专利名称：分析蛋白的抗原表位的方法
技术领域：
本发明涉及一种分析蛋白的抗原表位的方法。
技术背景
宿主的抗体反应在抵抗病原体感染的过程中起着重要作用，而体内的多克隆抗 体反应是由针对不同抗原或同一抗原的不同抗原表位的单克隆抗体组成的。深入的理解 这个复杂的过程能够为研究疾病的发病机制提供关键的信息，还能够为高效疫苗的研发 和疾病治疗提供重要的理论基础。
在抗原表位的诸多研究方法中，兴起于1990年的噬菌体展示肽库技术 (Scott, J.K.and G.P.Smith, Searching for peptide ligands with an epitope library.Science,1990.249 (4967) p.386-90.),即用随机合成的短肽文库(一般6_12个氨基酸，库容量达 IOll-IO12)和噬菌体展示系统进行筛选的方法，以其快捷、准确、不受氨基酸位点限制的 优点而逐渐成为目前应用最广、发展最快的抗原表位筛选平台之一。然而，噬菌体展示 肽库技术也存在很大的局限性(1)短肽文库可以产生的绝大部分是线性表位，不能很 好地模拟占抗原表位80%以上的构象型表位；(2)噬菌体的衣壳蛋白所能容纳的外源分 子小、结构简单，对外源蛋白缺乏修饰，该系统中很多细胞毒性分子和真核生物蛋白难 以表达和展示；( 噬菌体个体过小，多采用亲合层析柱或亲合聚苯乙烯板进行筛选， 筛选效率低；(4)每轮筛选后，噬菌体必须重新感染宿主细胞以便获得足够的病毒粒子 进行下一轮筛选，重组病毒粒子间感染能力的差别会造成一定的扩增优势；( 噬菌体 易被空气传播，因而容易引起交叉污染。发明内容
本发明的目的是提供一种分析蛋白的抗原表位的方法。
本发明提供的分析蛋白的抗原表位的方法，包括如下步骤
(1)构建目的蛋白的DNA文库；所述DNA文库中，所述目的蛋白的编码基因的 DNA片段插入T载体；所述T载体含有酵母a凝集素Aga2p的编码基因，且所述DNA 片段编码的肽片段的N端与所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；
(2)将所述DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库；
(3)将目的蛋白的抗体与酵母展示文库混合，分选出与抗体结合的酵母；
(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述T载体的DNA片段的核 苷酸序列分析蛋白的抗原表位(包括线型表位和构象型表位)。
所述T载体为在PCTC0N2质粒的Nhe I和BamH I位点之间插入序列表的序列 表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的pCTC0N2_T质粒；所述目的蛋 白的DNA片段插入所述pCTC0N2-T质粒的Xcm I酶切位点。
所述酵母为酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBY100。
所述方法中，可利用流式细胞术(FACS)进行步骤(3)中的所述分选。3
步骤O)中，将所述DNA文库展示在所述酵母表面包括如下步骤
①提取所述DNA文库的质粒转化所述酵母，得到重组酵母；
②收集重组酵母诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库；所述诱导是通过向 培养酵母的体系中加入半乳糖实现的。
所述诱导培养的参数具体可为采用SGCAA培养基，20°C、250rpm摇床中培 养36小时。SGCAA培养基的配方具体为半乳糖20g，酵母氮源6.7g，酸水解酪素相， NaHPO4 · 12H20 13.6g, NaH2PO4 · H2O 8.56g,加重蒸水至 1L。
构建所述DNA文库的方法包括如下步骤
(1)将目的蛋白的编码基因用DNase I进行消化，回收50_100bp的DNA片段；
(2)将步骤(1)回收的DNA片段进行随机片段重组；
(3)将步骤⑵重组后的DNA片段加A尾；
(4)将加A尾后的DNA片段插入所述pCTCON2_T质粒的Xcm I酶切位点，然后转化宿主菌，得到所述DNA文库。
所述随机片段重组的反应体系具体可为90ng小片段DNA，4μ1 5XPhire buffer, 0.8 μ 1 dNTPs, 0.5 μ 1 Phire DNA 聚合酶(1 个单位)，力卩 ddH20 至 20 μ 1。所述随机片段重组的反应程序具体可为95°C 2分钟；94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C N秒钟， 10个循环或15个循环；72°C 10分钟；第1个循环时，N为60秒，自第2个循环开始， 每个循环比上个循环N增加k (即第2个循环时，N为65秒，第3个循环时N为70秒， 以此类推)。所述反应程序中，优选10个循环或15个循环。
也可用物理剪切法、随机引物扩增法和酶消化法等方法构建目标蛋白的DNA文库。
所述目的蛋白的抗体可为多克隆抗体(如商购的多克隆抗体或用目的蛋白免疫 动物得到的多克隆抗体)或单克隆抗体。
所述宿主菌可为大肠杆菌，优选大肠杆菌DH5a。
所述目的蛋白可为序列表的序列1所示的蛋白(H5N1禽流感病毒的HA蛋白)。 所述目的蛋白的编码基因优选序列表的序列2所示的DNA。
本发明还保护pCTCON2-T质粒，是在pCTCON2质粒的Nhe I和BamH I位点之间插入序列表的序列表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的。
本发明还保护-种酵母表面展示系统，包括所述pCTCON2-T质粒和酵母。
所述酵母可为酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBY100。
上述方法基于如下原理信号肽引导外源多肽向细胞外分泌，外源多肽片段的 N端与酵母a凝集素Aga2p的C端融合(320个氨基酸残基，含有GPI锚的信号序列)， 可通过Aga2p锚定到酵母表面的Agalp受体，从而暴露在酵母细胞表面。
与噬菌体展示相比，酵母表面展示系统在构建和筛选蛋白文库方面具有独到的 优点(1)酵母细胞对蛋白的修饰途径更多，可以方便地展示大分子量和复杂的蛋白， 以更好的模拟空间构象；( 酵母可采用FACS逐个筛选，大大提高准确性与筛选通量； (3)酵母可独立完成自身的生长复制过程，操作简便，干扰因素少；(4)酵母不易被空气 传播，不易交叉感染。


图1为表面展示HA、HAU HA2的酵母的流式检测结果。
图2为荧光显微镜下观察HA在重组酵母甲表面展示的情况。
图3为H5N1-HA蛋白的抗原表位的分析流程图。
图4为构建H5N1-HA蛋白的DNA文库过程中的1 %琼脂糖凝胶电泳图。
图5为FACS分选前后的FACS分析结果(富集效果)。
图6为分选得到的部分单个酵母克隆的FACS检测结果。
图7为序列比对结果。
图8为频率统计结果。
图9为血清优势识别区域。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实 验方法，如无特殊说明，均为常规方法。FACS分析和分选采用AriaII流式细胞仪进行。 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pCTCON2质粒(酵母展示载体)由MIT Dane Wittrup教授惠赠，公众可以从清 华大学获得；参考文献Chao, G.，etal.，Isolating and engineering humanantibodies using yeast surface display.NATURE PROTOCOLS, 2006.1(2) p.755-768)。
酿酒酵母EBYlOO invitrogen公司，产品目录号C839-00。Biomed质粒小提 试剂盒博迈德公司。大肠杆菌DH5 α 天根公司。Phire DNA聚合酶(Phire hot-start DNAPolymerase) New England Biolabs。单链 carrier DNA (鲑鱼精 DNA) Merck 公司， 产品目录号CB262012o
YPD培养基葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母提取物lg，加重蒸水至100ml。
SDCAA培养基葡萄糖20g，酵母氮源6.7g，酸水解酪素5g，NaHPO4 · 12H20 13.6g，NaH2PO4 · H2O 8.56g，加重蒸水至 1L。
SDCAA平板葡萄糖20g，酵母氮源6.7g，酸水解酪素5g，琼脂粉15g， NaHPO4 · 12H2013.6g, NaH2PO4 · H2O 8.56g,加重蒸水至 1L。
SGCAA培养基半乳糖20g，酵母氮源6.7g，酸水解酪素5g，NaHPO4 · 12H20 13.6g，NaH2PO4 · H2O 8.56g，加重蒸水至 1L。
实施例1、pCTCON2质粒和酵母展示外源蛋白能力的评价
1、重组质粒的构建
将H5N1-HA蛋白的编码基因(H5N1禽流感病毒的HA蛋白，如序列表的序列1 所示，其编码基因如序列表的序列2所示)插入pCTCON2质粒的Nhe I和BamH I位点 之间，得到重组质粒甲。
将H5N1-HA1蛋白的编码基因(如序列表的序列2自5’末端第1_987位核苷 酸所示，编码序列表的序列1自N末端第1至3 位所示的氨基酸残基)插入pCTCON2 质粒的Nhe I和BamH I位点之间，得到重组质粒乙。
将H5N1-HA2蛋白的编码基因(如序列表的序列2自5’末端第988-1545位核苷酸所示，编码序列表的序列1自N末端第330至515位所示的氨基酸残基)插入pCTCON2 质粒的Nhe I和BamH I位点之间，得到重组质粒丙。
2、重组酵母的获得
将重组质粒甲转化酵母菌株EBY100，得到重组酵母甲。
将重组质粒乙转化酵母菌株EBY100，得到重组酵母乙。
将重组质粒丙转化酵母菌株EBY100，得到重组酵母丙。
3、外源蛋白的诱导表达
分别将重组酵母甲、重组酵母乙和重组酵母丙进行诱导表达，然后用H5N1-HA 蛋白免疫的小鼠血清和FITC荧光标记的抗小鼠的二抗进行酵母染色，最后分别利用 FACS检测和荧光显微镜检测表面展示情况。
FACS检测结果见图1;同阴性对照相比，三种酵母都能被荧光标记，出现了一 个阳性峰；比较HAl和HA2的流式结果还可以看出，HAl酵母的荧光强度比HA2酵母 的荧光强度要强，这反映了在H5N1-HA蛋白免疫的小鼠多抗血清中，大部分抗体是针对 HAl的。重组酵母甲的荧光显微镜检测结果见图2，在荧光显微镜下可以观察到，酵母 表面有绿色荧光。以上两个结果表明酵母展示系统能够很好的工作。
实施例2、pCTCON2-T质粒(重组酵母展示载体)的构建
为了便于建库，需要将pCTCON2质粒改造成T载体，步骤如下
1、合成序列表的序列3所示的DNA(双链)。
5， -AGTCGCTAGC CCAGGGATAGGGTGGCCACCCTATCCCTGGGGATCCGGGT-3，(序列 3)。
左边的下划线标注Nhe I识别序列，右边的下划线标注BamH I识别序列，粗体 标注两个Xcm I识别序列。
2、用限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切步骤1合成的DNA，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切pCTCON2质粒，回收载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到pCTCON2-T质粒(骨 架载体为pCTCON2质粒，在骨架载体的Nhe I和BamH I位点之间插入了序列表3自5， 末端第11至40位核苷酸所示的DNA)。pCTCON2-T质粒在pCTCON2质粒里引入了两 个Xcm I酶切位点，用限制性内切酶Xcm I酶切会形成T尾。
实施例3、应用本发明的方法分析H5N1-HA蛋白的抗原表位
应用本发明的方法筛选H5N1-HA蛋白的抗原表位，流程如图3所示。首先随 机切割H5N1-HA蛋白的编码基因并进行重组，得到随机片段；将随机片段通过T-A连 接插入PCTCON2-T质粒；然后转化酿酒酵母，诱导表达后多种融合多肽(随机片段编码 的多肽与Aga2蛋白的C端融合)展示在酿酒酵母表面(酵母展示文库)；通过H5N1-HA 蛋白的抗体(多克隆抗体或单克隆抗体)进行FACS分选，获得与抗体结合的重组酵母； 将各个筛选得到的重组酵母提质粒测序，根据测序结果进行抗原抗体相互作用的研究。
一、构建H5N1-HA蛋白的DNA文库(H5N1-HA随机切割片段文库)
构建H5N1-HA蛋白的DNA文库，首先将H5N1-HA蛋白的编码基因通 过DNaseI进行随机切割，获得约50_100bp的小片段，然后通过随机重组得到具有特 定长度分布的随机片段 DNA 文库(Lin，Ζ.，S.Li and Y.Chen, Identification of ViralPeptideFragments for Vaccine Development.Viral Applications of Green FluorescentProtein Methods and Protocols, 2009 p.261-274. ； Chen, Y., et al.，Randomdissection to select for protein split sites and its application in proteinfragment complementation.PROTEIN SCIENCE, 2009.18 (2) p.399-409.)。上述方法非常类似于 DNA shuffling 的程序 (Lorimer, Land I.Pastan, Randomreeombination of antibody single-chain fv sequences after fragmentation withdnasei in the presence of Mn2+.Nucleic Acids Res, 1995.23 (15) p.3067-3608.),巧妙地利用片段重组过程来调节随机片段DNA文库的分布，可根据筛选 需要构建更为合理的文库，为获得关键的构象型抗原表位提供基础。
1、大量扩增目的基因
①进行目的基因PCR扩增
合成序列表的序列2所示的H5N1-HA蛋白的编码基因，作为模板，用HA_F和 HA-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(模板DNA)。模板DNA的琼 脂糖凝胶电泳图见图4的泳道A。
HA-F 5，-GATCAGATTTGCATTGGTTA-3，；
HA-R 5，-TATTTGGTAAGTTCCTATTG-3，。
②采用QIAquick PCR Purification Kit纯化回收PCR扩增产物，进行DNA定量 (DNA的浓度应大于130ng/ μ 1)。
2、DNase I 随机消化
①准备DNase I 底物溶液；4 μ g 模板 DNA、2.5 μ 1 IM Tris-Cl (ρΗ7.5)，10 μ 1 50mMMnCl2,力口 ddH20 至 49 μ 1。
②加入1 μ 1 DNaseI(0.075U)(购自 Worthington 公司，产品目录号 LS006361)， 15°C 反应 4min。
③加入10 μ 1 0.5Μ EDTA水溶液终止反应。
④90°C放置10分钟，进一步使DNase I失活。
3、纯化DNase I酶切片段产物
①使用Pall超滤浓缩离心管(截留分子量为30K)过滤去除步骤2的反应体系中 的模板DNA。
②将步骤①收集的滤液通过Pall超滤浓缩离心管(截留分子量为3K)，回收分 子量为3K以下的小片段DNA。采用Nanodrop 2000分光光度计(rThermo)确定DNA浓度。
步骤②得到的小片段DNA的琼脂糖凝胶电泳图见图4的泳道B，大小为 50-100bp。
4、小片段DNA的重组
将步骤3得到的小片段DNA进行随机片段重组，得到随机片段。
重组反应体系90ng小片段 DNA，4 μ 1 5 XPhire buffer, 0.8 μ 1 dNTPs, 0.5 μ 1 PhireDNA聚合酶(1个单位)，加ddH20至20 μ 1。
重组反应程序95°C 2分钟；94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C N秒钟，10个循 环或15个循环；72°C 10分钟；4°C保存。第1个循环时，N为60秒，自第2个循环开 始，每个循环比上个循环N增加即第2个循环时，N为65秒，第3个循环时N为70秒，以此类推)
得到的随机片段用QIAquick PCR Purification Kit纯化并定量其浓度。
10个循环得到的随机片段的琼脂糖凝胶电泳图见图4的泳道C，大小为 100-500bp。15个循环得到的随机片段的琼脂糖凝胶电泳图见图4的泳道D，大小为 200-800bp。将15个循环得到的随机片段进行步骤5。
5、随机片段加A尾
将步骤4得到的随机片段采用Α-tailing DNAKit(Takara)按试剂盒的说明书加A尾，具体步骤如下
在微量离心管中配制如下加“A”反应液(50ul) IOXA-Tailing Buffer 5 μ 1, dNTP Mixture 4 μ 1，Α-Tailing Enzyme 0.5 μ 1，随机片段 2 μ g，力口 ddH20 至 50 μ 1 ； 72°C反应20分钟，然后冰浴4分钟；然后用QIAquick PCR Purification Kit纯化，并用 Nanodrop2000分光光度计定量DNA片段浓度。
6、骨架载体的制备
用限制性内切酶酶切pCTCON2-T质粒，得到骨架载体。
酶切体系pCTCON2-T质粒 24 μ g，10XNEB buffer2 10 μ 1，10XBSA 1 μ 1， 限制性内切酶Xcm I 2 μ 1，力卩ddH20至100 μ 1。
反应条件37°C水浴3-6小时。
采用QIA quick Gel Extraction ICit回收酶切产物。将回收的酶切产物用 QIAquickPCR Purification Kit纯化，并用Nanodrop2000分光光度计定量DNA片段浓度。
7、随机片段库与载体的结合
将步骤5加“A”后的随机片段和步骤6的骨架载体恒温金属浴16°C连接过 夜(12小时以上均可)。连接体系10XT4 ligase buffer 20 μ 1，力卩“Α”后的随机片段 (1 μ g)，骨架载体(4 μ g)，T4 ligase (New England Biolabs) 10 μ 1，力口 ddH20 M 200 μ L
8、电转
①用QIAquick PCR Purification Kit纯化步骤7的连接混合物。
②将纯化后的片段电转到大肠杆菌DH5a细胞中。
③涂LB平板(含50mg/ml氨苄青霉素)，37°C温箱中过夜培养，次日查看转化 结果，统计板上的菌落数(库容量)。库容量为500,000左右。
④采用刮板器刮干净LB平板上的菌落，放入60ml LB培养基(含lOOmg/ml氨 苄青霉素)，即为H5N1-HA蛋白的DNA文库。
二、酵母转化、培养和诱导
1、酵母转化
平行进行10组酵母转化，每组均采用如下方法
(1)从YPD平板上挑取一个新鲜的酿酒酵母EBY100单克隆至5ml YPD液体培 养基，30°C 250rpm过夜培养；
(2)将过夜培养物稀释至OD600值为0.4-0.5，在30°C摇床中继续培养至OD600 值达到2(约4小时)；
(3)室温1500g离心5分钟，弃上清，收集酵母细胞；用25ml无菌水重悬酵母 细胞，室温1500g离心5分钟，弃上清，收集酵母细胞；8
(4)用Iml 0.1M醋酸锂溶液重悬酵母细胞，30C水浴10分钟，然后13000g离心5s,弃上清，收集酵母细胞；
(5)用0.5ml 0.1M醋酸锂溶液重悬酵母细胞，50ul每管分装(感受态细胞)；
(6)将单链carrier DNA放入沸水中水浴5分钟，然后立即取出冰浴；
(7)采用Biomed质粒小提试剂盒(博迈德)提取步骤一得到的DNA文库的质 粒，将1 μ g质粒稀释至50ul ；
(8)取一管步骤( 得到的感受态细胞，13000g离心&，弃上清；依次加入 240 μ 50% PEG溶液、36 μ 1 IM 醋酸锂溶液、25 μ 1 单链 carrier DNA、50ul 步骤(7)的 质粒，充分混勻；30°C水浴30分钟，然后42°C水浴15分钟；13000g离心&，弃上清， 收集酵母细胞；
(9)用Iml无菌水重悬酵母细胞，取出IOOul涂SDCAA平板，在30°C恒温箱中 放置约48小时，能看到明显的菌落，统计菌落数，计算酵母转化效率。每一组的转化效 率(菌落数)为50,000-100,000,10组的库容量就是500,000-1000,000，能够涵盖通过理论 计算的绝大多数克隆。
2、诱导
(1)每组剩余的900ul菌液用IOml SDCAA重悬后混合在一起，30°C，250rpm摇 床中培养至OD600约为3 (24小时)。
(2)取500微升菌液，室温8000rpm离心1分钟，弃上清，用Iml SGCAA培养基重悬细胞，然后稀释至OD600在0.5-1之间；
(3) 200C 250rpm摇床中诱导36小时，得到的菌液即为酵母展示文库。
三、酵母展示文库的FACS分选及FACS分选效果评价
1、筛选血清的制备
用H5N1-HA蛋白(北京义翘神州生物技术公司货号11048-V08H1)免疫 BALB/c小鼠(中国医学科学院动物研究所，SPF级)，采用腹部皮下免疫注射，共免疫 4次，每次间隔3周，第1次免疫剂量为20ug/只，其余次数免疫剂量为IOug/只；第4 次免疫后取血清作为筛选血清；第1次免疫前取血清作为阴性对照血清。
2、酵母展示文库的FACS分选
将步骤二得到的酵母展示文库进行FACS分析或FACS分选(FACS分析取IO6-IO7 个细胞，FACS分选取IO7-IO8个细胞)。FACS分析中用阴性血清作为筛选血清的对照。
①取酵母细胞装入1.5ml Ep管中，8000rpm(或> 8000rpm也可)离心1分钟，弃上清；
②加入lmlPBS，轻弹管壁将酵母重悬，8000rpm离心1分钟，取沉淀；重复此操作一次；
③加入用50ul PBS 100倍稀释的筛选血清，轻弹混勻，冰浴1小时，期间每隔 15-20分钟轻弹管壁；
④加入lmlPBS，混勻，8000rpm 4°C离心1分钟，取沉淀；重复此操作一次；
⑤加入用50ul PBS 100倍稀释的荧光标记的二抗(PE标记羊抗鼠^G，购自 SantaCruz公司，货号sc-3738)，轻弹混勻，冰浴45分钟，期间每隔15-20分钟轻弹管壁 (注意避光)；
⑥加入lmlPBS，混勻，8000rpm 4°C离心1分钟，取沉淀(酵母)；重复此操作一次；
⑦用PBS重悬酵母(FACS分析用0.5-lml PBS, FACS分选用3_4ml PBS)，转 移到流式细胞仪进行FACS分选或FACS分析。
采用阴性血清的FACS分析图谱见图5A，采用筛选血清的FACS分析图谱见图 5B。与筛选血清结合的酵母细胞约占2%。FACS分选中收集与筛选血清结合的酵母细 胞。
3、FACS分选效果评价
将步骤2分选得到的酵母细胞(10万-50万)转移到试管中，加入SDCAA培 养基至总体积为2ml，将试管置于30°C摇床中，让酵母复苏2-3小时。取出200ul(大约 5000-10000个酵母细胞)复苏的菌液涂SDCAA平板，将平板倒置在30°C恒温箱中，48 小时后收菌，得到55个阳性单克隆；剩余的菌液加入SDCAA至总体积为5ml，30°C摇 床培养M小时(混合菌液)。将阳个阳性单克隆和混合菌液分别进行诱导，然后进行 FACS分析。诱导方法同步骤二的2。FACS分析方法同步骤三的1。
混合菌的FACS分析图谱见图5C，与筛选血清结合的酵母细胞占40%左右。
11个单克隆的FACS分析结果见图6。从图6可以看出，不同的单克隆的图谱 是不一样的，这表明不同的单克隆与血清的反应情况是不一样的。
四、测序及序列分析
1、对于步骤三的3中FACS分析为阳性的克隆，扩大培养后，用甘油冻存菌种 (甘油终浓度15% )，剩余全部菌液用质粒小提试剂盒提取质粒；
2、由于从酵母中提取的质粒拷贝数很低，将提取的质粒转化到大肠杆菌 DH5a,然后进行测序(检测插入pCTCON2-T质粒中的片段的核苷酸序列)。
3、序列分析
采用kquencher软件将插入到pCTCON2载体中的随机片段与HA全长进行序列比对，结果见图7。采用Excel软件依照序列比对结果将HA上每个位点上氨基酸出现的 频率进行分析统计，结果见图8。采用PyMOL软件对统计结果和蛋白晶体结构进行分 析，结果见图9。kquencher软件，Excel软件和PyMOL (软件均无特殊的参数设定，均 按照软件的操作手册进行分析。
挑选出来的片段都是能与多克隆抗体血清反应的片段，从频率图就可以看出多 抗识别位点的分布情况。血清主要识别HA1，在HAl与HA2的交界处都没有识别位点。 血清中的多克隆抗体有80%是针对HAl的，20%是针对HA2。另外，血清中的多克隆 抗体在HAl区域有两个优势识别区域，位于70aa_120aa和150aa_200aa，这两个区域都位 于HA的受体结合区域(ReceptorBinding Domain)，蓝色区域位于70aa_120aa，粉红色区 域位于 150aa_200aa。
重复进行三次实施例3的实验，均得到相似的结果。
权利要求
1.分析蛋白的抗原表位的方法，包括如下步骤(1)构建目的蛋白的DNA文库；所述DNA文库中，所述目的蛋白的编码基因的 DNA片段插入T载体；所述T载体含有酵母a凝集素Aga2p的编码基因，且所述DNA 片段编码的肽片段的N端与所述酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)将所述DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库；(3)将目的蛋白的抗体与酵母展示文库混合，分选出与抗体结合的酵母；(4)将筛选出的酵母提取质粒进行测序，根据插入所述T载体的DNA片段的核苷酸 序列分析蛋白的抗原表位。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述T载体为在pCTCON2质粒的NheI 和BamH I位点之间插入序列表的序列表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得 到的pCTCON2-T质粒；所述目的蛋白的DNA片段插入所述pCTCON2_T质粒的Xcm I 酶切位点；所述酵母为酿酒酵母，优选为酿酒酵母EBY100。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中，利用流式细胞术进行步 骤(3)中的所述分选。
4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于步骤(2)中，将所述DNA文库 展示在所述酵母表面包括如下步骤①提取所述DNA文库的质粒转化所述酵母，得到重组酵母；②收集重组酵母诱导培养36小时以上，得到酵母展示文库；所述诱导是通过向培养 酵母的体系中加入半乳糖实现的。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于步骤(1)中，构建所述DNA 文库的方法包括如下步骤(1)将目的蛋白的编码基因用DNaseI进行消化，回收50_100bp的DNA片段；(2)将步骤(1)回收的DNA片段进行随机片段重组；(3)将步骤(2)重组后的DNA片段加A尾；(4)将加A尾后的DNA片段插入所述pCTCON2-T质粒的XcmI酶切位点，然后转 化宿主菌，得到所述DNA文库。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌，优选大肠杆菌 DH5a。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述目的蛋白为序列表的序列 1所示的蛋白；所述目的蛋白的编码基因优选序列表的序列2所示的DNA。
8.pCTCON2-T质粒，是在pCTCON2质粒的NheI和BamH I位点之间插入序列表的 序列表3自5’末端第11至40位核苷酸所示的DNA得到的。
9.一种酵母表面展示系统，包括权利要求8所述的pCTCON2-T质粒和酵母。
10.如权利要求9所述的酵母表面展示系统，其特征在于所述酵母为酿酒酵母，优 选为酿酒酵母EBY100。
全文摘要
本发明公开了一种分析蛋白的抗原表位的方法。本发明的方法包括如下步骤(1)构建目的蛋白的DNA文库；蛋白的编码基因的DNA片段插入T载体；T载体含酵母a凝集素Aga2p的编码基因，DNA片段编码的肽段与酵母a凝集素Aga2p的C端融合；(2)将DNA文库展示在酵母表面，得到酵母展示文库；(3)分选出与目的蛋白的抗体结合的酵母；(4)提取质粒测序，分析蛋白的抗原表位。本发明具如下优点(1)酵母细胞对蛋白的修饰途径多，可方便地展示大分子量和复杂的蛋白，更好的模拟空间构象；(2)酵母可采用FACS逐个筛选，提高准确性与筛选通量；(3)酵母可独立完成自身的生长复制过程，操作简便，干扰因素少；(4)酵母不易被空气传播，不易交叉感染。
文档编号G01N33/569GK102021242SQ201010526018
公开日2011年4月20日 申请日期2010年10月25日 优先权日2010年10月25日
发明者刘中华, 史宣玲, 左腾, 张林琦, 徐望晖, 林章凛 申请人:清华大学