专利名称：含有hbv－rna的hbv颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有乙型肝炎病毒(HBV)-RNA的病毒颗粒，其对于拉米呋啶(ラミブヅン)等乙型慢性肝炎治疗药的治疗效果的判定等有用。
背景技术：
现在估计，乙型肝炎病毒(HBV)的感染在全世界已达3亿人左右。HBV的感染引起急性以及慢性的肝炎(乙型肝炎)，进而成为肝硬化和肝癌的成因。
在HBV感染患者血清中，作为HBV颗粒，除了丹氏粒(具有感染性的完整HBV颗粒)之外，还存在具有不完整HBV-DNA的颗粒和以HBsAg形成的小型球状颗粒，管状颗粒。进而，还存在含有前核心蛋白质作为结构蛋白的不具有HBV-DNA的颗粒(特愿2002-261666)。本发明的HBV颗粒包括所有这些颗粒。
乙型肝炎的诊断中，除了肝组织影像之外，还可以使用ALT，HBsAg，HBsAb，HBcAb，HBeAb，HBV聚合酶，HBV-DNA量等血清标记。其中，抗病毒剂的治疗效果的判定中关注于血中HBV-DNA量。也就是说，HBV-DNA量显著降低或者达到测定敏感度以下，且该状态长期维持，其它指标也良好时，就判断为显示出高治疗效果。
HBV基因由约3200个碱基对构成，其为环状不完整双链DNA。该HBV基因的复制中存在逆转录的过程。如果要对复制过程划分，则可分为以下四个阶段。(1)细胞核中通过内源性DNA聚合酶形成完整的双链环状DNA，其通过环化形成环化双链DNA(共价闭环DNAcccDNA)。这种cccDNA呈超螺旋结构。(2)以cccDNA作为模板，通过细胞的RNA聚合酶II转录mRNA。其中，最长的3.5kb转录物作为前基因组RNA成为逆转录的模板。(3)核心颗粒中通过RNA依赖性DNA聚合酶合成作为引物的寡核苷酸，以前基因组RNA作为模板通过逆转录合成(-)链DNA。(4)以位于前基因组RNA的5’末端的寡核苷酸作为引物，以(-)链DNA作为模板合成(+)链DNA。
核心蛋白质与前基因组RNA一起形成核衣壳颗粒，但是在其内腔中在合成上述这样的HBV-DNA之后开始，形成包含于含有HBsAg的被膜中的HBV颗粒(Gerelsaikhan，T.等人，J.Virol.，704296-4274，1996)。因此逐渐认为仅具有HBV-RNA的病毒颗粒不存在于细胞外。
血清中的HBV-RNA的存在已经由Su等人公开(Su，Q.等人，ClinicalCancer Research，72005-2015，2001)。这种HBV-RNA的存在样式并不清楚，但是由于除了上述见解之外即使病毒标记呈阴性也存在HBV-RNA阳性例，推测不是以包裹在病毒衣壳内的病毒颗粒和小型球状颗粒，管状颗粒，而是以包裹于细胞膜小泡中的状态被释放出来。此外，据Miller等报道，血中HBV颗粒含有DNA-RNA杂合分子(Miller，R.H.等人，Virology，13953-63，1984)，其提示还存在HBV-DNA和HBV-RNA这两者的病毒颗粒。
一般认为，通过抑制上述病毒增殖过程的任意过程，抑制HBV基因的复制，可以抑制病毒的增殖。这里对具有代表性的HBV治疗药物拉米呋啶就现有技术进行说明，但是本发明的病毒颗粒不仅与通过拉米呋啶的治疗有关系。HBV的复制中存在逆转录过程，由于人免疫缺陷病毒(HIV)在其增殖中也需要逆转录酶，因此开始进行作为治疗药的RNA依赖性DNA聚合酶的筛选。
由于拉米呋啶也特异性抑制人免疫缺陷型病毒(HIV)的复制过程的逆转录，因此当初将其作为HIV治疗药开发，但是清楚了其对于HBV也显示出增殖抑制效果，自1992年起就开始了作为乙型肝炎的治疗药的开发。
拉米呋啶对HBV的作用机制并没有被清楚地阐述，但是一般持如下观点。拉米呋啶是核苷(胞苷)衍生物的抗病毒剂，其在细胞内形成磷酸化成三磷酸衍生物的活性型。该药物对HBV的增殖抑制机理之一是通过抑制RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)抑制前基因组RNA的逆转录。
一般认为另一种机理是整合到病毒DNA链中，终止其延伸。
通过这些作用机理，逐渐可以将拉米呋啶广泛用作HBV感染疾病的治疗药，但是还存在血中HBV-DNA量难以减少的病例，其后出现抗性株和肝炎复发的问题也很多。此外，HBV-DNA量降低至测定界限以下的例子中出现药物抗性株的例子不少，对于通过HBV-DNA量判定治疗效果现在仍然存在问题。
用拉米呋啶等具有逆转录抑制活性的药物大幅减少血中HBV-DNA量，但是HBV病毒作为cccDNA存在于肝脏中，据报道这种cccDNA并不怎么减少(Locarnini，S.，C.Birch，J.Hepatol.，30536-550，1999)。因此，在判定这种药物的治疗效果中仅用HBV-DNA量并不充分，还存在例如进行通过肝组织学检查的情况。但是，肝组织学检查不得不给患者增加伴随着痛苦的极大的负担。
因此，如果存在通过例如血液检查反映肝脏中HBV量的标记，对于治疗效果的判定是很有用的，不仅可以减轻患者的负担也可以使更有效的治疗成为可能。
我们出于这种考虑进行了研究，与以往的报告相反，开始发现血液中存在不合有HBV-DNA而含有HBV-RNA的病毒颗粒。进而，开发了这种病毒颗粒的测定法，显示出该测定结果成为对于治疗效果有用的标记。
非专利文献1Gerelsaikhan，T.等人，J.Virol.，704296-4274，1996非专利文献2Su，Q.等人，Clinical Cancer Research，72005-2015，2001非专利文献3Miller，R.H.等人，Virology，13953-63，1984非专利文献4Locarnini，S.，C.Birch，J.Hepatol.，30536-550，1999
发明的公开如前面所述，对由药物产生的治疗效果的判定中血清HBV-DNA量倍受重视，但是这个判定作为判定标准还不充分。
因此本发明的目的在于提供对于有助于判定拉米呋啶等具有逆转录抑制效果的乙型肝炎治疗药的治疗效果的病毒颗粒。
通过测定这种病毒颗粒，可以开发能够对乙型肝炎的有效治疗有贡献的新型诊断药。
本发明提供了一种存在于血液等体液中含有HBV-RNA但不含有HBV-DNA的HBV颗粒。这种颗粒在具有HBV的结构蛋白这一点上与Su等人的报告中记载的血清中HBV-RNA不同，此外，由于不含有HBV-DNA，因此与含有HBV-DNA和HBV-RNA这两者的病毒颗粒也不同。
此外，本发明还提供一种测定这种HBV颗粒的方法。
进而，本发明还提供了一种通过使用RT-PCR定量HBV-RNA，从而定量该HBV颗粒的方法。
根据本发明可以期待使乙型肝炎的治疗成绩提高，避免抗性株和肝炎复发的效果。
本发明涉及一种在以拉米呋啶为代表的具有RNA依赖性DNA聚合酶抑制效果的药物进行的乙型肝炎病毒(HBV)感染疾病的治疗中，通过测定HBV-RNA，判定治疗效果的方法。
此外，本发明包括同时检测HBV-DNA和HBV-RNA的方法。
进而本发明还提供检测上述HBV-RNA的方法，或诊断药，诊断试剂盒。
用于实施发明的最佳方式下面，对本发明进行详细地说明。
本申请发明人对进行了拉米呋啶治疗的患者血清中的HBV-DNA和HBcAg进行了测定。其结果发现，存在着如下试样HBV-DNA从经拉米呋啶治疗的患者血清中完全消失，HBcAg减少，但是没有完全消失。
如果对这些试样进行HBV-RNA测定，就清楚了其显示出与HBV-DNA不同的动态。最后证明了在进行了拉米呋啶治疗的患者试样中存在HBV-RNA和HBV的结构蛋白，但是HBV-DNA消失。一般认为，由于血清等患者试样中存在大量分解RNA的RNase，因此HBV-RNA在试样中不以游离的状态存在，而是与HBcAg和HBsAg等HBV结构蛋白形成不完整的病毒颗粒。
由不含这种HBV-DNA而含有HBV-RNA的HBV结构蛋白制备的HBV颗粒是新物质。此外，一般认为，在以具有RNA依赖性DNA聚合酶抑制效果的药物进行的HBV感染疾病的治疗中，利用测定这种HBV颗粒以判定药物的治疗效果。在具有RNA依赖性DNA聚合酶抑制效果的药物为拉米呋啶时尤为有用。进而，对于预测肝癌发生的危险度，或者筛选肝癌发生的危险群也有用。
为了测定这种病毒颗粒，如果是能够测定试样中的HBV-RNA的方法，也可以使用任意一种方法。优选可以例举有逆转录(RT)-PCR。此外为了测定病毒颗粒，不仅测定RNA还可以测定与HBV-RNA形成颗粒的HBV结构蛋白。
实施例以下的实施例是例证本发明的实施例，但是本发明的范围不受其限制。
实施例1.血清中HBV基因量的测定(A)HBV前基因组的纯化为了分离丹氏粒(具有感染性的HBV颗粒完整HBV颗粒)中的HBV基因，用High Pure病毒核酸试剂盒(Roche Diagnostics公司)按以下方法纯化HBV患者血清。混合100μL接受了拉米呋啶治疗的HBV患者血清和100μL正常人血清制成200μL血清样品。向血清样品中加入200μL工作液[50μL polyA载体RNA(4mg/ml)和2.5mL的结合缓冲液[6M胍-HCl，10mM脲，10mM Tris-HCl(pH4.4)，20％TritonX-100(v/v)]]和50μL的蛋白酶K(18mg/ml)，混合，在72℃加热10分钟。
混合100μL异丙醇和样品，注入到High Pure过滤管中。以8000转/分钟离心1分钟，去滤液后，注入500μL抑制物去除缓中液[5M胍-HCl，20mM Tris-HCL(pH6.6)]，以8000转/分钟离心1分钟。加入450μL的清洗缓冲液[20mM NaCl，2mM Tris-HCL(pH7.5)]，以8000转/分钟离心1分钟，再用450μL清洗缓冲液清洗，以13000转/分钟离心10秒钟。在过滤管中注入50μL无菌水，以8000转/分钟离心1分钟，收集滤液，制得血清中HBV基因溶液。
(B)血清中HBV DNA的定量使用Light Cycler(Roche Diagnostics公司)按照TaqMan PCR法进行血清HBV DNA的定量。
混合2μL 10×Light Cycler-FastStart DNA Master杂交探针(RocheDiagnostics公司)，4μL HBV基因溶液，10μM针对HBV的S区域的两条引物[HBS-F5’-ACAACATCAGGATTCCTAGGAC-3’(序列号1)，HBS-R5’-GGTTGGTGAGTGATTGGAGGTT-3’(序列号2)]各2μL，2μL 4μM的TaqMan探针[HBS-P5’FAM(6-羧基-荧光素)-CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC-3’TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明)(序列号3)]，2μL 25mM MgCl2，加入无菌水作为20μL反应液进行实时PCR。
作为条件，于95℃进行10分钟前处理，于95℃进行5秒钟DNA变性，60℃退火15秒，于72℃进行8秒DNA合成，测定由Taq Man探针发出的荧光，定量血清中的HBV DNA量。(表1)(C)血清中HBV基因(DNA+RNA)的定量接着，为了测定血清中的HBV基因量，增加逆转录酶反应。在10μL HBV基因溶液中加入1μL的20mM dNTP混合物(10mM dATP，10mMdGTP，10mM dCTP，10mM dTTP)和0.2μL的10μM HBS-R引物，在65℃加热5分钟后，在冰中急冷。混合4μL的5×逆转录缓冲液[250mMTris-HCL(pH8.3)，375mM KCl，15mM MgCl2]，0.2μL的0.1M DTT，0.6μL的RNase抑制剂(40单位/μL)和3μL无菌水，在42℃进行2分钟退火反应，加入1μL逆转录酶(200单位/μL)，作为20μL反应液，使之在42℃逆转录反应50分钟，于70℃进行15分钟逆转录酶的灭活处理。
通过使4μL该反应液应用于上述HBV DNA定量系统中，可以测定血清中的HBV基因量，即血清中HBV DNA和RNA的合计量。此外，通过从HBV基因量中减去HBV DNA量可以推算血清中HBV RNA量。(表1)实施例2.HBc抗原的测定(A)抗体固相板的制备将与HBc抗原和HBe抗原两者均反应的3种单克隆抗体HB44(识别位点为31-49位氨基酸)，HB61(识别位点为131-140位氨基酸)和HB114(识别位点为1-81位氨基酸)致敏微量滴定板，从而固定化。用PBS清洗后，用含有酪蛋白的溶液封闭，除去该溶液后，使其干燥。
(B)试样的前处理混合50μL的前处理液(15％十二烷基硫酸钠[SDS]，3％CHAPS，1％十六烷基三甲基溴化铵)和100μL的试样(血清，血浆等)，于70℃处理30分钟。
(C)1次反应在各抗体固定孔中加入100μL反应缓冲液(pH8.0)和50μL经前处理的试样，一边慢慢地搅拌一边使之在室温反应两小时。
(D)2次反应清洗孔后，加入100μL含有碱性磷酸酶标识HB50(识别位点为168-176位氨基酸)单克隆抗体的溶液，使之在室温反应1小时。
(E)基质反应清洗孔后，加入100μL CDP Star with Emerald II(AppliedBiosystems)，在室温反应20分钟后，用微板光度计测定各孔的发光量。与用标准抗原的发光量比较，计算出试样中HBc抗原的浓度(表1)。
实施例3.接受拉米呋啶治疗的HBV患者血清的研究如表1所示，拉米呋啶治疗开始1个月前的试样中血中HBV-DNA与HBV-RNA显示出几乎相同的血中病毒量，但是在1个月的给药试样中，清楚了血中HBV-DNA为6.1×103个拷贝/ml，与之目对，血中HBV-RNA为1.0×105个拷贝/ml，血中HBV-RNA量占优势。进而，在给药8个月和给药19个月的试样中，即使在几乎无法检出血中HBV DNA的情况下，血中HBV-RNA也残留了2-7×103个拷贝/ml。
另一方面，核心蛋白浓度在给药前为610pg/ml，但是给药1个月后该浓度降低至56pg/ml，其降低率比HBV-DNA小，进而给药8，19个月时为21，20pg/ml，几乎没有降低。HBc抗原浓度的变化与(HBV-DNA+HBV-RNA)量的变化几乎一致。
根据这些结果，提示拉米呋啶治疗中的患者血清中几乎不存在含有HBV DNA的完整病毒颗粒，大量存在只含有HBV RNA的HBV颗粒。
表1

序列表<110>株式会社先端生命科学研究所<120>含有HBV-RNA的HBV颗粒<130>P813<160>3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>引物<400>1acaacatcag gattcctagg ac 22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>引物<400>2ggttggtgag tgattggagg tt 22<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>
<222>
<223>探针<400>3cagagtctag actcgtggtg gacttc 2权利要求
1.一种含有乙型肝炎病毒(HBV)-RNA而不具有HBV-DNA的体液试样中的HBV颗粒。
2.一种通过测定HBV-RNA而测定权利要求1中记载的颗粒的方法。
3.一种通过RT-PCR法测定权利要求1中记载的颗粒的方法。
4.一种判定具有RNA依赖性DNA聚合酶抑制效果的药物对HBV感染疾病的治疗效果的方法，其特征在于对接受该治疗的患者的体液进行权利要求2或3中记载的测定。
5.根据权利要求4中记载的方法，前述具有RNA依赖性DNA聚合酶抑制效果的药物是拉米呋啶。
6.通过前述权利要求2或3中记载的测定预测肝癌发生的危险度或者筛选肝癌发生的危险群的方法。
全文摘要
一种含有乙型肝炎病毒(HBV)－RNA而不具有HBV－DNA的体液试样中的HBV颗粒；通过测定HBV－RNA而测定权利要求1中记载的颗粒的方法；一种判定具有RNA依赖性DNA聚合酶抑制效果的药物对HBV感染疾病的治疗效果的方法，其特征在于对接受该治疗的患者的体液进行前述测定；以及通过前述测定预测肝癌发生的危险度或者筛选肝癌发生的危险群的方法。
文档编号G01N33/53GK1984992SQ20048004342
公开日2007年6月20日 申请日期2004年6月22日 优先权日2004年6月22日
发明者槙昇, 木村达治, 松本晶博, 六波罗明纪, 田中荣司, 清泽研道 申请人:株式会社先端生命科学研究所