专利名称：荧光原位杂交技术检测半滑舌鳎的性染色体组成的方法
技术领域：
本发明属于生物技术中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，具体涉及一种荧光原位杂交技术检测半滑舌鳎的性染色体组成的方法。
背景技术：
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)，俗称鳎米、龙利等，为近海冷温性鱼类，其肉嫩味鲜，营养丰富，是我国重要的海水经济鱼类，为我国当前海水工厂化养殖的主要种类之一。不过半滑舌鳎雌、雄个体差异非常大，雌性个体生长速度比雄性快2-3倍，成熟雌鱼全长可达雄鱼的两倍以上，体重可达雄鱼的10倍。由于雄性个体生长速度过慢，严重影响了苗种质量，降低了养殖产量，增加了养殖成本，从而限制了半滑舌鳎苗种推广及其养殖产业的发展。因此，利用染色体操作技术进行半滑舌鳎全雌育苗的研究已经迫在眉睫。进行全雌育苗的关键在于培育出拥有两条W性染色体的Wff的超雌鱼，但是目前对于超雌鱼的鉴定还没有行之有效的方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种荧光原位杂交技术检测半滑舌鳎的性染色体组成的方法，即提供一种有效的鉴定半滑舌鳎雌性个体和尤其是超雌个体的技术。一种用于检测半滑舌鳎的性染色体组成的荧光原位杂交探针，其特征在于，所述的探针含有半滑舌鳎W性染色体全部或部分核苷酸片段。所述探针的核苷酸片段来自含有半滑舌鳎W染色体部分片段的fosmid或BAC克隆质粒，大小为351Λ 2001Λ。所述的探针在严谨条件下与序列为SEQ ID NO 1的核苷酸片段杂交。所述的探针在严谨条件下与序列为SEQ ID NO 2的核苷酸片段杂交。所述的探针用于检测半滑舌鳎的性染色体组成。检测半滑舌鳎的性染色体组成的方法，包括特异性荧光原位杂交探针的制备、样品的制备和杂交检测步骤，其特征在于样品的制备包含如下步骤将半滑舌鳎组织或血液样品制成细胞悬液，细胞浓度为IXlO6Ail ；将样品离心收集后，用0. 075M的KCL低渗溶液低渗处理30分钟；将样品再次离心收集，用卡诺固定液固定3次，每次20分钟；用吸管吸取样品少取，在载玻片上进行滴片，空气中完全干燥；使用0. 005%的胃蛋白酶溶液37°C处理样品10分钟，2 X SSC溶液漂洗后立即置于预冷的70 %，90 %，100 %梯度乙醇中脱水各5分钟，空气中完全干燥后备用。上述的检测方法，在雌性半滑舌鳎的一个细胞或一个染色体分裂相中有一个荧光信号，在超雌半滑舌鳎中有两个荧光信号。本发明利用荧光原位杂交技术来检测半滑舌鳎的性染色体组成，用含有半滑舌鳎雌性特异DNA片段的fosmid和BAC克隆作为探针，对半滑舌鳎的细胞或染色体分裂相进行荧光原位杂交分析，通过观察杂交信号可以分辨出半滑舌鳎的性染色体组成。本发明的方法是一种有效的鉴定半滑舌鳎雌性个体，尤其是超雌个体的技术，为利用染色体操作技术进行半滑舌鳎全雌育种的研究提供技术手段。


图1 本发明的半滑舌鳎雌性个体的荧光原位杂交结果。图2 本发明的半滑舌鳎超雌个体的荧光原位杂交结果。其中杂交信号位于W染色体上，且每个细胞中也均有杂交信号。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。一、检测探针的筛选及制备激光显微切割技术分离半滑舌鳎的W性染色体，构建W染色体DNA文库，进行测序后得到序列为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，设计引物在雌雄个体上检测，结果表明从SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2设计的引物只在半滑舌鳎雌性个体上扩增出目的大小的片段，从而证明序列为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的片段只存在于半滑舌鳎的W性染色体上。利用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2序列筛选半滑舌鳎全基因组DNA的fosmid和 BAC文库超级池，获得含有W性染色体全部或部分片段的fosmid或BAC克隆。每个克隆的插入片段大小在351Λ 2001Λ之间。从各个克隆中提取质粒，利用生物素-切口平移 (Biotin-Nick Translation Mix)探针标记试剂盒(Roche,Catalog No. 11745824910)按照说明书的方法进行生物素标记。探针溶液用5 μ L醋酸胺(8Μ)和150 μ L预冷无水乙醇沉淀过夜。沉淀物用70%乙醇洗涤，于超净台内微风吹干，然后加入IOOyL杂交混合液(包括50%去离子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，2XSSC)。加入杂交混合液的探针在4°C下至少溶解M小时，待充分溶解后置于_20°C长期保存。为了更好的保证准确性，对构建的探针来杂交序列为SEQ ID NO :1或SEQID NO 2 的核苷酸片段。杂交条件参照Roche公司的DIG高效DNA标记及检测Marter Kit 1手册中的杂交条件。筛选出的阳性探针能够完全保证W性染色体的特异性。选取两个分别包含序列为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的片段的fosmid质粒探针进行验证。二、用于荧光原位杂交的半滑舌鳎细胞标本的制备实验样品(组织或血液等)通过酶消化或物理打碎等方法制成细胞悬液，细胞浓度约为1 X IO6左右；将样品离心收集后，用0. 075M的KCL低渗溶液低渗处理30分钟；将样品再次离心收集，用卡诺固定液(无水己醇冰醋酸=3 1)固定3次，每次20分钟；用吸管吸取样品少取，在载玻片上进行滴片，空气中完全干燥；使用0. 005%的胃蛋白酶溶液 37°C处理样品10分钟，2XSSC溶液漂洗后立即置于预冷梯度乙醇(70^,90^,100% )脱水各5分钟，空气中完全干燥后备用。三、荧光原位杂交技术检测半滑舌鳎的性染色体组成的方法第一步是探针变性将探针混合液置于80°C水浴中变性7分钟，迅速转入冰中冷却，保温至少10分钟。第二步是标本变性及杂交杂交标本在含70%甲酰胺，2XSSC的溶液中75°C变性2 3分钟，立即置于预冷梯度乙醇(70^,90%, 100% )脱水各5分钟。强风吹干后，将预退火的探针滴加到杂交标本(细胞或染色体)上，每张制片加20 μ L杂交混合液，盖上盖玻片，用封口膜包好，置于湿盒OXSSC)并转入37°C恒温箱中，避光杂交 12 18小时。第三步是洗脱小心揭掉封口膜，去掉盖玻片。用以下液体洗脱50%甲酰胺/2 X SSC混合液中42V洗潘4次，各5分钟；1 X SSC中42V洗潘3次，各5分钟；2 X SSC 室温中轻洗一下。取出载玻片，尽力甩去载玻片表面多余的液体。加50 μ Lblocking-I (3% BSA，4XSSC，0. TWEEN20)，盖上盖玻片，置暗盒中37°C处理20分钟。取出后尽力甩去载玻片表面多余的blocking-Ι，加50 μ LAvidin-Fluorescein(10y g/mL)于标本上，盖上盖玻片，置暗盒中37°C处理1小时。取出标本，于Wash-buffeH4X SSC，0. 1% TWEEN20)中 42°C洗涤3次，每次5分钟。2 X SSC室温中轻洗一下，取出后尽力甩去载玻片表面多余的液体，加30μ L PI复染，直接观察结果或置暗盒中-20°C冰冻保存。第四步是信号检测使用荧光显微镜对杂交信号进行检测。在一个细胞或一个分裂相中，如果没有荧光信号，则该样本的性染色体组成为TL ；如果有一个信号，则该样本的性染色体组成为ZW，如果有两个信号，则该样本的性染色体组成为WW。四、本发明的探针和方法效果验证实施例1 半滑舌鳎的雌性和雄性的鉴定对已知性别的半滑舌鳎ZW雌鱼和U雄鱼各20条，利用序列为SEQ IDNO :1和SEQ ID N0:2的片段杂交筛选出的fosmid质粒探针进行验证。结果发现在雌性个体的W性染色体以及细胞中均出现1个荧光信号，而雄性个体中都没有发现荧光信号，证明了该方法的有效性。同时，对包含有序列为SEQ ID NO 2的片段的fosmid质粒探针进行杂交，也是雌性个体的W性染色体以及细胞中均出现1个荧光信号，而雄性个体中都没有发现荧光信号。实施例2 对超雌鱼的鉴定使用该方法对半滑舌鳎Wff超雌个体的细胞进行了荧光原位杂交，结果发现2个荧光信号(图幻，从而证明了该方法对半滑舌鳎超雌个体的鉴定具有很好的效果。综上，本发明的探针和检测方法可以有效的检测半滑舌鳎的性染色体组成，并且可以更准确、直观的确定半滑舌鳎的超雌个体。
权利要求
1.一种用于检测半滑舌鳎的性染色体组成的荧光原位杂交探针，其特征在于，所述的探针含有半滑舌鳎W性染色体全部或部分核苷酸片段。
2.如权利要求1所述的荧光原位杂交探针，其特征在于所述的探针的核苷酸片段来自含有半滑舌鳎W染色体部分片段的fosmid或BAC克隆质粒。
3.如权利要求2所述的荧光原位杂交探针，其特征在于所述的fosmid或BAC克隆质粒的大小为35kb 200kbo
4.如权利要求1所述的荧光原位杂交探针，其特征在于所述的探针在严谨条件下与序列为SEQ ID NO 1的核苷酸片段杂交。
5.如权利要求1所述的荧光原位杂交探针，其特征在于所述的探针在严谨条件下与序列为SEQ ID NO 2的核苷酸片段杂交。
6.权利要求1所述的荧光原位杂交探针用于检测半滑舌鳎的性染色体组成。
7.如权利要求6所述的检测半滑舌鳎的性染色体组成，包括有特异性荧光原位杂交探针的制备、样品的制备和杂交检测步骤，其特征在于所述的样品的制备步骤如下将半滑舌鳎组织或血液样品成细胞悬液，细胞浓度为IXio6Ail ；将样品离心收集后，用0. 075M的 KCL低渗溶液低渗处理30分钟；将样品再次离心收集，用卡诺固定液固定3次，每次20分钟；用吸管吸取样品少取，在载玻片上进行滴片，空气中完全干燥；使用0. 005%的胃蛋白酶溶液37°C处理样品10分钟，2 X SSC溶液漂洗后立即置于预冷的70%，90%，100%梯度乙醇中脱水各5分钟，空气中完全干燥后备用。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于用于原位杂交的探针在雌性半滑舌鳎的一个细胞或一个染色体分裂相中有一个荧光信号。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于在用于原位杂交的探针在超雌半滑舌鳎的一个细胞或一个染色体分裂相中有两个荧光信号。
全文摘要
本发明涉及一种荧光原位杂交技术检测半滑舌鳎的性染色体组成的方法。其特征在于，用于原位杂交的探针为含有半滑舌鳎雌性特异DNA片段的fosmid或BAC克隆，在雌性半滑舌鳎的一个细胞或一个染色体分裂相中有一个荧光信号，而在超雌半滑舌鳎的一个细胞或一个染色体分裂相中有两个荧光信号。本发明对半滑舌鳎的细胞或染色体分裂相进行荧光原位杂交分析，通过观察杂交信号分辨半滑舌鳎的性染色体组成，是一种有效的鉴定半滑舌鳎雌性个体和尤其是超雌个体的技术，为利用染色体操作技术进行半滑舌鳎全雌育种的研究提供技术手段。
文档编号G01N21/64GK102168145SQ20111010067
公开日2011年8月31日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者于海洋, 姜佳君, 张全启, 王志刚, 王旭波, 高金宁, 齐洁 申请人:中国海洋大学