专利名称：皮肤角质层细胞间脂质模拟基板和使用了该基板的皮肤粗糙评价方法
技术领域：
本发明涉及模仿了角质层脂质的新的体外模型基板和使用了该基板的皮肤粗糙评价方法。
背景技术：
位于皮肤最外层的角质层保护生物体使其免于细菌和/或有害物质等异物的接触和/或渗透，并且具有通过防止水分从体内蒸发而使皮肤保持健全状态的屏障功能。如果屏障功能降低，则从皮肤表面蒸发的经表皮水分蒸发量(trans epidermal water loss TEWL)增加，相对地角质水分量减少。如果由于角质层水分量减少而导致由皮沟、皮嵴形成的皮纹(皮肤纹理)不规则化，则皮肤呈现干燥的皮肤粗糙状态(曾根俊郎等人，香粧会誌 Vol. 15No. 2. pp. 60-65 (1991))。已知在该屏障功能中发挥重要作用的角质层细胞间脂质主要以神经酰胺、游离脂肪酸和胆固醇为主成分，形成层状(lamella)结构(Bouwstra JA, et al.，Acta Derm Venereol Suppl (Stockh). 2000 ；208 :pp. 23-30. ；Bouwstra JA, et al. , Int J Cosmet Sci. 20080ct ；30 (5) :p. 388)。在化妆品的开发中，需要预先研究角质层脂质与化妆品材料之间的相互作用，从而筛选有效的材料，以免损害皮肤的屏障功能。在研究化妆品材料对皮肤屏障功能的作用时，一般是将生物体样品暴露于候选材料，对该细胞间脂质结构进行X射线分析、电子自旋共振(ESR)、差示扫描量热测定(DSC)、 红外线分析(IR)等。通过使用生物体样品，可以获得必要的数据本身，将该数据直接与商品信息相联系。然而，生物体样品存在个体差异，由这样的样品得到的角质层脂质每个样品都具有不一致的结构。此外存在如下问题为了从动物得到规定的角质层脂质不仅需要复杂的操作，而且从动物保护的观点出发测定方法受到限制。这样，在开发新化妆品时，为了判断所使用的物质对角质层脂质带来何种影响，需要不使用生物体样品、简便且高再现性的指标。作为皮肤养护制品等中含有的成分，有表面活性剂。表面活性剂渗透到角质层中，被角质细胞的角蛋白吸收，然后与细胞间脂质混合(Friberg，S. Ε. et al.，Colloids Surf. 1988，30，pp. 1-12 ；Rhein, L. D. Ibid. 1997，48，pp. 253-274)。此夕卜，已知由于表面活性剂会除去脂肪酸、脂肪酸甘油酯、胆留醇酯等皮肤脂质，因此即使被除去的脂质是少量的，也会给皮肤带来损伤(Fulmer，A. W. et al.，J. Invest. Dermatol. 1986，86， pp. 598-602 ；Denda, Μ. et al.，Arch. Dermatol. Res. 1994,286, pp. 41-46 ；Ronald, R. W. et al. , J. Invest. Dermatol. 1999,113, pp. 960-966 ；Lopez,0.et al. Bioch. et Biophy Acta 2000，1508，pp.196-209 和 Ebba，B.et al.，Inter J. Phama. 2000，195，pp. 189—195)。一直以来，表面活性剂对角质层脂质的作用与皮肤屏障功能(Harada， K. et al, J. Invest. Dermatol. 1992,99, pp. 278-282 禾口 Lavri jsen, A. P. Μ· et al.,J. Invest. Dermatol. 1995，105，pp. 619-6 )、以及与各种皮肤症状相关的脂质组成的变化(Holleran，W.M. et al, J. Lipid Res. 1991,32, pp. 1151-1158 ；Murata, Y. et al.， J.Invest. Dermatol. 1996,106, pp. 1242-1249 ；Ponec,M. et al,J.Invest. Dermatol. 1997, 109, pp. 348-355)相关，因而大受关注。尽管如此，这些作用过程和机理依然不明确。非专利文献1 曾根俊郎等人，香粧会誌Vol. 15No. 2. pp. 60-65 (1991)非专利文献2 :Bouwstra JA, et al. ,Acta Derm Venereol Suppl (Stockh). 2000 ； 208 :pp.23-30非专利文献 3 =Bouwstra JA, et al.，Int J Cosmet Sci. 20080ct ；30 (5) :ρ· 388非专利文献4 =Friberg, S. E. et al.，Colloids Surf. 1988，30，pp. 1-12非专利文献5 Rhein, L. D. Ibid. 1997，48，pp. 253-274非专利文献 6 FuImer, A. W. et al.，J. Invest. Dermatol. 1986，86，pp. 598—602非专利文献 7 =Denda, Μ. et al.，Arch. Dermatol. Res. 1994,286，pp. 41—46非专利文献 8 =Ronald, R. W. et al.，J. Invest. Dermatol. 1999，113，pp. 960-966非专利文献 9 Lopez, 0. et al. Bioch. et Biophy Acta 2000，1508，pp. 196—209非专利文献 10 :Ebba, B. et al.，Inter J. Phama. 2000，195，pp. 189—195非专利文献 11 Harada, K. et al, J. Invest. Dermatol. 1992,99，pp. 278—282非专禾Ij 文献 12 :Lavrijsen，A.P.M. et al, J. Invest. Dermatol. 1995,105, pp.619-624非专利文献13 :Holleran，W. M. et al, J. Lipid Res. 1991，32，pp. 1151—1158非专利文献 14 =Murata, Y. et al.，J. Invest. Dermatol. 1996，106，pp. 1242—1249非专利文献 15 :Ponec, Μ. et al, J. Invest. Dermatol. 1997，109，pp. 348—355非专利文献 16 :0. Lopez et al. , J. dispersion science and technology, 18(5)，pp. 503-515(1997)

发明内容
发明所要解决的问题本发明的目的是提供结构上的均勻性高、且易于测定脂质结构变化的角质层脂质的体外模型基板和使用了该基板的皮肤粗糙评价方法。用于解决问题的方法作为角质层的单纯皮肤模型，本发明者在盖玻片等基板上形成了由神经酰胺、棕榈酸和胆固醇这三种成分构成的脂质混合物，结果发现形成于基板上的脂质膜与角质层的脂质层状结构类似，而且由物性分析结果可知该脂质膜的性质与角质层细胞间脂质的性质类似。如果考虑这样的层状结构和物性分析的结果，则认为由上述三种成分的混合脂质形成的脂质膜与角质层细胞间脂质结构类似。已知如果在猪皮肤中应用表面活性剂，则角质层脂质的结构从层状结构向泡状变化(0. Lopez et al.,]. dispersion science and technology，18(5)，pp. 503-515(1997))。 因此，本发明者对由上述脂质混合物形成的脂质膜添加了特定的表面活性剂，结果发现角质层脂质结构乱，构成脂质膜的分子集合成管状而形成髓磷脂像。此外，研究了从该髓磷脂像的顶端到上述脂质模拟基板的末端之间的距离与评价皮肤屏障功能的TEWL之间的关系，结果确认了两者具有相互关系。本发明者基于这样的认识，得到了如下结论可以使用由神经酰胺、棕榈酸和胆固醇这三种成分构成的脂质膜作为角质层脂质的体外模型，而且能够将通过在该脂质膜中添加特定的表面活性剂所形成的髓磷脂像的定量/定性评价作为测定角质层脂质与化妆品材料之间的相互作用的指标，从而完成了本发明。S卩，本发明包含以下的发明。[1], 一种皮肤角质层细胞间脂质模拟基板，该皮肤角质层细胞间脂质模拟基板包含基板和在该基板上形成的脂质膜，其中，该脂质膜是由神经酰胺、棕榈酸和胆固醇形成的。[2],根据[1]所述的皮肤角质层细胞间脂质模拟基板，其中，所述神经酰胺、棕榈酸和胆固醇以神经酰胺棕榈酸胆固醇为20 70% 10 60% 20 40%的质量比存在。[3], 一种皮肤粗糙的评价方法，其中，将在[1]或[2]所述的皮肤角质层细胞间脂质模拟基板中添加表面活性剂而在该基板上形成髓磷脂像的情况评价为该表面活性剂在体内引起皮肤粗糙，并且该髓磷脂像的顶端与该基板的末端之间的最短距离越长，评价为该皮肤粗糙的程度越大。发明的效果本发明的模仿了皮肤角质层细胞间脂质的基板(以下在本说明书称为“皮肤角质层细胞间脂质模拟基板”)是包含作为具有复杂结构的角质层的主要构成物质的3种脂质 (神经酰胺、棕榈酸和胆固醇)的单纯化的模型膜。如果对本发明的基板添加特定的表面活性剂，则可形成髓磷脂像。根据所添加的表面活性剂的种类不同，存在从髓磷脂像的顶端到该基板的末端的距离较长的表面活性剂。此外，增大该距离的表面活性剂在人的斑贴试验中增大了 TEffL值。TEffL值的增大意味着皮肤的屏障功能降低，因此认为根据本发明的皮肤角质层细胞间脂质模拟基板，可以在不使用生物体样品的情况下，在体外评价角质层脂质与化妆品材料之间的相互作用，进而评价该化妆品材料对皮肤粗糙的影响。对于形成了髓磷脂像的表面活性剂，在斑贴试验和/或使用了胶原或白介素8的实验等中进行了评价，结果未发现髓磷脂像形成与细胞毒性等之间有相关性。从而认为，本发明的皮肤角质层细胞间脂质模拟基板可以在专门用于评价皮肤的屏障功能降低(角质层脂质结构乱)的皮肤粗糙试验方法中应用。附图简述

图1显示髓磷脂像的示意图。图2是由对本发明的基板进行了 DSC的结果得到的DSC曲线。图3是在SDS水溶液中暴露后的基板的显微照片。在距离基板一定范围内形成髓磷脂像。图4A是显示非离子型表面活性剂与髓磷脂像形成距离之间的关系的图。图4B是显示离子型表面活性剂与髓磷脂像形成距离之间的关系的图。图5是显示离子型表面活性剂与髓磷脂像形成距离之间的关系的图。图6是显示非离子型表面活性剂的结构与髓磷脂像形成距离之间的关系的图。图7是显示表面活性剂的烷基链长与髓磷脂像形成距离之间的关系的图。
图8是显示表面活性剂的EO加成摩尔数与髓磷脂像形成距离之间的关系的图。图9是显示表面活性剂的分子量与髓磷脂像形成距离之间的关系的图。图10是显示髓磷脂像的形成距离与ATEffL值之间的关系的图。
具体实施例方式皮肤角质层细胞间脂质模拟基板在第一观点中，本发明提供了一种皮肤角质层细胞间脂质模拟基板，该皮肤角质层细胞间脂质模拟基板包含基板和在该基板上形成的脂质膜，其中，该脂质膜由神经酰胺、 棕榈酸和胆固醇形成，神经酰胺、棕榈酸和胆固醇以20 70% 10 60%: 20 40% (神经酰胺棕榈酸胆固醇)的质量比存在。在本发明的皮肤角质层细胞间脂质模拟基板中，用于形成脂质膜的基础基板可以使用盖玻片、云母、硅片等平面板。作为该基板的材质，在希望其可以加工成平滑面并具有耐热性的情况下，还可以使用不锈钢等金属类、陶瓷制品。在脂质膜中，使用脂质混合物、例如含有神经酰胺、棕榈酸和胆固醇的脂质混合物作为构成材料。在脂质混合物中的神经酰胺中，神经酰胺III是最标准的结构，而且廉价，因而是优选的。上述脂质混合物以质量比为20 70% 10 60% 20 40% (神经酰胺棕榈酸胆固醇)溶解在溶剂中。从模拟皮肤中存在的角质层细胞间脂质的组成比这样的观点出发，优选混合脂质的比率为2 1 1(神经酰胺棕榈酸胆固醇)的质量比。作为上述溶剂，可以使用甲醇、氯仿、己烷、丙酮、乙酸乙酯等、或它们的混合物。上述溶剂不限于这些具体的溶剂，只要能够溶解上述脂质即可。将上述脂质混合物溶解在溶剂中，然后使该溶液在平面板、例如盖玻片上展开，干燥。然后，将平面板在高温(例如120°C)的烘箱中熔融，在氮气气流下静置规定的时间。 冷却到室温，然后将平面板加水进行加湿(例如，在水中长时间浸渍或加水)浸渍，从而可以制备本发明的脂质模拟基板。在将固体脂质混合物熔融之后再进行加湿的方法也是可以的。使用了皮肤角质层细胞间脂质基板的皮肤粗糙评价方法在第二观点中，本发明提供了一种皮肤粗糙的评价方法，包括测定通过在皮肤角质层细胞间脂质基板中添加表面活性剂而形成的髓磷脂像的顶端与该基板的末端之间的距离，将该距离的增大作为皮肤粗糙的指标。髓磷脂像是由在水中处于液晶状态的多个分子集合而形成的管状分子的集合体 (图1)。一般而言，当溶致的近晶相A(液晶的一种)与适当的介质接触时形成髓磷脂像。 髓磷脂像的形成可以通过在上述基板中添加特定的表面活性剂之后用显微镜在视觉上进行确认。通过添加特定的表面活性剂，可在距离本发明的基板一定范围内形成多个髓磷脂像。该范围根据所添加的表面活性剂的种类不同而不同。从上述基板的末端到所形成的髓磷脂像的顶端的距离越长，则从应用了相同表面活性剂的皮肤蒸发的经表皮水分蒸发量 (TEffL)也越大。换句话说，可预想，如果添加某表面活性剂而形成的髓磷脂像与基板之间的距离长，则该表面活性剂在被应用于皮肤时会打乱角质层脂质结构，引起皮肤粗糙。“皮肤粗糙”意味着例如与应用被检物前相比TEWL (经皮水分蒸发量)上升了的状态，TEffL上升的程度越大，则表示皮肤的屏障能力越低。另一方面，在本发明的评价方法中， 在皮肤角质层细胞间脂质模拟基板中应用了被检物的情况下，将形成了髓磷脂像的状态看作是实际皮肤中的“皮肤粗糙”。这里，由于本发明的基板上形成该髓磷脂像的范围与TEWL 值相关，因此该范围越大，评价为在实际皮肤中应用了该被检物时其皮肤粗糙的程度越大。 由于该评价方法具有再现性，因此在本发明中，将该髓磷脂像的顶端与该基板的界面之间的最短距离作为皮肤粗糙恶化的指标。在将髓磷脂像的顶端与皮肤角质层细胞间脂质基板的末端之间的最短距离作为皮肤粗糙恶化的指标时，由于该距离根据测定条件的不同而不同，因此要求在固定的条件下进行。例如，如果上述基板上形成的脂质膜的厚度过薄，则距离的不均勻性大，如果过厚， 则两者的边界难以看清。因此，从确保再现性的观点出发，优选脂质膜厚度为5 ΙΟΟμπι， 特别优选为约50 μ m。此外，随着表面活性剂暴露的时间增大或温度增大，髓磷脂像与皮肤细胞间脂质基板之间的MM距离增大。从抑制不均勻性的观点出发，优选在约25°C的温度下暴露6小时之后测定髓磷脂像。然而，本发明的皮肤粗糙评价方法不限于这样的条件。所添加的表面活性剂只要在临界胶束浓度以上，则基本上可以在一定范围内形成髓磷脂像。 因此，在添加了临界胶束浓度以上的一定浓度的表面活性剂的情况下，髓磷脂像的顶端与基板的末端之间的最短距离没有大幅变化，因此本发明的皮肤粗糙评价方法可以在高浓度系统下实施，而且再现性高。以下，列举具体例更具体地说明本发明。另外，本发明并不受这些实施例限制。实施例1皮肤角质层细胞间脂质模拟基板的制备将神经酰胺III (95. 9 %,0. 3g) (Evonik Degussa公司，德国，埃森)、棕榈酸 (0. 15g)(于力，4歹7夕社，日本，京都)和胆固醇(0. 15g)(于力，4歹7夕社，日本，京都)溶解在氯仿(50cm3)和甲醇(IOcm3)的混合溶剂中。接着，将该脂质混合溶液(0. 2cm3) 在18X 18mm的盖玻片上展开，然后干燥。将所生成的脂质混合膜在玻璃管的烘箱内在 120°C下熔化，然后在相同温度下在氮气气氛中放置1小时。将该试样冷却到室温，然后在水中浸透M小时。最后，在包含饱和氯化钠的干燥器(相对湿度75%)内保存直至使用。皮肤角质层细胞间脂质模拟基板的物性评价方法用显微镜ECLIPSE TE 2000U( 二二 >社制，日本)直接观察盖玻片上形成的皮肤角质层细胞间脂质模拟基板，用3f W >社制的摄像机进行拍摄。每隔一分钟连续地获取图像。用具备SII SSC/5200分析装置的DSC-100 (七^ -一 ^ > ^ ^义社制，日本)进行差示扫描量热(DSC)测定。采用X射线衍射装置(理学社制RAD-RC，日本；和Bruker社制 D8 Discover，德国)，使用由石墨单色仪单色化了的高密度CuK α射线(λ =(XlMnm)，在 50mA、60kV和40mA、40kV的条件下进行X射线衍射(XRD)测定。红外(IR)吸收光谱采用 Bio-Rad社制Digilab FTS-60A分光计，通过使用了 KBr颗粒的透射模式进行测定而获得。 光谱是全部在4000 400CHT1之间扫描64次平均而得的。拉曼光谱使用Bomen FT-Raman accessory (Bomem Inc.，加拿大)，采用安装有液氮冷却的锗二极管检测器的MB FTHR光具座，将放射533nm的近红外线的Nd: Yag激光作为光源来测定。DSC 测定将本发明的基板进行了 DSC测定，结果确认了 5个吸热峰TJ42°C ) ,Tx(54. 8°C )、T2 (700C )、T3(880C )、T4(100. 2°C )(图2)。这些峰温度如下表所示，与人角质层的值基本上一致(SpectrochimicaActaPart A 1998，54，543—558.)。
[表 1]
权利要求
1.一种皮肤角质层细胞间脂质模拟基板，该皮肤角质层细胞间脂质模拟基板包含基板和在该基板上形成的脂质膜，其中，该脂质膜是由神经酰胺、棕榈酸和胆固醇形成的。
2.根据权利要求1所述的皮肤角质层细胞间脂质模拟基板，其中，所述神经酰胺、棕榈酸和胆固醇以神经酰胺棕榈酸胆固醇为20 70% 10 60% 20 40%的质量比存在。
3.一种皮肤粗糙的评价方法，其中，将在权利要求1或2所述的皮肤角质层细胞间脂质模拟基板中添加表面活性剂而在该基板上形成髓磷脂像的情况评价为该表面活性剂在体内引起皮肤粗糙，并且，该髓磷脂像的顶端与该基板的末端之间的最短距离越长，评价为该皮肤粗糙的程度越大。
全文摘要
本发明提供一种皮肤角质层细胞间脂质模拟基板，该皮肤角质层细胞间脂质模拟基板包含基板和在该基板上形成的脂质膜，其中，该脂质膜由神经酰胺、棕榈酸和胆固醇形成，神经酰胺、棕榈酸和胆固醇以20～70％∶10～60％∶20～40％(神经酰胺∶棕榈酸∶胆固醇)的质量比存在。
文档编号G01N33/15GK102265153SQ20098015230
公开日2011年11月30日 申请日期2009年9月1日 优先权日2008年12月26日
发明者今荣东洋子, 冈隆史, 才胁卓也, 森雄一郎, 氏原真树, 王晓娟 申请人:学校法人庆应义塾, 株式会社资生堂