专利名称：强力霉素检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明是涉及生物学免疫方法的测定技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测强力霉素检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
强力霉素又名脱氧土霉素，又称多西环素，是四环素类药物，其性状为淡黄色或黄色结晶性粉末，臭，味苦。在水中或甲醇中易溶，在乙醇或丙酮中微溶，在氯仿中不溶。主要用于敏感的革兰阳性菌和革兰阴性杆菌所致的上呼吸道感染、扁条体炎、胆道感染、淋巴结炎、蜂窝组炎、老年慢性支气管炎等，也用于治疗斑疹伤寒、羌虫病、支原体肺炎等。尚可用于治疗霍乱，也可用于预防恶性疟疾和钩端螺旋体感染。因此在畜禽生产中被广泛用作药物和饲料添加剂，但是不合理用药可导致强力霉素可导致强力霉素在动物可食性组织中蓄积残留，继而危害人体健康。因此，加强对肉、蛋、奶等动物源食品中强力霉素药物残留的监测具有十分重要的意义。目前，对强力霉素药物残留的检测常用的方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、 液相色谱-质谱联用法(LC-MQ、微生物法、酶联免疫吸收法(ELISA)。高效液相色谱法及液相色谱-质谱联用法灵敏度高，结果可靠，但测定方法繁琐、费时，成本较高，且操作人员需要专业训练，难以普及；微生物法操作简单，但是特异性差，检测周期较长且结果误差较大。 酶联免疫吸收法是利用酶标记物的竞争性免疫检测方法，具有灵敏度高、检测量大、成本低等优点，但是该方法仍然需要专门的仪器(酶标仪)，分析时间较长(一般1-4小时)，仍然具有一定的局限性。因此，研究一种更加简单、快捷，适合于现场应用的检测产品具有重要的意义。胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)是20世纪80年代发展起来的一种新的免疫分析技术，是免疫亲和技术、印刷技术、免疫标记技术和层析技术的结合。这种方法目前已得到较为广泛的运用，它是利用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，利用抗原抗体之间的特异性反应的免疫检测方法。此方法操作简单、反应快速、经济实用，适合于现场检测。

发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、操作简单、反应快速、准确、适合于现场使用的专门用于检测强力霉素的试剂盒及其制备方法，检测肉、蛋、奶等动物源食品中强力霉素药物残留，用于食品质量的辅助监测。一种强力霉素检测试剂盒，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC 支撑板，在PVC支撑板上依次紧密粘附有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫。所述胶体金垫为胶体金标记的抗强力霉素抗体玻璃纤维(或无纺布)；所述硝酸纤维素膜上包被了两条线，分别为包被了强力霉素-载体蛋白(牛血清蛋白)偶联物的检测线(T线)和包被了羊抗鼠IgG的质控线(C线)。
本发明提供了一种强力霉素检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤(1)制备强力霉素偶联抗原将强力霉素与牛血清蛋白偶联，合成强力霉素-牛血清蛋白偶联物，作为强力霉素偶联抗原。(2)制备抗强力霉素单克隆抗体采用强力霉素-牛血清蛋白偶联物为免疫原免疫BALB/C小鼠，通过杂交瘤技术， 得到分泌抗强力霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用 Protein G柱进行纯化，获得抗强力霉素单克隆抗体。(3)制备胶体金取0. 01%的氯金酸水溶液水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1 %枸橼酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。(4)制备胶体金垫取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液5ml，用0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH 值调至8. 0，室温放置10分钟；逐滴加入蛋白浓度为2. Omg/ml的抗强力霉素抗体0. 15ml, 混合均勻，室温放置30分钟；加入0. 075ml 10%牛血清蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室温放置10分钟；11000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，用含5%蔗糖的0. 002mol/L pH 8. 0的硼酸盐缓冲液5mL复溶，重复2次；最后用硼酸盐缓冲液溶解至3mL，得到抗强力霉素抗体-胶体金标记物；将抗强力霉素抗体-胶体金标记物按ImL铺56cm2的比例均勻铺在无纺布上，再置干燥间，在温度38°C，湿度小于30%的条件下干燥2-4小时，制成胶体金垫。(5)包被强力霉素偶联抗原、羊抗鼠IgG设定划膜仪涂覆参数1 μ L/cm,分别用微量进样器取0. 2mL强力霉素偶联抗原、羊抗兔IgG，按顺序接到划膜仪的A、B管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆强力霉素偶联抗原(T线)、羊抗兔 IgG (C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38°C，干燥M小时，备用。(6)组装试剂盒在PVC支撑板上按顺序依次粘附样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫，得到所述用于检测强力霉素的试纸条，试纸条可以装入塑料卡内，组装成检测卡。其中所述样品垫为玻璃纤维，吸样垫为吸水纸。本发明利用胶体金免疫层析技术及抗原抗体特异性反应，运用强力霉素偶联抗原与被测样品中可能含有的强力霉素竞争结合金标抗强力霉素单克隆抗体的原理检测强力霉素。检测样品时，样品因毛细管作用向吸样垫一端层析。若被测样品中含有强力霉素，它们将和检测线(T线)上包被的强力霉素偶联抗原竞争有限的抗体结合位点，当样品中的强力霉素达到一定浓度时，与胶体金标记的抗强力霉素抗体发生免疫反应并完全饱和，此时胶体金复合物已无空余的位点和检测线上包被的强力霉素偶联抗原结合，此时T线不显色，此为阳性结果。若被测样品中不含强力霉素，标记了抗强力霉素抗体的胶体金颗粒将随同样品层析至T线位置后，与T线上包被的强力霉素偶联抗原发生免疫结合反应，胶体金颗粒在T线位置堆积使得T线呈现出一条肉眼可见的红色条带，此为阴性结果。无论被测样品中是否含有强力霉素，胶体金标记物均会与包被在质控线(C线)上的羊抗鼠IgG结合而显色，C线显色是判定是否有足够样本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控
4标准。本发明所述试剂盒的检测方法为将被检样品平衡至室温；取出强力霉素检测装置，水平放置；在样品垫中加入2-3滴样品，10分钟时观察并记录C、T线的显色情况，判断检测结果。本发明所述的试剂盒采用胶体金免疫层析技术测定强力霉素，检测时，将被测样品加在试纸条(卡)上的样品垫上，可以直接观察到免疫反应的结果，完成样品检测。本发明可用于检测样本中可能存在的强力霉素，具有使用方便、操作简单、反应迅速、经济实用等特点。


图1强力霉素检测试剂盒结构示意图；附图符号说明1 样品垫；2 含有标记抗强力霉素单克隆抗体的胶体金垫；3 硝酸纤维素膜(T 包被了强力霉素偶联抗原的检测线；C 包被了羊抗鼠IgG的质控线)；4 吸样垫；5 =PVC 支撑板；图2本发明试剂盒的检测结果示意图。自左至右依次为C 一条线阳性检测结果，T、C两条线阳性检测结果；T、C两条线阴性检测结果 ’无效。
具体实施例方式实施例1 强力霉素检测试剂盒的制备1.制备强力霉素偶联抗原将强力霉素与牛血清蛋白偶联，合成强力霉素-牛血清蛋白偶联物，作为强力霉素偶联抗原。2.制备抗强力霉素单克隆抗体采用强力霉素偶联抗原为免疫原免疫BALB/C小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗强力霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ftOtein G 柱进行纯化，获得抗强力霉素单克隆抗体。3.制备胶体金取0. 01%的氯金酸水溶液水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1 %枸橼酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。4.制备胶体金垫取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液5ml，用0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的pH 值调至8. 0，室温放置10分钟；逐滴加入蛋白浓度为2. Omg/ml的抗强力霉素抗体0. 15ml, 混合均勻，室温放置30分钟；加入0. 075ml 10%牛血清蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室温放置10分钟；11000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，用含5%蔗糖的0. 002mol/L pH8. 0的硼酸盐缓冲液5mL复溶，重复2次；最后用硼酸盐缓冲液溶解至3mL，得到抗强力霉素抗体-胶体金标记物；将抗强力霉素抗体-胶体金标记物按ImL铺56cm2的比例均勻铺在无纺布上，再置干燥间，在温度38°C，湿度小于30%的条件下干燥2-4小时，制成胶体金垫。5.样品垫的处理将玻璃纤维(或无纺布)浸泡于50ml 0. 01mol/L pH 7. 5的PBS中30min，其中 PBS中含5ml 10% BSA, 2. 5ml 10% Tweeen-2，于烘干箱中37°C烘干，真空封装，置4°C保
存，备用6.包被强力霉素偶联抗原、羊抗鼠IgG设定划膜仪涂覆参数1 μ L/cm,分别用微量进样器取0. 2mL强力霉素偶联抗原、羊抗兔IgG，按顺序接到划膜仪的A、B管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆强力霉素偶联抗原(T线)、羊抗兔 IgG (C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38°C，干燥M小时，备用。7.组装试剂盒在PVC支撑板上按顺序依次粘附样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫，得到所述用于检测强力霉素的试纸条，试纸条可以装入塑料卡内，组装成检测卡。其中所述样品垫为玻璃纤维，吸样垫为吸水纸。实施例2 强力霉素检测试剂盒的应用评价1.阴性参考品符合率用磷酸缓冲溶液(PBS 0. 01mol/L、pH 7. 5)配制浓度为lOOng/mL的氯霉素标准溶液进行10次平行检验，10分钟时观察检测结果，T、C线均呈现红色条带，结果为阴性。用磷酸缓冲溶液(PBS 0. Olmol/L.pH 7. 5)配制浓度为lOOng/mL的链霉素标准溶液进行10次平行检验，10分钟时观察检测结果，T、C线均呈现红色条带，结果为阴性。2.阳性参考品符合率用磷酸缓冲溶液(PBS 0. 01mol/L,pH 7. 5)配制浓度为15、30、45ng/mL的强力霉素标准品，各浓度分别进行10次平行检验，10分钟时观察检测结果，T线不显色，C线均呈现红色，结果为阳性。3.最低检出量用磷酸缓冲溶液(PBS0. 01mol/L、pH 7. 5)配制浓度为 0、3、5、10、15、20ng/mL 的强力霉素标准品，各浓度分别进行10次平行检验，10分钟时观察检测结果，0ng/mL、3ng/mL 的强力霉素标准品的检测结果为T、C线均显色且显色度均一，为阴性结果；5ng/mL、10ng/ mL的强力霉素标准品的检测结果为T、C线均显色且T线颜色明显浅于C线颜色，判定为阳性检测结果；15ng/mL、20ng/mL的强力霉素标准品的检测结果为T线不显色，C线显色，为阳性结果。因此本发明试剂盒吗的最低检出量不高于5ng/mL。4.重复性用磷酸缓冲溶液(PBS 0. 01mol/L,pH 7. 5)配制浓度为15ng/mL的强力霉素标准品，进行10次平行检验，10分钟时观察检测结果，结果均为T线不显色，C线显色，为阳性结果，显色度均一。5.稳定性37°C放置10天后，各项指标均符合以上要求。
实施例3 强力霉素检测试剂盒的检测方法1.样品的预处理血清抽取血清，离心或静置后取透明上清液使用；若血清过度溶血现象，将血清用蒸馏水稀释一倍后再进行实验，否则试剂片红色太深，影响测试结果。尿液用尿液直接进行测试，若尿液呈可见的混浊状，需先离心、过滤或待其沉淀后取上清液检测。牛奶4°C、5000r/min离心15min，去除上层脂肪后检测。组织样品取5-10g 组织样品捣碎后，加入 20-30ml (0. 01mol/L,pH 7. 5) PBS, 80°C 孵育30min后，水浴lOmin，于4°C、5000r/min离心15min，去除上层脂肪，取上清液检测。饲料取0. 5-2g 磨碎的待测饲料，加入 8-20ml(0. 01mol/L,pH 7. 5)PBS，80°C孵育 30min后，水浴lOmin，于4°C、5000r/min离心15min，取上清液检测。2.操作取出强力霉素检测装置，水平放置；在样品垫上滴入3滴样品，10分钟后观察并记录C、T线的显色情况，判断检测结果。3.结果判定阳性T线不显色，C线呈现红色条带，判定为阳性结果，说明被测样品中强力霉素的含量高于15ng/mL。T线、C线都显色，且T线颜色浅于C线颜色，判定为阳性结果，说明被测样品中强力霉素的含量在5-15ng/mL之间。阴性T线、C线均呈现红色条带，且T线颜色等于或深于C线颜色，说明样品中强力霉素的含量低于5ng/mL。无效C线不显色，说明不正确操作或试剂盒已经变质损坏。
权利要求
1.一种强力霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC支撑板组成，样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫依次粘贴在PVC 支撑板上，胶体金垫为胶体金标记的抗强力霉素单克隆抗体玻璃纤维或无纺布，硝酸纤维素膜上依次包被了强力霉素偶联抗原作为检测线(T线)，羊抗鼠IgG抗体作为质控线(C 线)。
2.—种权利要求1所述的强力霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的样品垫为玻璃纤维或无纺布，吸样垫为吸水滤纸。
3 —种权利要求1所述的强力霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的强力霉素偶联抗原为强力霉素与牛血清蛋白的偶联物。抗强力霉素单克隆抗体由强力霉素偶联抗原免疫获得。
4.一种权利要求1所述的强力霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂枸橼酸三钠作用下制成大小为20-40nm的胶体金颗粒。
5.一种权利要求1所述的强力霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的胶体金垫的制备方法为取颗粒大小为20-40nm的胶体金溶液5ml，用0. lmol/L K2CO3将胶体金溶液的PH值调至8. 0，室温放置10分钟；逐滴加入蛋白浓度为2. Omg/ml的抗强力霉素抗体0. 15ml，混合均勻，室温放置30分钟；加入0. 075ml 10%牛血清蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室温放置10分钟；11000转离心30分钟，仔细吸取上清液，弃去，用含5%蔗糖的 0. 002mol/L pH 8. 0的硼酸盐缓冲液5mL复溶，重复2次；最后用硼酸盐缓冲液溶解至3mL， 得到抗强力霉素抗体-胶体金标记物；将抗强力霉素抗体-胶体金标记物按ImL铺56cm2的比例均勻铺在无纺布上，再置干燥间，在温度38°C，湿度小于30%的条件下干燥2-4小时， 制成胶体金垫。
6.一种权利要求1所述的强力霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上的两条线的包被方法为设定划膜仪涂覆参数1 μ L/cm,分别用微量进样器取 0. 2mL强力霉素偶联抗原、羊抗兔IgG，按顺序接到划膜仪的A、B管道接口。将贴有硝酸纤维素膜的PVC板置于划膜仪的往复运动平台上，开启划膜仪，在硝酸纤维素膜上涂覆强力霉素偶联抗原(τ线)、羊抗兔IgG(C线)。划线后将硝酸纤维素膜烘箱中，温度38°C，干燥 24小时，备用。
7.—种权利要求1所述的强力霉素检测试剂盒及其制备方法，其特征在于所述的强力霉素检测试剂盒的组装方法为将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫由一端依次黏附在PVC支撑板上，即可形成检测强力霉素的试剂条，试剂条也可以装入塑料卡中形成卡型包装。
全文摘要
本发明属于生物学免疫方法的测定技术领域，特别涉及一种强力霉素检测试剂盒及其制备方法。试剂盒包括样品垫(1)、胶体金垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸样垫(4)和PVC支撑板(5)。胶体金垫为胶体金标记的抗强力霉素单抗玻璃纤维(或无纺布)，硝酸纤维素膜上依次包被了强力霉素偶联抗原作为检测线(T线)，羊抗鼠IgG抗体作为质控线(C线)。本发明采用胶体金免疫层析技术制备强力霉素检测试剂盒，制备方法简单，可用于检测样本中可能存在的强力霉素，具有使用方便、操作简单、反应迅速、经济实用等特点。
文档编号G01N33/544GK102213723SQ20101013848
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月2日 优先权日2010年4月2日
发明者李峰, 陈立柱 申请人:北京库尔科技有限公司