专利名称：一种金纳米棒免疫探针及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米免疫技术领域，特别是涉及一种适用于多种介质的金纳米棒免疫 探针及其制备方法与应用。
背景技术：
免疫学检测在如今的诊断科学中担当着十分重要的角色，比如对肿瘤的早期检 出、感染性疾病及免疫性疾病的诊断等。免疫学检测的基本原理是抗原和抗体之间在多种 力作用下的非共价结合反应，最初的免疫反应仅在抗原抗体间进行。随着相关学科的发展， 尤其是材料科学领域的飞速前进为检验科学的发展带来了新的契机。通过相关反应，抗原 和抗体的任一方均可连接相应的新型纳米标记物，通过免疫反应的发生对标记物的磁学、 光学、电学等性质的改变作为监测手段，起到对免疫反应的放大作用，提升免疫检测的灵敏 度水平。如量子点、金纳米材料、碳纳米管、磁性纳米粒子等，金纳米棒就是其中较为活跃的 一种。与球形金纳米粒子相比，金纳米棒状材料具有一些显著的优点如金纳米棒的吸 收和散射截面比同体积的球形金颗粒高一个数量级；金纳米棒的纵向等离子体共振峰的峰 位可以简单通过改变其长径比实现在可见及近红外光谱范围的连续可调；金纳米棒对周围 环境折射率变化的敏感性远远高于球形金颗粒。本发明中，就是将它的这一光学特性作为 纳米生物传感研究的理论基础。一般情况下，物质表面等离子共振特征的峰移动△ λ与 材料的灵敏度因子、表面所吸附分子和溶解介质的折光指数、吸附层的有效厚度等因素有 关(Nature Materials，2008，vol (7)，442-453)。当免疫反应在金纳米棒周围发生时，抗原 抗体的结合必然会造成上述诸多因素的变化，从而改变其相对灵敏的纵向等离子吸收峰位 置。目前为止，国际上有许多研究小组开展了相关研究，但他们中的大多数均采用化学修 饰的方法偶联抗体与金纳米棒，操作较为繁琐。而且，前期实验也证明化学修饰后的金纳 米棒对介质环境的耐受性差，高的离子强度仍会导致聚集(生物技术通讯，2009，vol 20， 680-682)。这一点，与被广泛使用的金纳米粒子(胶体金)相比具有一定差距。另一方面，纵观当前研究，少有研究将金纳米棒免疫探针的应用扩展到与临床相 关的介质，如血清、尿液、唾液中(Anal. Chem.，2007，79 (14)，5278-5283)。实际上，将新型 纳米材料应用于生物传感器方面的研究浩如烟海，但是由于纳米材料本身的表面与界面效 应、小尺寸效应、量子尺寸效应等特性，使这些传感器的研制和应用受到制约，长期处于实 验室研制阶段。具体地说，其相关生物传感器的检测介质很少能够脱离“缓冲体系”的温床， 排除实际检测介质中诸如蛋白、葡萄糖、无机离子、酶等成分的干扰，而进入临床应用阶段。

发明内容
在于针对原有纳米生物传感器对检测介质的局限性，本发明的目的之一是提供一 种适用于多种介质的金纳米棒免疫探针。该金纳米棒免疫探针，是经金纳米种子的制备、金纳米棒的制备及浓缩、抗体修饰
4以及封闭后得到的产品。本发明的第二个目的是提供一种金纳米棒免疫探针的制备方法。本发明所提供的制备方法，可包括以下步骤1)制备金纳米种子在表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)存在的情况下， 通过化学还原法把氯金酸中的正三价金还原为金纳米种子；2)金纳米棒的制备及浓缩将步骤1)制备的金纳米种子加入到金纳米棒的生长 溶液中制备金纳米棒，离心去除过量的CTAB，并将金纳米棒浓缩；3)抗体修饰将浓缩后的金纳米棒加入到抗体溶液中，使金纳米棒与抗体之间通 过静电相互作用反应，得到与抗体偶联的金纳米棒_抗体复合物；4)封闭用无关蛋白溶液作为封闭剂对金纳米棒-抗体复合物洗涤，再经离心分 离、浓缩、纯化，得到能特异性识别相应抗原的金纳米棒免疫探针。在上述金纳米棒免疫探针的制备方法中，所述步骤1)金纳米种子的制备方法具 体为首先，将0. 25mL 0. 01mol/L的氯金酸溶液加入到7. 5mL 0. lmol/L的CTAB溶液中， 混勻后再将0. 6mL 0. 01mol/L新鲜制备、置于冰水浴中的硼氢化钠溶液加入到上述的溶液 中，来回倒置混勻2分钟，得到金纳米种子的亮棕黄色溶液。所述步骤1)制备的金纳米种子应静置于25°C水浴中，制备后2 5h可使用。所述步骤2)金纳米棒生长的方法具体为将4mL 10mmol/L的氯金酸溶 液、0. 6mLIOmmol/L的硝酸银溶液与0. 64mL 0. 01mol/L的抗坏血酸溶液依次加入到 95mL0. 01mol/L的CTAB溶液中，接着向其中加入步骤1)制备的0. ImL金纳米种子溶液，混 勻，静置陈化后得到金纳米棒；所述陈化方法是指静置于25°C水浴中，时间为至少3h ；所述 离心去除过量CTAB的次数为2次，转速为8000转/分，时间为lOmin，所述浓缩为第二次离 心后将金纳米棒胶体溶液的体积缩小为原来的二十分之一。所述步骤3)抗体修饰的方法具体为将0. 2mL金纳米棒浓缩液加入到1. OmL浓度 为0. lmg/mL的抗体溶液中，混勻后静置30min，得到金纳米棒-抗体复合物。所述步骤4)中的无关蛋白溶液为wt牛血清白蛋白溶液；封闭是指用经8000 转/分离心15min纯化的wt牛血清白蛋白溶液对金纳米棒-抗体复合物洗涤3次，具 体方法为将1 % wt牛血清白蛋白溶液加入金纳米棒_抗体复合物中，静置15min后于4000 转/分离心分离，弃去上清，取下层物加水重悬，再用wt牛血清白蛋白溶液重复洗涤2 次，最后将得到的金纳米棒-抗体复合物浓缩，并重悬于PH7. 40. 01mol/L的Tris缓冲液 中，800转/分离心3min纯化，去除可能存在的聚集物，取上清重悬于Tris缓冲液中，得到 金纳米棒免疫探针液。本发明的另一个目的是提供一种与金纳米棒免疫探针上修饰抗体相应抗原的检 测方法。本发明的所提供的检测方法，是将上述金纳米棒免疫探针加入到待检测介质中， 孵育，再将介质与金纳米棒免疫探针离心分离，读取检测后金纳米棒免疫探针与空白对照 或阴性对照的纵向等离子吸收峰的偏移来对结果进行判读(计算差值△ λ (nm))，以进行 定性及定量分析。本发明的检测方法适用于缓冲液(水或PBS、TBS、Tris等)、血清、血浆、尿液、唾 液等临床样本常用多种介质的相应抗原检测。
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所述孵育温度优选为37°C，孵育时间优选为lh。所述计算出来的差值Δ λ (nm)若在士3nm以内，则认为是系统误差或实验噪音， 不判定为阳性结果。在水相介质(即水或缓冲溶液中)，可通过对前面步骤的标准化及多次平行实验 获得可靠性高的线性范围进行定量分析。本发明提供了一种适用于多种介质的金纳米棒免疫探针及其制备方法和应用。用 本发明方法制备的金纳米棒免疫探针由于其与抗体间静电相互作用(Zata电位表征结果 支持)的“全包围”式修饰方式及封闭剂的较完全封闭，会在金纳米棒的周围形成由蛋白构 成的柔性的外壳，使之对介质中的诸多种其它成分不敏感(减少金纳米棒对环境介质的敏 感性)，从而实现该免疫探针对相应抗原的高灵敏和高特异性检测，扩大这种免疫探针的应 用范围；这种免疫探针的特异性识别可在缓冲溶液、血清、血浆或尿液、唾液等多种介质中 进行，最终通过读取金纳米棒纵向等离子吸收峰的偏移进行定性及定量分析。用该免疫探 针进行相应抗原的检测具有操作简单、检测灵敏度高、特异性好、所需仪器设备少等优点， 而且，因为其特殊的修饰方式，使纳米复合物对外界介质具有良好的适应性，扩大了该免疫 探针的应用范围，有向临床推广的可能性。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。


图1为本发明制备出的规则金纳米棒的透射电镜照片；图2为本发明制备出的“金纳米棒_人IgG”免疫探针于Tris缓冲液中检测不同 浓度的抗人IgG谱峰偏移曲线；图3为本发明制备出的“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针于Tris缓冲液中检 测乙肝表面抗原标准物质的谱峰偏移量效关系曲线；图4为本发明制备出的“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针检测乙肝表面抗原 阴阳性血清的谱峰偏移，(a)为全图，(b)为波峰局部放大图；图5为本发明制备出的“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针在唾液和尿液介质 中的等离子吸收光谱图。
具体实施例方式本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体 的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。任何在相关领域具备经验的人，都 可以按照本专利的原理，利用其它类似抗原抗体或者反应条件实现本发明所描述的免疫探 针。这些并不脱离本发明描述的基本概念。因此，这些修改或不同的应用都在本发明的覆 盖范围之内。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、“金纳米棒-HIgG”免疫探针的制备与在Tris缓冲液中检测anti-HIgG一、“金纳米棒-HIgG”免疫探针的制备用本发明的方法制备“金纳米棒-HIgG”免疫探针，具体方法包括以下步骤(1)制备金纳米种子首先，将0. 25mL 0. Olmol/L的氯金酸溶液加入到7. 5mL0. lmol/L的CTAB溶液中，混勻后再将0. 6mL 0. 01mol/L新鲜制备、置于冰水浴中的硼氢化 钠溶液加入到上述的溶液中，来回倒置混勻2分钟，得到金纳米种子的亮棕黄色溶液。金纳 米种子静置于25°C水浴中，3h后使用。(2)金纳米棒的制备及浓缩将4mL 10mmol/L的氯金酸溶液、0. 6mL 10mmol/L的 硝酸银溶液与0. 64mL 0. 01mol/L的抗坏血酸溶液依次加入到95mL 0. 01mol/L的CTAB溶 液中，接着向其中加入0. ImL步骤(1)制备的金纳米种子溶液，混勻，静置于25°C水浴中，陈 化3h后使用。使用前8000转/分离心两次，每次IOmin以去除过量CTAB，并在第二次离心 后将金纳米棒胶体溶液的体积缩小为原来的二十分之一。金纳米棒的透射电镜照片如图1 所示。(3)抗体修饰将0. 2mL步骤⑵得到的金纳米棒浓缩液加入到1. OmL 0. lmg/mL 的HIgG水溶液中，混勻后静置30min，得到金纳米棒-抗体复合物。(4)封闭配置10% wt的牛血清白蛋白溶液并于8000转/分离心15min，取上清 液加入步骤⑶得到的金纳米棒-抗体复合物中，使牛血清白蛋白封闭剂的终浓度为 wt，静置15min后于4000转/分离心分离，弃去上清，取下层物加水重悬，再以1 % wt的牛 血清白蛋白溶液重复洗涤2次，最后将得到的金纳米棒_抗体复合物浓缩，并重悬于pH7. 4 0. 01mol/L的Tris缓冲液中，800转/分离心3min纯化，去除可能存在的聚集物，取上清重 悬于Tris缓冲液中，得到金纳米棒免疫探针液。二、用“金纳米棒-HIgG”免疫探针在Tris缓冲液中检测anti-HIgG(1)用pH7. 4 0. 01mol/L的Tris缓冲液配置系列浓度的anti-HIgG溶液。(2)将待测不同浓度的anti-HIgG溶液分别加入步骤一制备的金纳米棒免疫探针 液中，使检测体系中金纳米棒的纵向等离子吸收峰O.D.值约为1.0。37°C水浴中孵育Ih后 离心分离，去除未反应蛋白，再将下层物于Tris缓冲液中重悬。采用紫外-可见分光光度 计扫描每个样本的400-1000nm的表面等离子吸收光谱。观察金纳米棒纵向等离子吸收峰 位置与检测前金纳米棒免疫探针液的区别，计算其△ λ (nm)，进行定性或定量分析。若计算 出的样本的偏移量Δ λ (nm)在士3nm以内，可认为是系统误差或实验噪音，不判定为阳性 结果。典型检测谱图如图2所示，即可以在Tris缓冲液中检测到纳克级的anti-HIgG。实施例2、“金纳米棒-乙肝表面抗体”免疫探针的制备与在Tris缓冲液中的检测一、“金纳米棒-乙肝表面抗体”免疫探针的制备用本发明的方法制备“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针，具体方法包括以下步 骤(1)制备金纳米种子与实施例1相同。(2)金纳米棒的制备及浓缩与实施例1相同。(3)抗体修饰将0. 2mL金纳米棒浓缩液加入到1. OmL 0. lmg/mL的单克隆乙肝表 面抗体水溶液中，混勻后静置30min，得到金纳米棒-抗体复合物。(4)封闭与实施例1相同。二、用“金纳米棒-乙肝表面抗体”免疫探针在Tris缓冲液中检测乙肝表面抗原(1)以pH7. 4 0. 01mol/L的Tris缓冲液配置系列浓度的乙肝表面抗原(HBsAg)标 准物质的溶液，及250ng/mL或500ng/mL的牛血清白蛋白溶液。
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(2)将待测样本、空白样本(水)、控制样本((1)中所述的牛血清白蛋白溶液)分 别加入步骤一制备的“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针液中，使检测体系中金纳米棒的 纵向等离子吸收峰O.D.值约为0.5。每组设三个平行实验。37°C水浴中孵育Ih后离心分 离，去除未反应蛋白，再将下层物于Tris缓冲液中重悬。采用紫外-可见分光光度计扫描 每个样本的400-1000nm的表面等离子吸收光谱。观察金纳米棒纵向等离子吸收峰位置与 空白样本或控制样本的峰位置平均值的差值，计算其Δ λ (nm)，进行定性及定量分析。通 常，空白样本与控制样本的峰位置会较好地吻合，而这可以作为实验成功与否的重要判据。 若计算出的样本的偏移量Δ λ (nm)在士3nm以内，可认为是系统误差或实验噪音，不判定 为阳性结果。通过对前面步骤的标准化及多次平行实验获得了如图3所示的量效关系曲线。如 图所示，该免疫探针对HBsAg标准物质的检测下限为0.01IU/mL，即达到皮摩尔量级，相比 常规的酶联免疫方法检测灵敏度提高两个数量级。实施例3 “金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针的制备及对乙肝表面抗原阴、阳性 血清的判读一、“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针的制备用本发明的方法制备“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针，具体方法包括以下步 骤(1)制备金纳米种子与实施例1相同。(2)金纳米棒的制备及浓缩与实施例1相同。(3)抗体修饰与实施例2相同。(4)封闭与实施例1相同。二、用“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针对乙肝表面抗原阴、阳性血清的判读(1)从乙肝表面抗原检测试剂盒(购自英科新创(厦门)科技有限公司)中选取 阴、阳性对照血清作为样品。(2)将待测阴阳性血清样本、空白样本(水)及控制样本(实施例2步骤二(1)中 的牛血清白蛋白溶液)分别加入金纳米棒免疫探针液中，使检测体系中金纳米棒的纵向等 离子吸收峰O.D.值约为0.5。每组设三个平行实验。37°C水浴中孵育Ih后离心分离，去 除未反应物，再将下层物于Tris缓冲液中重悬。采用紫外_可见分光光度计扫描每个样本 的400-1000nm的表面等离子吸收光谱。观察金纳米棒纵向等离子吸收峰位置与空白样本 或控制样本的峰位置平均值的差值，计算其Δ λ (nm)，进行定性分析。通常，阴性血清、空白 样本及控制样本的峰位置平均值差在士3nm以内，而阳性血清的峰位置与它们的相差至少 为8nm以上。图4为归一化后的“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针检测乙肝表面抗原阴、阳 性血清的典型等离子吸收光谱图(a)及谱峰偏移位置的为局部放大图(b)，其中1为空白样 本，2为控制样本，3和4分别为阳性血清及阴性血清。实施例4 “金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针的制备及其在唾液、尿液介质中的 表面等离子吸收光谱性质一、“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针的制备用本发明的方法制备“金纳米棒_乙肝表面抗体”免疫探针，具体方法包括以下步骤(1)制备金纳米种子与实施例1相同。(2)金纳米棒的制备及浓缩与实施例1相同。
(3)抗体修饰与实施例2相同。(4)封闭与实施例1相同。二、“金纳米棒-乙肝表面抗体”免疫探针在唾液、尿液介质中的表面等离子吸收光 谱性质将步骤一中制备的金纳米棒免疫探针液分别分散于10%及40%唾液(saliva)或 尿液(urine)介质中，得到如附图5所示的表面等离子吸收光谱图。由图5可见，在上述的 两种介质中，金纳米棒免疫探针均能稳定存在，特别是其纵向等离子共振吸收峰位置不会 受到介质颜色、粘度等的影响。由此可以推断，用本发明方法制备的金纳米棒免疫探针可用 来在唾液、尿液等临床常用介质中检测相应抗原/抗体。
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权利要求
一种金纳米棒免疫探针，是经金纳米种子的制备、金纳米棒的制备及浓缩、抗体修饰及封闭后得到的产品。
2.一种金纳米棒免疫探针的制备方法，包括以下步骤1)制备金纳米种子在表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)的存在下，通过化学 还原法把氯金酸溶液中的正三价金还原为金纳米种子；2)金纳米棒的制备及浓缩将步骤1)制备的金纳米种子加入到金纳米棒的生长溶液 中制备金纳米棒，离心去除过量的CTAB，并将金纳米棒浓缩；3)抗体修饰将浓缩后的金纳米棒加入到抗体溶液中，使金纳米棒与抗体之间通过静 电相互作用反应，得到与抗体偶联的金纳米棒-抗体复合物；4)封闭用无关蛋白溶液作为封闭剂对金纳米棒-抗体复合物洗涤，再经离心分离、浓 缩、纯化，得到能特异性识别相应抗原的金纳米棒免疫探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)金纳米种子的制备方法 具体为首先，将0. 25mL 0. 01mol/L的氯金酸溶液加入到7. 5mL 0. Imo 1/L的CTAB溶液中， 混勻后再将0. 6mL 0. 01mol/L新鲜制备、置于冰水浴中的硼氢化钠溶液加入到上述的溶液 中，来回倒置混勻2分钟，得到金纳米种子的亮棕黄色溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)制备的金纳米种子应静 置于25°C水浴中，制备后2 5h可使用。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)金纳米棒生长的方法具 体为将4mL IOmmo 1/L的氯金酸溶液、0. 6mL IOmmo 1/L的硝酸银溶液与0. 64mL0. 01mol/L 的抗坏血酸溶液依次加入到95mL O.Olmol/L的CTAB溶液中，接着向其中加入步骤1)制备 的0. ImL金纳米种子溶液，混勻，静置陈化后得到金纳米棒；所述陈化方法是指静置于25°C 水浴中，时间为至少3h ；所述离心去除过量CTAB的次数为2次，转速为8000转/分，时间 为lOmin，所述浓缩为第二次离心后将金纳米棒胶体溶液的体积缩小为原来的二十分之一。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)抗体修饰的方法具体 为将0. 2mL金纳米棒浓缩液加入到1. OmL浓度的0. lmg/mL的抗体溶液中，混勻后静置 30min，得到金纳米棒-抗体复合物。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)中的无关蛋白溶液为 1% wt牛血清白蛋白溶液；封闭是指用经8000转/分离心15min纯化的1 % wt牛血清白 蛋白溶液对金纳米棒_抗体复合物洗涤3次，具体方法为将wt牛血清白蛋白溶液加 入金纳米棒_抗体复合物中，静置15min后于4000转/分离心分离，弃去上清，取下层物加 水重悬，再用1 % wt牛血清白蛋白溶液重复洗涤2次，最后将得到的金纳米棒_抗体复合物 浓缩，并重悬于PH7. 4 0. 01mol/L的Tris缓冲液中，800转/分离心3min纯化，去除可能存 在的聚集物，取上清重悬于Tris缓冲液中，得到金纳米棒免疫探针液。
8.一种与金纳米棒免疫探针上修饰抗体相应抗原的检测方法，是将权利要求1所述的 金纳米棒免疫探针加入到待检测介质中，孵育，再将介质与金纳米棒免疫探针离心分离，读 取检测后金纳米棒免疫探针与空白对照或阴性对照的纵向等离子吸收峰的偏移来对结果 进行判读(计算差值△ λ (nm))，以进行定性及定量分析。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于所述检测方法适用于缓冲液(水或 PBS、TBS、Tri s)、血清、血浆、尿液、唾液介质的相应抗原检测。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于所述孵育温度为37°C，孵育时间为lh。
11.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于所述计算出来的差值△λ (nm)若 在士3nm以内，则认为是系统误差或实验噪音，不判定为阳性结果。
12.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于在水相介质，可通过对前面步骤的 标准化及多次平行实验获得可靠性高的线性范围进行定量分析。
全文摘要
本发明公开了一种适用于多种介质的金纳米棒免疫探针及其制备方法与应用。该金纳米棒免疫探针是经金纳米种子的制备、金纳米棒的生长及浓缩、抗体修饰、封闭后得到的产品。这种免疫探针的特异性识别可在缓冲溶液、血清、血浆或尿液、唾液等多种介质中进行，最终通过读取金纳米棒纵向等离子吸收峰的偏移进行定性及定量分析。用该免疫探针进行相应抗原的检测具有操作简单、检测灵敏度高、特异性好、所需仪器设备少等优点，而且，因为其特殊的修饰方式，使纳米复合物对外界介质具有良好的适应性，扩大了该免疫探针的应用范围，有向临床推广的可能性。
文档编号G01N33/53GK101923088SQ20101022571
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月5日 优先权日2010年7月5日
发明者李媛, 王小慧, 詹林盛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所