专利名称：用于快速检测杀虫剂对烟粉虱毒力的试剂盒及药膜玻璃管的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及杀虫剂毒力检测技术，特别是一种用于快速检测杀虫剂对烟粉虱毒力的试剂盒及药膜玻璃管。
背景技术：
烟粉虱Bemisia tabaci属于半翅目、粉虱科，小粉虱属。1889年发现于的希腊烟草上，命名为烟粉虱 Aleyrodes tabaci (Gennadius) (Gennadius, 1889)。1894 年，又发现于美国佛罗里达州的甘薯上，鉴定为甘薯粉虱(Bemisia inconspicua)。目前，烟粉虱已经广泛分布于除南极洲以外的100多个国家和地区，包括热带，亚热带及相邻温带地区。在中国，目前调查发现分布于如广东、广西、海南、福建、云南、上海、浙江、江西、湖北、四川、陕西、北京、台湾、新疆、河北、山东等20多个省份和地区。烟粉虱是一种在农业、园艺及观赏作物上造成严重危害的世界性经济害虫(陈文雄和张焕英，1997 ；罗志义等，1989 ；Castle et al.，2002 ；Bacci et al.，2007Ahmad，2007 ； Dinsdale et al.，2010)，蔬菜作物上主要为害黄瓜、番茄、茄子、豇豆、菜用大豆、芥蓝和花椰菜等。该虫具有寄主范围广、繁殖力强、世代重叠现象严重的特点，它以成虫和若虫在叶背刺吸为害寄主植物，可造成减产50%以上；烟粉虱产生的蜜露也是煤污病产生的重要原因；最重要的是，烟粉虱还是多种植物病毒病的的传毒媒介，目前已确认有100多种植物病毒由烟粉虱传播。尤其是近些年在中国由南至北在生产上凸显出来的、并在局部地区造成番茄棚绝收的番茄黄化曲叶病毒病(TYLCD)即由烟粉虱传播所致。目前生产上防治烟粉虱主要依靠化学农药进行，然而烟粉虱成虫具有一定的飞翔能力，逃避药剂喷施的能力较强，属于生产上最难以防治的害虫之一。随着杀虫剂的使用， 烟粉虱对越来越多的不同种类的杀虫剂逐渐产生了抗药性，甚至由于某种单一杀虫剂的选择压力，使得烟粉虱的生物型也在发生演替，局部地区已由B型转变为Q型，由于Q型烟粉虱对杀虫剂的耐药性更强、生物学特性更强等，因此生产上防治该虫的挑战性更大。联苯菊酯是一种高效合成除虫菊酯类杀虫、杀螨剂，具有触杀、胃毒作用，无内吸、 熏蒸作用，杀虫谱广，对螨也有较好防效，毒杀作用迅速。在土壤中不移动，对环境较为安全，残效期长，适用于包括茄子、白菜、花椰菜、莴苣等在内的多种作物上各种鳞翅目幼虫、 粉虱类、蚜虫类、植食性叶螨的防治。该化学药剂从20世纪80年代开始进入市场，至今仍然在生产上发挥着其防治作用。根据对不同地区烟粉虱的抗药性检测结果，目前很多地区烟粉虱对联苯菊酯的抗药性较高，敏感度不高，因此防治效果与之前相比随之显著下降。传统的害虫对杀虫剂敏感度的检测方法是通过室内毒力测定实现的，而不同害虫的室内毒力测定随着害虫种类的不同而存在差异。烟粉虱对联苯菊酯等菊酯类杀虫剂的敏感度检测主要是采用琼脂浸叶法(Feng YT等，2010)进行。然而，这种测定方法需要耗费 2-3天的时间，尚能检测到其药剂的毒力程度。另外，这种方法需要一定的试验耗材(例如指形管、无虫苗、打孔器等)才能进行，其中无虫苗的饲养更需要花费大量的人力和财力； 另外，滤纸药膜法的操作相对简便，耗时较短，但是由于烟粉虱成虫具有飞翔能力，且个体微小，极易夹在滤纸药膜和承载体之间造成不同程度的损伤，尤其是对翅膀造成损伤时直接影响到了试验结果的检查和记录，造成很大的试验误差。因此，建立并优化一种新的杀虫剂快速检测方法对于短时间内评价杀虫剂对害虫的毒力、从而有针对性的选药施药具有重要的指导意义。

实用新型内容本实用新型根据上述领域的需要，提供一种检测杀虫剂对烟粉虱毒力的试剂盒及药膜玻璃管，具有误差小，效率高，稳定性强等优点，专门设计用于测定杀虫剂对烟粉虱成虫的毒力活性。检测杀虫剂对烟粉虱毒力的试剂盒，其特征在于，包括内壁上附着有以待测杀虫剂为主要成分的药膜的一端开口的玻璃管，所述药膜附着在玻璃管的管底至玻璃管高度的三分之一至二分之一处的内壁上。所述药膜附着在玻璃管管底至玻璃管高度的三分之一处的内壁上。所述试剂盒包括5 7组内壁上附着有杀虫剂药膜的一端开口的玻璃管，各组玻璃管之间的药膜中杀虫剂的有效含量呈梯度。所述玻璃管为指形管。所述杀虫剂指联苯菊酯。检测杀虫剂对烟粉虱毒力的药膜玻璃管，其特征在于所述药膜附着在玻璃管的管底至玻璃管高度的三分之一至二分之一处的内壁上。本实用新型在传统玻管药膜法和滤纸药膜法的基础上，结合烟粉虱成虫善于飞翔的生物学特点，提供一种专用于烟粉虱成虫的杀虫剂毒力检测试剂盒，包括至少一只其内壁上附着有以待测杀虫剂为主要成分的药膜的一端开口的玻璃管。本实用新型主要的改进之处在于，药膜并非完全覆盖玻璃管的内壁，而只是覆盖玻璃管底部至以上的三分之一至一半的高度，可一定程度上减少所用药剂，从而减少农药的污染和残留；使用中，将烟粉虱成虫接入管内时，需要用棉塞堵住一段开口处，棉塞塞至药膜上沿，使得烟粉虱成虫既可以自由活动，且其活动范围处于药物环境中；这样的设计，可以适度提高杀虫药剂的浓度，在短短3个小时或者更长时间(根据杀虫剂特性不同)之内快速检测出所测试杀虫剂对烟粉虱成虫的毒力高低；采用这种方法在测定敏感烟粉虱种群的基础上，可以快速测定出不同地区田间烟粉虱种群对杀虫剂的抗药性程度及其高低，为田间采用化学药剂防治该害虫时提供及时、快速的选药用药。本实用新型的试剂盒，用于检测一种杀虫剂对烟粉虱的毒力活性，需要较大范围的杀虫剂剂量范围，本领域技术人员可以在试剂盒中设置若干组药膜玻璃管，各药膜玻璃管之间的杀虫剂剂量呈梯度变化，以便于准确找出一种杀虫剂对于烟粉虱不同种群的致死剂量。从节约成本和检测效率上考虑，本实用新型优选设置5 7组药膜玻璃管。每组可以设置一个或多个。本实用新型中所用的玻璃管优选常用的指形管。本实用新型的优选实施里中，杀虫剂指联苯菊酯，之前发现部分地区烟粉虱对联苯菊酯的抗药性较高，敏感度不高，传统的用药剂量的防治效果与之前相比随之显著下降。 检测联苯菊酯对不同地区的烟粉虱的毒力，对于有效使用该药剂对烟粉虱进行有效的防治具有非常实用的意义。综上所述，本实用新型的试剂盒可作为快速定性地检测害虫对药剂的敏感性，建立的对联苯菊酯敏感性的诊断剂量LC6tlGO. 6644mg/L)可以快速评价不同地区烟粉虱对杀虫剂(联苯菊酯)的抗药性的实用手段。该试剂盒可快速建立起害虫对更多药剂的诊断剂量，以便在害虫大发生时生产上进行化学药剂防治时指导快速地选药施药。

图1.本实用新型试剂盒中药膜玻璃管示意图，其中1-玻璃管，2-药膜，3-药膜上沿。图2.不同温度和保存时间下玻璃管药膜的稳定性检验。
具体实施方式
实施例1.试剂盒的制备及使用方法1.供试昆虫及饲养烟粉虱于2004年10采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所北圃场甘蓝菜地，经 mtCOI (mitochondrial cytochrome oxidase I gene)分子标记鉴定为 B 型烟粉虱，命名为 SS种群。在无虫‘京丰一号，甘蓝(Brassica oleracea L.，cv Jingfeng 1)苗上饲养至
水1。联苯菊酯抗性烟粉虱种群的生物型也为B型，命名为LB-RR种群，室内经过琼脂浸叶法生物测定，发现其相对于SS种群的抗性倍数约为13. 9983倍。室内以无虫甘蓝苗继代饲养并喷施相应杀虫剂进行抗性汰选。2.杀虫剂95. 6%联苯菊酯原药，由江苏常隆化工有限公司生产。3.传统的琼脂浸叶法生物测定在指形管底部铺上1. 8% 2%的琼脂约2mL，待琼脂凝固后，用吸水纸拭干管壁水汽。采未施药的平整甘蓝叶片，避开粗大叶脉用打孔器打出直径22mm叶圆片。设置5_7 个药剂处理浓度及1组空白对照，每浓度设置4次重复，稀释用水配成含0. 125%。曲拉通 X-100的蒸馏水溶液。配好药液后每叶圆片浸液10秒，晾干后正面朝琼脂平贴于管底。管口朝下，轻拍停有粉虱的叶片让粉虱自由飞入，每管20 35头，用棉塞塞入2/3管长，保持与叶片距离不低于15mm。琼脂朝上使指形管倒置于光照培养箱，设置温度25°C，光周期 14h 8h(L D)，4 后检查各管死亡虫数。各浓度总数和死亡数数据采用武汉市蔬菜科学研究开发的PBT数据处理系统分析各杀虫剂浓度处理一定时间内粉虱的死亡比例，得出药剂对应的LC5(I、LC9tl、回归方程、95%置信限、标准差、卡平方值及相关系数等。4.本实用新型玻璃管药膜生物测定法称取计算质量的95. 6%联苯菊酯原药用丙酮溶解并二倍梯度稀释成6个不同浓度的药液，同时设置丙酮空白对照，每个处理设置4次重复，一共观只药膜玻璃管(如图 1)。用移液枪吸取500 μ L药液注入管底，小心倾斜转动指形管，药液随着丙酮的挥发而固着在玻璃管1的内壁上，使之在管底往上约1/3管长范围内形成药膜2，玻璃管药膜部分每 m2的药量约为9. 3%ig。待玻璃管内部药膜放置至完全干透后(大于2h)进行接虫。轻拍植株把烟粉虱成虫赶入管内，棉塞推入到药膜2上沿3。处理后把指形管(玻璃管1)倒置放置在25士 1°C的培养箱内，池后(根据杀虫剂作用特性的不同，可适当延长观察时间)检
查结果。此项试验显示联苯菊酯的快速击倒作用可使烟粉虱表现翻身、拍翅、滚动且无法正常飞翔等症状。由于快速检测仅池后(或者更长时间)即检查结果，药膜作用来不及将击倒的粉虱彻底杀死，故检查时所用判定标准为烟粉虱存在运动障碍(包括彻底死亡和存在不能爬行、不能飞动等运动障碍)。对室内b型敏感种群( 采用上述步骤进行生测，选取连续三次lc5tl最为接近的生测进行综合，再用ftx)bit软件进行处理，选择lc5(i、lc6(i、lc8(i所对应的浓度作为诊断剂量的备选浓度。如表1所示。表1联苯菊酯对烟粉虱诊断剂量的初筛浓度及其各自的校正死亡率
初步建立的诊断剂校正死亡率(％)
旦诊断剂量的浓度(mg/L)
量LCm22. 754341. 59
LC6040.664460. 70
LC80156. 571678.69由表1可知LC6tl的校正死亡率最与预计的60%死亡率相符，指示性最稳定，此外，LC80对应的浓度较高，夏季炎热季节使用玻璃管药膜法，药膜容易吸湿变潮，从而粘住烟粉虱成虫的翅膀，为实际操作带来不便，且为试验带来不可避免的误差。故最后确定以 LC60 (40. 6644mg/L)作为诊断剂量。实施例2.杀虫剂对烟粉虱毒力的诊断剂量确定及其验证1诊断剂量的确定采用实施例1的试剂盒及其使用和统计方法，以室内敏感烟粉虱种群为试虫，进行烟粉虱成虫对不同药剂的敏感度检测，分别连续进行3-4次试验，待结果稳定后，取实验结果最为一致的三次数据进行合并，计算其LC5。、LC60, LC70, LC80等不同的剂量。对上述计算的不同浓度条件下，对敏感烟粉虱ss种群进行上述各剂量的验证，试验重复3-4次，计算其校正死亡率。选取结果最稳定的剂量作为诊断剂量。为了对LC6tl的诊断可靠性进行验证，采用药膜法处理三组不同试虫第一组，完全室内B型联苯菊酯抗性品种(LB-RR)；第二组，完全室内B型联苯菊酯敏感品种(SQ ；第三组，R品系与S品系以1 1的比例混合，同时各处理组设置对照。结合各组处理对照的结果，分析三个处理组的死亡率，结果如表2。表2 LC60的稳定性检验
权利要求1.检测杀虫剂对烟粉虱毒力的试剂盒，其特征在于，包括至少一只其内壁上附着有以待测杀虫剂为主要成分的药膜的一端开口的玻璃管，所述药膜附着在玻璃管的管底至玻璃管高度的三分之一至二分之一处的内壁上。
2.根据权利要求1所述的检测杀虫剂对烟粉虱毒力的试剂盒，其特征在于所述药膜附着在玻璃管管底至玻璃管高度的三分之一处的内壁上。
3.根据权利要求1所述的检测杀虫剂对烟粉虱毒力的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括5 7组内壁上附着有杀虫剂药膜的一端开口的玻璃管，各组玻璃管之间的药膜中杀虫剂的有效含量呈梯度。
4.根据权利要求1所述的检测杀虫剂对烟粉虱毒力的试剂盒，其特征在于所述玻璃管为指形管。
5.根据权利要求1 4任一所述的检测杀虫剂对烟粉虱毒力的试剂盒，其特征在于 所述杀虫剂指联苯菊酯。
6.检测杀虫剂对烟粉虱毒力的药膜玻璃管，其特征在于所述药膜附着在玻璃管的管底至玻璃管高度的三分之一至二分之一处的内壁上。
专利摘要本实用新型“用于快速检测杀虫剂对烟粉虱毒力的试剂盒及药膜玻璃管”，属于杀虫剂毒力检测技术，所述试剂盒其特征在于包括至少一只其内壁上附着有以待测杀虫剂为主要成分的药膜的一端开口的玻璃管，所述药膜附着在玻璃管的管底至玻璃管高度的三分之一至二分之一处的内壁上。具有误差小，效率高，稳定性强等优点，专门设计用于快速测定杀虫剂对烟粉虱成虫的毒力活性。
文档编号G01N33/50GK202166640SQ20112022022
公开日2012年3月14日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者张友军, 徐宝云, 王少丽, 胡小超, 铁敏媛 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所