专利名称：一种相思子毒素的胶体金检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物检测领域，具体涉及相思子毒素的检测试纸和在检测相思子
毒素中的应用。
背景技术：
相思子毒素是从豆科藤本植物相思子(Abrusprecatorius)的种子中提取的一种 剧毒性高分子蛋白毒素，其含量约占种子2.8% 3.0%。相思子毒素存在4种同族毒素 (isoabrins)，艮卩abrin—a、abrin—b、abrin—c、禾口 abrin—d，相X寸分子质量介于63kDa 67kDa 之间，它们由不同的基因所编码，但同属于一个多基因家族；其中abrin-b、abrin-c由于其 B链凝集活性低而只有较弱的细胞毒性作用；而abrin-a、abrin-d则有极强的细胞毒性，小 鼠的LD50为0. 04 ii g/kg，成年人摄入的致死剂量为5. 0 ii g/kg 7. 0 y g/kg，其毒性强度 是蓖麻毒素(小鼠LD503. 0 ii g/kg)的70多倍，已被列为潜在的重要毒素战剂和生物恐怖 病原物质之一。 针对相思子毒素中毒，目前国内外还没有适用于人的解毒药和特异抗毒素 等专用特效药。针对这一现状，对相思子类毒素等生物战剂医学防护领域的研究，重 点应集中在侦检、治疗和疫苗预防等方面。目前免疫技术是检测相思子毒素中毒的 最常用技术手段，主要有放射性免疫法(Radioimmunoassay, RIA)和酶联免疫吸附法 (Enzyme-linkedimm皿osorbent assay, EUSA)。 RIA技术主要是通过使用放射性元素1251对毒素进行标记，实现对蓖麻毒素中毒 的检测和监控。这一方法非常适宜应用于对中毒患者血液中蓖麻毒素的含量检查以及法 医学鉴定，最低检测线可达50 100pg/ml。其缺点是放射性元素的处理比较麻烦，且耗时 较长。ELISA技术现已被广泛的应用于生物样本中蓖麻毒素的检测，最低检测线可以达到 100pg/ml。基于免疫技术的生物传感器也被应用于检测毒素和生物战剂，利用毒素不同的 响应元件作为传感器的敏感组件，可以同时测定多种毒素毒剂，小巧轻便，适于野外及现场 的使用。 上述方法虽然灵敏度高，但对于样品的检测有很大的局限性首先，剧毒毒素的抗 体获得比较困难，放射性免疫测定还要求至少知道分析物的部分一级结构；另外，ELISA法 孵育时间长，不适合作为现场检测。上述方法已经满足不了当代防恐需要，迫切需要可以现 场、快速、定量检测相思子毒素的方法。

实用新型内容本实用新型的目的是提供一种方便、快捷地检测相思子毒素的试纸。该试纸的工 作原理是利用特异性抗原_抗体的结合，用胶体金标记抗体，与待检抗原结合后，使与试纸 上结合的捕获抗体显色。 本实用新型能够基于一份标本和一个试纸，快速方便地检测出标本中的相思子毒 素，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷。[0008] 本实用新型涉及一种方便、快捷地检测相思子毒素的检测试纸，它包含(i)反应支持物； (2)吸水垫； (3)硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体检测条带和质 控羊抗鼠IgG的质控条带；所述的羊抗鼠IgG可购自鼎国生物技术有限公司，另外，金标抗 体保护膜标记的是鼠抗的重组抗体，所以质控用的是羊抗鼠IgG。 本实验采用高纯度的重组相思子A链抗原蛋白，免疫兔制备大量多克隆抗体，获 得高纯度高特异性的抗体。在抗体纯化方面，除采用辛酸_硫酸铵分级沉淀方法获得抗体 外；还利用抗体与蛋白A的高亲和作用，采用重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF亲和层析纯化抗体。 (4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗 体。 本实验采用高纯度的重组相思子A链抗原蛋白，以重组相思子A链作为抗原免疫 KM小鼠，然后腹腔注射S180细胞，剌激KM小鼠产生腹水，腹水量大，抗体效价高，获得高纯 度高特异性的抗体。在抗体纯化方面，除采用辛酸-硫酸铵分级沉淀方法获得抗体外；还利 用抗体与蛋白A的高亲和作用，采用重组蛋白A琼脂糖凝胶6B FF亲和层析纯化抗体。 本实用新型涉及的上述相思子毒素的检测试纸，它还包含样品垫，该样品垫的材 料选自聚酯膜、玻璃纤维或滤纸纤维。 本实用新型涉及的上述相思子毒素的检测试纸，其中反应支持物选用PVC板。 本实用新型涉及的上述相思子毒素的检测试纸，其中吸水垫选用滤纸。 本实用新型涉及的上述相思子毒素的检测试纸，其中金标抗体保护膜选用聚酯
膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上均匀涂布有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体。 另一方面，本实用新型涉及的上述相思子毒素的检测试纸，其中吸水垫、硝酸纤维 膜、金标抗体保护膜、样品垫和反应支持物按照附图1所示方式构成；反应支持物5位于底 层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5上的中部，该膜的T处是兔抗重组相思子毒素A链多克 隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗鼠IgG包被的质控条带；金标抗体保护膜3位于硝 酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多 克隆抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于金标抗体保护膜3而言的另一侧并与 硝酸纤维膜2部分重叠。样品垫4位于硝酸纤维膜2上与吸水垫1相反的一侧并与金标抗 体保护膜3部分重叠。 又一方面，本实用新型涉及的上述相思子毒素的检测试纸，以吸水垫一侧为起始 端，样品垫一侧为末端，兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体的检测条带位于接近末端，羊 抗鼠IgG包被的质控条带接近于起始端。 本实用新型检测相思子毒素的试纸的制备方法，该方法包括以下步骤胶体金探 针的制备，金标垫的制备，硝酸纤维膜的喷涂包被。1、胶体金探针的制备 (1)将HAuCl4先配制为0. 01 %水溶液，磁力搅拌下准确加入lml 1 %的HAuCl4，同 时加入1. 5-3mll^的柠檬酸三钠水溶液，颜色稳定后继续加热，冷却至室温后加纯水补足 至100ml，4t:避光保存；[0023] (2)用K2C03调PH值为约7-9，优选为约7. 8-8. 9，更优选约8. 2-8. 5 ; (3)将胶体金调至pH 8. 2-8. 5，用5mM PB(pH 7. 2)稀释抗体至0. 2mg/ml ; (4)保持胶体金稳定。 本实用新型还披露一种获得维持胶体金稳定的抗体最佳标记剂量的方法，该方法 包括 a.取10只洁净的1. 5ml离心管，分别加入胶体金溶液1ml ; b.在1-10号管内分别力Q入lOii l、20ii l、30ii l、40ii l、50ii l、60ii l、70ii 1、
80iil、90iil、100ii1的5mM PB，再依次加入稀释好的0. 2mg/ml的待标记抗体90iU、
80 ii l、70ii l、60ii l、50ii l、40ii l、30ii l、20ii 1、10ii 1、0ii l，混匀，放置2分钟； c.在10个管内分别加入10% NaCl溶液100 iU，混匀后室温静置2小时，观察颜
色变化。 未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红变蓝的变化， 而加入抗体量达到或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。与对照管(l号管)相比， 颜色最接近、含抗体剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为lml胶体金所必须的抗体稳定 剂量，在此基础上再加20%单抗，即为抗体最佳标记剂量。本实用新型经过反复试验和分 析，得出的结果表明维持胶体金溶液适宜抗体量为8-15ug，优选抗体量10-12ug，更优选 10. 5-12. Oug，最优选为12ug。 2、金标垫的制备 取上述pH的胶体金以lml/管分装于1.5ml的离心管中。每支管中加入8-15ug 标记剂量，优选抗体量10-12ug，更优选10. 5-11. 5ug，最优选为llug的抗体，轻摇混匀后放 置。每管中加入10X的BSA100ia，混匀放置。将上面初步制得的胶体金探针在12000rpm、 4t:下离心30分钟，弃上清液。每支离心管中加入lml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃上 清液，管底得到暗红色的疏松状沉淀，加入500 ii 1重悬液重悬后于4°C ， 1000rpm，离心10分 钟；取上清液，均匀滴在lcm宽的玻璃纤维上，37t:干燥。 3、硝酸纤维膜的喷涂包被 (1)利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被兔抗重组相思子毒素抗体和 质控羊抗鼠IgG两个条带的硝酸纤维膜； 在该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度优选是10-100mm/s，更优选是45-55mm/s，最 优选是50mm/s ;所述兔抗St多克隆抗体，其加入量为l_5mg/ml，该多克隆抗体的稀释液 可以为PBS ;质控兔抗羊IgG可以购自鼎国生物技术公司，其浓度为0. l-5mg/ml更优选是 0. 5-2. 5mg/ml，最优选为lmg/ml ; (2)制备含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体的金标抗体保护
膜，具体为将胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗均匀涂布在玻璃纤维膜上
来制备，其中，抗体用PB稀释，pH为7-9，优选7. 5-9，最适ffl值为8. 5。 本实用新型所述试纸在检测相思子毒素中的应用，参见附图2。 利用本实用新型试纸检测相思子毒素的方法中，先将待测标本放入装有稀释液的
小瓶内，再用移液器将样品混合液加入试纸"4"处(即末端)，样品中的液体依靠虹吸作用
上行，一般需10-15分钟判读结果 如标本中含有相思子毒素，则它将与试纸上胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体形成相应的复合物，液体展开上行并与硝酸纤维膜上的兔抗重组相思子毒素 A链多克隆抗体结合，形成红色线条，即在"T"处形成红色条带。 无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记多克隆抗体继续随液体继续上行并与该 膜上的羊抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失 效，此线就不会出现，说明试纸失效。 阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线，如不出现线条说 明试纸失效。可利用金标免疫分析仪进行半定量检测。 本实用新型的技术方案是采用纯化的兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体、和 羊抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上，结合胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多克隆 抗体，应用膜层析双抗体夹心法的原理检测标本中的相思子毒素。

图1A本实用新型试纸的正面示意图。 图1B本实用新型试纸的侧面示意图。
其中，图1A和IB :1 :吸水垫；2 :硝酸纤维膜(T :包被兔抗重组相思子毒素A链多 克隆抗体检测条带；C :包被羊抗鼠IgG的质控条带)；3 :金标抗体保护膜含有胶体金标记 鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体的玻璃纤维膜；4 :样品垫；5 :反应支持物。
图2 :检测结果示意图；T、 C两条线阳性；C 一条线阴性；无效。
具体实施方式
以下实施例用于说明本实用新型，但不用来限制本实用新型的范围。实施例1、相
思子毒素检测的胶体金试纸的制备 1、胶体金探针的制备 (1)将HAuCl4先配制成0. 01 %水溶液，取100ml纯水加热至沸腾。磁力搅拌下准 确加入1ml 1%的HAuCl4，同时加入1. 5ml质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液。颜色稳定 后继续加热煮沸15分钟，冷却至室温后加纯水补足至100ml，4t:避光保存。 (2) K2C03调PH值为8. 2-8. 5左右。 (3)将胶体金调至适宜的pH，优选8. 0-8. 5，更优选8. 2，用5mMPB (pH 7. 2)稀释抗
体至0. 2mg/ml 。 2、金标垫的制备 取pH 8. 2的胶体金以1ml/管的量分装于1. 5ml的离心管中。每支管中加入最佳 标记剂量的抗体，轻摇混匀后放置5分钟或稍长，此步为抗体与金颗粒结合。每管中加入 10%的BSAlOOiU，混匀放置10分钟或稍长，此步为封闭。将上面初步制得的胶体金探针 以12000rpm，离心30分钟，4。C，弃上清。每支离心管中加入1ml重悬液悬浮沉淀后同上离 心。弃上清，留下管底暗红色疏松状沉淀，加入500 ii 1重悬液重悬后于4°C ， lOOOrpm，离心 10分钟；取上清液，均匀的滴加在1cm宽的玻璃纤维上，37。干燥2. 5-3小时。 3、硝酸纤维膜的喷涂包被 (1)利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被兔抗重组相思子毒素A链多克 隆抗体(lmg/ml含有1. 5% BSA)和质控羊抗鼠IgG(购自鼎国生物技术公司，lmg/ml)两个 条带的硝酸纤维膜；[0057] (2)含有胶体金标记鼠抗重组相思子毒素A链多克隆抗体12ug的玻璃纤维膜，PB
稀释；最适ra值为8.5。 实施例2、相思子毒素检测试纸 参见图l，反应支持物为6. 2cmX0. 4cm PCV板；吸水垫为2cmX0. 4cm的滤油纸；
1. 8cmX0. 4cm的硝酸纤维膜依次包被羊抗鼠IgG (购自鼎国生物技术公司，lmg/ml)，兔 抗重组相思子毒素A链多克隆抗体；含有0. 4cmX0. 4cm胶体金标记的鼠抗重组相思子毒
素A链多克隆抗体(标金浓度12ug PB稀释；最适ra值为8.2)玻璃纤维膜；样品垫为
2. 7cmX0. 4cm的玻璃纤维；即形成了相思子毒素检测试纸。 实施例3、检测方法 参见附图2，将待测标本与样品稀释液混匀，再用移液器将样品混合液加入试纸样 品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果 如含有相思子毒素，则与试纸上胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链多抗形成 相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的流兔抗重组相思子毒素A链多抗结合，形成 红色线条，即在"T"处形成红色条带。 无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记多抗继续向上爬行与包被在膜上的羊抗 鼠IgG形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就 不会出现，说明试纸失效。 阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线，如不出现线条说 明试纸失效。 实施例4、采用DJM-3定量金标免疫分析仪半定量检测 1、可先用检测法检测相思子毒素试纸条20个阴性值，利用金标仪检测试其T/C的 比值平均计算出相思子毒素试纸条的定阈值。 2、其次利用定阈值来用金标仪机器检测相思子毒素试纸条能达到的最低浓度。 3、判读结果时大于或等于定阈值为阳性，小于定阈值为阴性。 检测相思子毒素标准品各个浓度下，判定值(CUT-OFF)为0. 043的T/C读值(表 1)。每个浓度检测两次取平均值。可见15ng/ml、7. 5ng/ml结果为阴性；30ng/ml 6000ng/ ml结果为阳性；检测灵敏度为30ng/ml。 表1相思子毒素胶体金试纸条各浓度半定量检测结果序号检测值T (V)质控值C (V)T/C结果
T2c2T/dT/C2T/C平判读
00.00400.5310.514000—
7.5ng/mlO扁0.0120.4760.430-0.03-0.03-0.03
15ng/ml0.0140.0140.5540.380-0.02-0.03-0.03—
30ng/ml0.0250.0260.5230.5220.040.050.05+
60ng/ml0.0460.0490.4790.5160.090.090.09+
120ng/mlO扁0.0850.5500.5510. 160. 140. 15+
300ng/ml0.1630.1640.6150.5710.260.280.27+
600ng/ml0.3250.2840.5970.5230. 540. 540. 54+
1200ng/m0.3320.3270.6060.5840. 540. 560. 55+
6000ng/ml0.3350.3570.5610.5880. 590. 600. 60+ 本实用新型所述的试纸可以配合小型仪器可进行半定量检测，不需专业培训，结 果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的现场检 测，适合流行病学调查，并对相思子毒素的感染诊断起到辅助作用。
权利要求一种检测试纸，其特征在于，它包含(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗重组相思子毒素A链多克隆抗体和羊抗鼠I gG包被的质控抗体的检测条带质控条带；(4)金标抗体保护膜，该膜中含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链抗体；(5)样品垫；所述反应支持物位于底层，所述硝酸纤维膜位于反应支持物上的中部，金标抗体保护膜位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，所述吸水垫位于硝酸纤维膜上部的相对于金标抗体保护膜而言的另一侧并与部分重叠；所述样品垫位于硝酸纤维膜上与吸水垫相反的一侧并与金标抗体保护膜部分重叠。
2. 根据权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述样品垫的材料选自聚酯膜、玻璃纤维 或滤纸纤维。
3. 根据权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述硝酸纤维膜的T处是兔抗重组相思子 毒素A链多克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗鼠IgG包被的质控条带。
4. 根据权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述吸水垫一侧为起始端，所述样品垫一 侧为末端，所述检测抗体的条带位于接近末端，所述质控条带接近于起始端。
专利摘要本实用新型公开了一种检测试纸，该试纸包含(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗重组相思子毒素A链抗体和质控抗体的检测条带质控条带；(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的鼠抗重组相思子毒素A链抗体。本实用新型试纸可以配合小型仪器可进行半定量检测，不需专业培训，结果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的现场检测，适合流行病学调查，并对相思子毒素的感染诊断起到辅助作用。
文档编号G01N33/552GK201548545SQ200920108449
公开日2010年8月11日 申请日期2009年6月5日 优先权日2009年6月5日
发明者孙肖红, 张晓龙, 杨宇, 王景林, 王静, 聂聪, 胡孔新, 高姗 申请人:中国检验检疫科学研究院