专利名称：一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，属于临床检验、药物分析、生物分析和分析化学领域。
背景技术：
为了降低临床上输血感染病毒的危险，增强输血的安全性，一般采用亚甲蓝灭活血浆中的病毒，即光化学病毒灭活法，即通过在血浆中加入一定量的光敏剂亚甲蓝，在光照下产生光化学反应，从而使血浆中病毒失活。为了保证血浆的安全性，在灭活前必须保证血浆中有足够浓度的光敏剂亚甲蓝(即足够高的释放量)，在灭活后的成品血浆中又必然保证 有足够低浓度的光敏剂亚甲蓝(即足够低的残留量)，从上述血浆处置工艺分析，这显然是互相矛盾的。为了较好地解决这对矛盾，通常使用成套病毒灭活袋，它由亚甲蓝贮藏装置、光照病毒灭活袋、亚甲蓝过滤装置、成品血浆贮藏袋及其相应的管线和开关组成。在血浆注入并通过亚甲蓝贮藏装置时，其中的亚甲蓝被释放出来，随血浆进入光照病毒灭活袋，在病毒灭活之后，通过亚甲蓝过滤装置滤除大多数的亚甲蓝，从而获得临床用成品血浆。经过过滤装置滤除的血浆，其残留的亚甲蓝的浓度虽然在安全范围内，但对于必须大量或长期输注血浆或输血浆后预期将长期存活的患者，其影响仍不得而知，特别是致突变的风险有可能增加，所以控制血浆中残留亚甲蓝浓度有重要意义。目前，检测血浆中亚甲蓝含量的测定方法有分光光度法、化学发光法、高效液相色谱法及以金纳米微粒为探针的共振瑞利散射法等，这些方法有灵敏度低和/或操作繁琐等缺点，常常还需要消耗较大量的血浆。2012年版《中国输血技术操作规程》中报道了血浆中亚甲蓝残留量检测方法，采用了固相萃取小柱对血浆样品和标准品中的亚甲蓝进行萃取分离，结合分光光度法测定其残留量。然而，在实际应用中发现该方法存在两个显著的缺点(1)操作特别烦琐、费时，血浆消耗量大；(2)样本测定吸光度值特别低，通常小于0.01 ;这与《中华人民共和国药典》“附录IV A紫外-可见分光光度法”项下所规定的准确测定含量所需要的吸光度0.3、. 7比较，所测定残留量显然是不准确的。而事实上，在低残留量时，吸光度的重现性特别差，预示着测定结果的不可靠。这一点与文献报道也是一致的。对于通常的亚甲蓝残留量为0.13umol/L(微摩尔/升)时，杨夏等[病毒灭活血浆亚甲蓝含量的检测及质量控制，中国输血杂志，2011，24 =881-883]的方法测定，其吸光度应为0. 0076，白莉等[固相萃取法检测病毒灭活血浆中的亚甲蓝，医药论坛杂志，2010，31 =108-109]的方法测定，其吸光度应为0.0042，张淑琴等[血浆中亚甲蓝含量的检测，临床输血与检验，2010，12 36-38]的方法测定，其吸光度应为0. 0011。由上可见，对于实际样本，这些吸光度值均是如此之低，显然，固相萃取一紫外可见分光光度法测定结果的可靠性极低。针对上述问题，周群刚等[文献I : P -环糊精增敏荧光分光光度法检测血浆亚甲蓝，临床检验杂志，2011，29 (5) =344-345]公开了一种P _环糊精增敏荧光分光光度法测定血浆中光敏剂亚甲蓝，相对于上述方法，该方法明显克服了上述两个缺点。但是，该方法能准确检测的最低定量限为0. 089 iimol/L，即略低于通常的亚甲蓝残留量(目前，对于通常使用的 成套病毒灭活袋，其亚甲蓝残留通常在0. 13umol/L左右)。事实上，实际血浆样本中最低残留量往往会低于0. 089 u mol/L,如文献2 [亚甲蓝/光化学法在血浆病毒灭活中应用，中国公共卫生，2008,24(11)，1365]中提到该研究中亚甲蓝的最终残留量为0.071.621! mol/L (文章第四段)。况且，从长远分析，随着技术的发展和人们对血浆要求的提高，亚甲蓝残留量将会越来越低。这显然会导致文献I中的方法失效，无法用于血浆亚甲蓝残留的常规检控。因此，开发一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，以进一步降低检测限，并提高检测灵敏度，具有积极的现实意义。

发明内容
本发明目的是提供一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，以进一步降低检测限，并提闻检测灵敏度。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，包括如下步骤
(a)向空白血浆中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，使其浓度为f4.5mmol/L，定容，得血浆空白样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fo ；
(b)向空白血浆中加入定量的亚甲蓝溶液，并加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cs的血浆标准样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fs ；
(C)向含亚甲蓝的待测血浆样本中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cx的血浆待测样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fx ；
然后按对照品比较法计算即可得到待测血浆样本中的亚甲蓝浓度Cx ；
所述步骤(a)、(b)和(C)中采用的荧光分光光度计进行检测的条件相同，激发波长为665±8nm，发射波长扫描范围为67(T715nm，激发狭缝宽度2 10nm，发射狭缝宽度2 10nm，扫描速度100 1000nm/min,激发光程2 IOmm,发射光程2 10mm。上文中，所述向空白血浆中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，使其浓度为1^4. 5mmol/L,这里的浓度是指加入羧甲基-P -环糊精饱和溶液之后的血浆中的羧甲基-￠-环糊精的摩尔浓度。上述技术方案中，所述步骤(a)、(b)和(C)中的定容采用缓冲液或二蒸水进行，所述PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液。优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液。其pH值为7. 2。与之相应的另一种技术方案，一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，包括如下步骤
(a)向至少5个空白血浆中分别加入不同量的亚甲蓝溶液，并加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝系列浓度的血浆标准样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得一系列荧光峰强度或荧光峰面积；(b)向含亚甲蓝的待测血浆样本中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述空白血浆样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cx的血浆待测样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fx ；
按标准曲线法计算即可得到待测血浆样本中的亚甲蓝浓度Cx ；
所述步骤(a)和(b)中采用的荧光分光光度计进行检测的条件相同，激发波长为665±8nm，发射波长扫描范围为67(T715nm，激发狭缝宽度2 10nm，发射狭缝宽度2 lOnm，扫描速度IOO lOOOnm/min,激发光程2 IOmm,发射光程2 10mm。上述技术方案中，在步骤(a)之前，还进行如下步骤(C):向空白血浆中加入羧甲基-P -环糊精饱和溶液，使其浓度为广4. 5mmol/L,定容，得血浆空白样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fo。 上文中，所述向空白血浆中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，使其浓度为1^4. 5mmol/L,这里的浓度是指加入羧甲基-P -环糊精饱和溶液之后的血浆中的羧甲基-￠-环糊精的摩尔浓度。上文中，按标准曲线法计算待测血浆样本中的亚甲蓝浓度时，其中的荧光信号可以扣除基底，也可以不扣除基底。上述技术方案中，所述步骤(a)、(b)和(C)中的定容采用缓冲液或二蒸水进行，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液。优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液。其pH值为7. 2。相对于周群刚等[文献I : @ -环糊精增敏荧光分光光度法检测血浆亚甲蓝，临床检验杂志，2011，29 (5) =344-345]公开的一种P _环糊精增敏荧光分光光度法，本发明既保留了上述方法的优点，同时又克服了上述方法的缺点。其根源在于，本发明所利用的基本原理与上述方法有显著的不同。文献I中的方法是基于￠-环糊精内腔的疏水相互作用导致荧光分子亚甲蓝进入该内腔，形成超分子包合物，从而增强亚甲蓝的荧光，提高其检测灵敏度，降低方法的最低定量限。而本发明除了利用上述疏水相互作用而增强亚甲蓝荧光以夕卜，还利用了另一个更为重要的相互作用，即羧甲基-￠-环糊精所带的负电荷与亚甲蓝所带正电荷之间的强烈的电性相互作用，使亚甲蓝进入疏水性内腔的程度显著增加，形成超分子包合物的能力更强，从而导致了本发明的检测灵敏度显著提高，最低定量限也显著降低，试验证明本发明的最低检测限已经低至0.012 ymol/L，取得了意想不到的效果，使本发明的方法能够有效地用于血浆中病毒灭活光敏剂亚甲蓝残留量的有效检测。本发明的检测方法可用于血浆中亚甲蓝的含量测定和血浆中残留亚甲蓝的测定，也可用于血浆病毒灭活之前亚甲蓝的释放量与释放效率测定、以及病毒灭活之后滤器对亚甲蓝的过滤效率测定，也可用于成品血浆中光敏剂亚甲蓝的残留量测定。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
I.本发明开发了一种新的检测血浆中亚甲蓝含量的方法，试验证明本发明的最低检测限已经低至0. 012 y mol/L，取得了意想不到的效果。2.本发明的测定方法简单、快速，不经分离、富集直接测定血浆中亚甲蓝，且血浆消耗量较少，节约宝贵的血浆资源，特别适用于血浆制品病毒灭活过程中的亚甲蓝释放量、滤除量及其残留量的常规检控。3.本发明的标准曲线线性回归性好，定量限低；本发明经线性范围测定试验，证明亚甲蓝在0. 012^2. 50 u mol/L范围内，浓度与响应呈良好的线性关系，血浆样品工作曲线为F=91. 223C+4. 942，r = 0. 9987，能够满足血浆中亚甲蓝的质控要求。4.实验证明，本发明在线性范围内的回收率为99. 7 106. 1%;中浓度亚甲蓝(I. 07 u mol/L)测定的日内变异系数(CV)为0. 13%、日间CV为3. 4% ;具有较高的检测精密度和准确度。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述
实施例一
一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，包括如下步骤 120 iiL，得血浆空白样本；
向300 u L空白血浆中加入5 u mol/L亚甲蓝储备液56 y L，并加入羧甲基[email protected] -环糊精饱和溶液280 u L，加入PBS缓冲液64 u L，得含亚甲蓝的血浆标准样本；
向300 ii L含亚甲蓝的待测血浆样本中加入羧甲基[email protected] -环糊精饱和溶液280 u L，加入PBS缓冲液120 u L，得血浆待测样本；
采用荧光分光光度计进行检测，检测条件为激发波长665nm，发射波长680nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm,扫描速度100nm/min,激发光程IOmm,发射光程IOmm,测定上述样本的荧光强度，据此数据按照对照品比较法计算待测血浆样本中亚甲蓝浓度。
采用实施例一所述的方法，做了一系列测定，并与文献I [ P -环糊精增敏荧光分光光度法检测血浆亚甲蓝，临床检验杂志，2011，29 (5) =344-345]公开的P -环糊精增敏荧光分光光度法做对比，结果如下
权利要求
1.一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于，包括如下步骤 (a)向空白血浆中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，使其浓度为f4.5mmol/L，定容，得血浆空白样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fo ； (b)向空白血浆中加入定量的亚甲蓝溶液，并加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cs的血浆标准样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fs ； (C)向含亚甲蓝的待测血浆样本中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cx的血浆待测样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fx ； 然后按对照品比较法计算即可得到待测血浆样本中的亚甲蓝浓度Cx ； 所述步骤(a)、(b)和(C)中采用的荧光分光光度计进行检测的条件相同，激发波长为665±8nm，发射波长扫描范围为67(T715nm，激发狭缝宽度2 10nm，发射狭缝宽度2 10nm，扫描速度100 1000nm/min,激发光程2 IOmm,发射光程2 10mm。
2.根据权利要求I所述的检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于所述步骤(a)、(b)和(c)中的定容采用缓冲液或二蒸水进行，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液。
3.根据权利要求2所述的检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于所述缓冲液为PBS缓冲液。
4.一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于，包括如下步骤 (a)向至少5个空白血浆中分别加入不同量的亚甲蓝溶液，并加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述血浆空白样本相同，定容，得含亚甲蓝系列浓度的血浆标准样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得一系列荧光峰强度或荧光峰面积； (b)向含亚甲蓝的待测血浆样本中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，加入浓度与上述空白血浆样本相同，定容，得含亚甲蓝浓度为Cx的血浆待测样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fx ； 按标准曲线法计算即可得到待测血浆样本中的亚甲蓝浓度Cx ； 所述步骤(a)和(b)中采用的荧光分光光度计进行检测的条件相同，激发波长为665±8nm，发射波长扫描范围为67(T715nm，激发狭缝宽度2 10nm，发射狭缝宽度2 10nm，扫描速度100 1000nm/min,激发光程2 IOmm,发射光程2 10mm。
5.根据权利要求4所述的检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于，在步骤(a)之前，还进行如下步骤(C):向空白血浆中加入羧甲基-￠-环糊精饱和溶液，使其浓度为r4. 5mmol/L，定容，得血浆空白样本，采用荧光分光光度计进行检测，测得荧光峰强度或荧光峰面积为Fo。
6.根据权利要求4或5所述的检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于所述步骤(a)、(b)和(c)中的定容采用缓冲液或二蒸水进行，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液。
7.根据权利要求6所述的检测血浆中亚甲蓝含量的方法，其特征在于所述缓冲液为PBS缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种检测血浆中亚甲蓝含量的方法，包括如下步骤(a)向空白血浆中加入羧甲基-β-环糊精饱和溶液，使其浓度为1～4.5mmol/L，定容，得血浆空白样本；(b)向空白血浆中加入定量的亚甲蓝溶液，并加入羧甲基-β-环糊精饱和溶液，得含亚甲蓝浓度为Cs的血浆标准样本；(c)向含亚甲蓝的待测血浆样本中加入羧甲基-β-环糊精饱和溶液，得含亚甲蓝浓度为Cx的血浆待测样本，检测上述样本的荧光峰强度或荧光峰面积；然后按对照品比较法计算即可得到待测血浆样本中的亚甲蓝浓度Cx。本发明的最低检测限已经低至0.012μmol/L，取得了意想不到的效果。
文档编号G01N21/64GK102706844SQ20121018615
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者周群刚, 唐建华, 徐军, 方敏, 王明元, 谢洪平, 谢莲 申请人:苏州大学, 苏州市中心血站