专利名称：磺胺二甲氧嘧啶elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测磺胺二甲氧嘧啶残留量的试剂盒，特别是检 测动物源性食品中磺胺二甲氧嘧啶残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbnentAssay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免 疫技术之后发展起来的一种酶免技术。( 二)磺胺二甲氧嘧啶是应用广泛的抗菌素，对畜禽疾病控制和治疗起到重要作 用。但由于磺胺二甲氧嘧啶存在严重副作用，人体中长期存在磺胺药物会导致许多细菌对 磺胺药物产生抗药性，且有潜在的致癌性。我国农业部第235号文件规定其残留限量为 100μ g/kg，由于高效液相色谱等仪器分析方法样本前处理及测定操作繁琐和费用高，推广 使用受到限制。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的磺胺二 甲氧嘧啶残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需 要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中磺胺二甲氧嘧啶残留量的测定，减少了检 测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种磺胺二甲氧嘧啶ELISA检测试剂盒，包括盒体和 盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份 说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微 孔条上预包被磺胺二甲氧嘧啶偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、 酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶 位共15个。酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆 装酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫 制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将14瓶试剂用不同大 小、不同颜色的塑料瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质控报 告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。14瓶试剂分别为7瓶Iml标准品溶液、7ml酶 标二抗、7ml抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、 50ml浓缩复溶液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进 行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封 袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的磺胺二甲氧嘧啶将和酶 标板微孔条上预包被的磺胺二甲氧嘧啶偶联抗原竞争抗磺胺二甲氧嘧啶抗体，加入酶标二 抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中磺胺二甲氧嘧啶的残留量成负相关，与标准 曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中磺胺二甲氧嘧啶残留量，其操作简便 易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度动物组织(肌肉、肝脏等)、鸡蛋、虾、鱼 样本的最低检测限为ι μ g/kg ；蜂蜜样本的最低检测限为ι μ g/kg ；牛奶样本的最低检测限 为20 μ g/kg ；样本的回收率范围均在60% 100%之间。相对于其他磺胺二甲氧嘧啶检测 方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、离心机、振荡机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于磺胺二甲氧嘧啶残留 量的检测。


图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被磺胺二甲氧嘧啶偶联抗原(3)固定于酶标 板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴 或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明 帽的半透明PE塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料试剂 瓶(5)用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显 色液A液，红色帽(6)的黑色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的 白色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料试剂瓶(8)用于封装 7ml酶标二抗，绿色帽的白色PE塑料试剂瓶(8)用于封装7ml抗体工作液，黑色帽的半透 明PE塑料试剂瓶(9)用于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个下凹瓶 位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A液瓶 位(14)，7ml显色液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml抗体工作液瓶位(16)，7ml酶 标二抗瓶位(15)，7个Iml/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19)是硬纸盒。
具体实施方式
一、样本的前处理1.配液配液1:2M氯化钠溶液称取11. 69g氯化钠加去离子水溶解定容至100ml。配液2 0. 02M磷酸盐缓冲液 称取2. 58g十二水合磷酸氢二钠和0. 44g 二水磷酸二氢钠加去离子水溶解定容至 500ml (用于样本提取后的复溶)；配液3 :乙腈-水溶液(动物组织、鸡蛋专用)量取84ml无水乙腈加入到16ml去离子水中混勻配液4 提取工作液用去离子水将20X浓缩提取液按1 19体积比进行稀释(1份20X 浓缩提取液 +19份去离子水)用于低脂肪样本提取用，提取工作液在4°C环境可保存一个月。配液5 洗涤工作液[0027]用去离子水将20X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2.样本处理步骤动物组织(肌肉、肝脏等)、鸡蛋、虾、鱼等用均质器均质组织样本；称取3. 0士0. 05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加 入9ml乙腈-水溶液，用振荡器振荡10min，3000g以上15°C离心IOmin ；取上清液至另 一个50ml聚苯乙烯离心管中，加入aiil 2M氯化钠溶液和7ml乙酸乙酯，用振荡器混合振荡 IOmin, 3000g以上15°C离心5min ；将上层液转至IOml干净的玻璃试管中，于50 60°C水 浴氮气流下吹干；加入0. 02M磷酸盐缓冲液Iml用振荡器混合振荡lmin，再用正己烷Iml混 合2min，3000g以上15°C离心5min，除去上层液；取50 μ 1下层用于分析。蜂蜜样本称取1. 0 士0. 05g蜂蜜样本于50ml聚苯乙烯离心管中，加入^iil 0. 02M磷酸盐缓 冲液溶解；加入8ml乙酸乙酯，用振荡器振荡10min，3000g以上室温离心IOmin ；取上层液 体于細1至IOml干净的玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干，加Iml 0. 02M磷酸盐 缓冲液溶解干燥的残留物；取50 μ 1用于分析。牛奶样本取牛奶样本，3000g以上，10°C离心lOmin，吸除上层脂肪；取Iml离心后的牛奶样 本，用0. 02M磷酸盐缓冲液按1 19的体积比进行稀释(即20 μ 1牛奶+380 μ 1 0. 02磷 酸盐缓冲液)；取50 μ 1用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温Q0-25°C )平衡30min以上，注意每种 液体试剂使用前均须摇勻。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记 录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品/样本加标准品/样本50 μ 1到对应的微孔中，随即加入酶标二抗 50 μ 1/孔，在加入抗体工作液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置25°C避光环境 中反应60min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ 1/孔，充分洗涤 4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、显色加入底物液A液50μ 1/孔，再加底物液B液50μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用 盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min。8、测定加入终止液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450nm处(建议用双 波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止 液用目测法可进行判定)。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与磺胺二甲氧嘧啶残留量成负相关。[0046]1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(μ g/L)。 假设样本1的吸光度值为0. 113，样本2的吸光度值为0. 554，标准液吸光度值分别是 0 μ g/L 为 2. 155 ； 1 μ g/L 为 1· 345 ;3 μ g/L 为 0· 891 ;9 μ g/L 为 0. 340 ；27 μ g/L 为 0. 131 ； 81 μ g/L为0. 060。则样本1的浓度范围是27 μ g/L-81 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即 可得出样本中磺胺二甲氧嘧啶残留的浓度范围；样本2的浓度范围是3 μ g/L-9 μ g/L再乘 以其对应的稀释倍数即可得出样本中磺胺二甲氧嘧啶残留量的浓度范围。2、定量分析 (1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值(%) = ΒX 100%
B0B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0-O μ g/L标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以磺胺二甲氧嘧啶标准品浓度(μ g/L)的半对数 为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本 所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中磺胺二甲氧嘧啶实际残留量。四、测定前的注意事项1、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20_25°C )会导致所有标准的OD值 偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性， 重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需要将其摇勻。4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。5、不要使用过了有效日期的试剂盒;也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂， 掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。6、储存条件保存试剂盒于2_8°C，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质 和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0. 5个单位 (A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色30min即可。若颜色较浅，可延长 反应时间，但不得超过40min。反之，则减短反应时间。9、该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度 发生变化。
权利要求1.一种磺胺二甲氧嘧啶ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一 张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特 征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被磺胺二甲氧嘧 啶偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色 液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶标 二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色 帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑 料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶， 下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小 与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗1瓶，7ml ；抗体工作液1瓶， 7ml ；显色液A液1瓶，7ml ；显色液B液1瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶，40ml ； 浓缩复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物源性食品中磺胺二甲氧嘧啶残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、磺胺二甲氧嘧啶抗体工作液、7个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的磺胺二甲氧嘧啶将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗磺胺二甲氧嘧啶抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中磺胺二甲氧嘧啶的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在磺胺二甲氧嘧啶的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK201852831SQ20102058656
公开日2011年6月1日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者何方洋, 余厚美, 冯月君, 刘福林, 罗贵昆, 蒲小容, 赵正苗 申请人:北京勤邦生物技术有限公司