鉴定，并将其用于酶联免疫分析和胶体金免疫层析试纸条的制备，属于生物化工技术领域。
背景技术：
拟除虫菊酯类农药,英文名称Pyrethroid insecticides,是一类在天然除虫菊酯化学结构研究基础上发展而来的仿生杀虫剂，具有灭虫速度快、残效时间短、对高等动物及鸟类毒性低，使用安全等优点，被广泛用于茶园、果园、牧业和家庭的害虫防治，因此，拟除虫菊酯类农药已成为现代杀虫剂的主要支柱产品之一。但长期大量地施用该农药，造成了严重的环境污染和食品安全隐患。同时研究表明，拟除虫菊酯类农药对于鱼、虾、鳖等水生生物的毒性比较大。因此，建立拟除虫菊酯类农药残留的快速检测技术，具有十分重要的环境意义。目前，用于检测拟除虫菊酯类农药的方法有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)，色谱和质谱的联用技术、毛细管电泳法等，但是这些仪器分析方法都需要经过繁琐的样品制备过程，而这些前处理过程不仅耗时费钱，而且可能会造成痕量拟除虫菊酯类农药丢失；而酶联免疫检测技术和免疫层析试纸条方法相结合，正好可以弥补这些方法的不足。近年来，检测拟除虫菊酯类农药多残留的酶联免疫分析法已经建立，但是酶联免疫分析试剂盒的测定时间长，需要酶标仪读数，不适合现场的快速检测。而胶体金免疫层析试纸条用于检测样品时，结果可以用肉眼直接观察，成本低、时间短，特别适合于现场粗测。而在制备拟除虫菊酯类农药金标试纸条过程中，若包被抗原对相应单克隆抗体的亲和力过高，导致抗体的灵敏度下降；反之，若包被抗原对相应单克隆抗体的亲和力太低，导致检测线不显色。因此，只有在包被抗原对相应抗体的亲和力合适时，才能进行胶体金免疫层析试纸条的制备。本发明设计并合成了一种新型的拟除虫菊酯类农药的通用包被半抗原，利用重氮化法偶联载体蛋白BSA，合成包被原，将其用于免疫分析和制备胶体金免疫层析试纸条，取得了很好的效果。目前，尚没有报道关于该包被原的制备以及将其用于拟除虫菊酯类农药的胶体金免疫层析试纸条的制备。

发明内容
本发明目的提供了一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成及应用。合成的抗原采用紫外分光光度法进行鉴定，将该包被抗原用于拟除虫菊酯类农药的免疫分析和胶体金免疫层析试纸条的制备，为今后快速检测拟除虫菊酯类农药提供了有利条件。本发明的技术方案:一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成方法，以3-苯氧苯甲酸和对硝基苯丙氨酸为原料，经过2步化学反应，得到拟除虫菊酯类农药的通用半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联，用紫外分光光度法来鉴定和估算偶联物的偶联t匕。其反应方程式为
权利要求
1.一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成方法，其特征在于以3-苯氧苯甲酸和对硝基苯丙氨酸为原料，经过2步化学反应，合成拟除虫菊酯类农药的通用半抗原，用重氮化法将其和载体蛋白BSA偶联，用紫外分光光度法进行鉴定；合成步骤为: (1)半抗原的合成 ①化合物3:N- (3-苯氧基苯酰)-4-硝基-L-苯丙氨酸的合成 该反应在N2保护下，将500mg化合物1:3_苯氧苯甲酸溶于IOmL氯仿中，溶解后将其置于冰浴中，然后向其中滴加5 μ L的DMF和0.33mL氯化亚砜，搅拌5min后撤掉冰浴，然后在65°C油浴中加热lh，旋转蒸发除去氯仿及多余的氯化亚砜，得到无色透明的液体，加入ImL四氢呋喃将其溶解，为a液；接着将480mg化合物2:对硝基苯丙氨酸和380mg碳酸钾溶于IOmL水中，为b液；然后在IOmin内将a液缓慢滴加到强力搅拌下的b液中，反应Ih后，用每次50mL乙酸乙酯萃取两次，接着用每次30mL质量浓度0.8%NaCl盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，过滤旋干得到0.5g黄色胶状化合物3，直接用于下步； ②化合物4:N- (3-苯氧基苯酰)-4-氨基-L-苯丙氨酸的合成 将0.5g化合物3和50mg钯碳Pd/C加入到IOmL乙酸乙酯中，在25°C下氢化2h，用薄层层析法监测反应进程，点板显示，原料完全反应时停止反应，过滤除去催化剂，旋蒸得到一灰白色固体，再加入IOmL乙酸乙酯稀释,接着在超声波仪中超声IOmin,过滤得到湿品，红外烘箱下干燥，得到165mg化合物4，即拟除虫菊酯类农药通用包被半抗原； (2)包被抗原的制备 ①制备A液:称取0.027mmol半抗原化合物4于IOmL小瓶中，先滴入几点乙醇将其溶解，然后逐滴加入0.5mL、lmol/L盐酸,溶液会变浑,冷却至0_5°C,然后逐滴加入现配好的质量浓度30%亚硝酸钠溶液，用淀粉碘化钾试纸监测亚硝酸钠的用量，直到试纸在15s内变蓝为止，停止滴加亚硝酸钠溶液，接着在0°C下搅拌反应45min，得到A液； ②制备B液:称取30mg的牛血清白蛋白溶于6mL、0.2M、pH8.8的硼酸盐缓冲液，得到B液； ③在冰浴搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，并用lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH，将PH保持在8.5，冰浴下搅拌反应3h，得到包被抗原粗品； ④将反应好的包被抗原移入透析袋中，用0.01M、pH7.2磷酸盐缓冲液透析3天，期间更换透析液6-8次，得到包被抗原:即半抗原-BSA偶联物； (3)包被抗原用紫外分光光度法进行鉴定。
2.用权利要求1所述方法合成的拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的应用，其特征在于用于酶联免疫分析和胶体金免疫层析试纸条的制备。
全文摘要
一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成及应用，属于生物化工技术领域。本发明以3-苯氧苯甲酸和对硝基苯丙氨酸为原料，经过2步化学反应，合成拟除虫菊酯类农药的通用包被半抗原，用重氮化法将其和载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，用紫外分光光度法进行鉴定和估算偶联物的偶联比。合成的偶联物(包被抗原)用于酶联免疫分析和胶体金免疫层析试纸条的制备。通过酶联免疫分析和胶体金免疫层析试纸条的制备，证明本发明成功地合成了拟除虫菊酯类农药通用包被抗原，为人们建立拟除虫菊酯类农药的免疫分析方法提供了基础；同时也满足了国内对拟除虫菊酯类农药的快速检测的需求。
文档编号G01N33/543GK103149351SQ20131009386
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者匡华, 陈秀金, 胥传来, 徐利广, 马丽萍, 刘丽强, 王利兵, 丁利, 马伟, 宋姗姗 申请人:江南大学