专利名称：检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱切换lc-ms/ms分析方法
技术领域：
本发明涉及一种检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱切换LC-MS/MS分析方 法，具体涉及一种检测尿样中32种安眠镇静药及其代谢物的柱切换LC-MS/MS分析方法。
背景技术：
安眠镇静药物能对中枢神经系统产生抑制，引起镇静、催眠和抗惊厥，主要用以治 疗焦虑、失眠和惊厥，同时由于其药理作用广泛，是临床治疗中广泛应用且不可缺少的药 物，自问世以来其用量不断增加。但是，安眠镇静药物可产生依赖，从而导致滥用，已成为全 球性药物依赖问题。由于安眠镇静药物品种多、易获得、应用广，其危害性超过阿片类药物。 目前常见的安眠镇静药物口服量安全范围大，与酒类饮料共用可增强对中枢神经系统的抑 制作用，其中，有些安眠镇静药物还可能造成暂时性记忆缺失，因此，常被用于麻醉后抢劫、 强奸或致人昏睡后杀人，也有人因服用该类药物导致交通肇事，或服用大量药物自杀。安眠 镇静药物具有用量少、代谢快、半衰期短等特点，在体内组织和体液中浓度很低，绝大部分 转变为代谢物并很快随尿液排出体外，而司法鉴定中的受检样品通常是受检人服药数小时 后乃至数十小时后的尿液或血液，故安眠镇静药物及其代谢物含量均较低，需要具备高灵 敏度的检测方法。样品前处理是生物样品分析方法中非常重要的步骤，也是一个比较费时、工作量 很大的过程。对于非挥发性化合物，液液提取和固相萃取是较常用的样品前处理方法，目前 研究的方向是在如何减少样品体积、缩短分析时间、降低成本、减少有机溶剂的使用体积、 提高自动化程度等方面。样品的在线前处理不仅增加了处理样品的安全性，而且减少了人 为因素影响，提高了准确度和精密度。鉴于气相色谱仪对提取后的样品要求苛刻，例如必须使用有机溶剂溶解样品、进 样体积小、需要衍生化等，所以，液相色谱仪和液相色谱质谱联用仪更适于实现样品在线前 处理。液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)将高效液相色谱法HPLC的高分离性能和质谱MS的高 选择性、高灵敏度及丰富的结构信息相结合，使得样品前处理简便，不需衍生化步骤，分析 范围广，还可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物， 也可以分析复杂基质体系中的待测物，已成为体内毒(药)物分析中强有力的工具。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱 切换LC-MS/MS分析方法，具体涉及一种检测尿样中32种安眠镇静药及其代谢物的柱切换 LC-MS/MS分析方法。本发明通过仪器改装，将柱切换技术与LC-MS/MS联用，待测尿样只需 简单处理即可进样，简化了实验步骤，节约了分析时间，降低了成本，同时，本发明的柱切换 LC-MS/MS分析方法快速、灵敏、可靠，已经应用于实际案例的分析。本发明所述的柱切换LC-MS/MS分析方法，包括如下步骤
1)配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统为了实现柱切换，本发明的分析方法至少需配置双泵输液系统和高压流路选择阀 系统，所述系统具体包括十通切换阀1、四元梯度泵2、高压二元泵3、进样器4、预处理柱5、 分析柱6和检测器7。其中，十通切换阀1的接口⑤与四元梯度泵2连接；十通切换阀1的 接口⑩与高压二元泵3通过进样器4连接；十通切换阀1的接口④、⑨分别与预处理柱5的 两端相连；分析柱6的一端与十通切换阀1的接口⑧相连，另一端与检测器7连接。所述四元梯度泵2为Waters Alliance 2695泵，高压二元泵3为Watersl525泵， 检测器7为Quattro Premier XE串联四极杆质谱。所述的双泵输液系统和高压流路选择阀系统的具体流路过程如下a.初始状态1(参见

图1)四元梯度泵2输送分析流动相，依次通过十通切换阀1 的接口⑤、⑥、⑦、⑧，进入分析柱6;高压二元泵3输送预处理流动相经过进样器4，通过十 通切换阀1的接口⑩、⑨，流入预处理柱5，即当样品通过进样器4进样时，预处理流动相将 样品带入预处理柱5，样品在预处理柱5上净化和富集，废液通过十通切换阀1接口④、③排 出；经过预处理时间后，十通切换阀1切换为进样状态II。b.进样状态II (参见图2)分析流动相通过十通切换阀1的接口⑤、④进入预处 理柱5并把样品通过十通切换阀1的接口⑨、⑧，冲入分析柱6，并最终进入到检测器7中进 行检测。其中，在进样状态II情况下，高压二元泵3继续持续不断的输送预处理流动相，此 时十通切换阀1通过接口⑩、①、②、③直接将预处理流动相排出；经过切换时间后，十通切 换阀1切换成初始状态I，平衡准备下一次进样。2.液相色谱条件a.预处理柱型号Oasis HLB 25 μ m 2. 1 X 20mm (Waters 公司)预处理柱柱温室温预处理流动相水流速1· OmL · mirT1预处理时间36s切换时间0·60-3. OOminb.分析柱型号Xterra MS C18 3. 5ym 2. ImmX 150mm(Waters 公司)分析柱柱温35°C分析流动相包括A和B，其中A为2mM甲酸胺和0. 05%甲酸的水溶液(0. 126克甲 酸胺和500 μ L甲酸，加水至IOOOmL)，B为2mM甲酸胺和0. 05%甲酸的乙腈(0. 126克甲酸 胺和500 μ L甲酸溶于40mL水中，加乙腈960mL)。流速0· 2mL · mirT1梯度流动相梯度洗脱条件见表1。表1流动相梯度洗脱条件
权利要求
一种检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱切换LC MS/MS分析方法，其特征在于，包括如下步骤1)配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统所述系统包括十通切换阀(1)、四元梯度泵(2)、高压二元泵(3)、进样器(4)、预处理柱(5)、分析柱(6)和检测器(7)；其中，所述十通切换阀(1)的接口⑤与所述四元梯度泵(2)连接；所述十通切换阀(1)的接口⑩与所述高压二元泵(3)通过所述进样器(4)连接；所述十通切换阀(1)的接口④、⑨与所述预处理柱(5)的两端分别相连；所述分析柱(6)的一端与所述十通切换阀(1)的接口⑧相连，另一端与所述检测器(7)连接；2)样品处理取尿样1.0mL加入50ng内标地西泮 D5混匀，高速离心16000rpm、5min，取上清液至自动进样小瓶中进样；3)按设定的LC MS/MS条件分析样品；4)结果分析根据色谱图和回归方程，计算各化合物的浓度。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述四元梯度泵(2)为Waters Alliance 2695泵，所述高压二元泵(3)为Waters 1525泵，所述检测器(7)为Quattro Premier XE串联四极杆质谱。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述LC-MS色谱条件如下i)预处理柱柱温室温 预处理流动相水 流速1. OmL · mirT1 预处理时间36s切换时间36s-3minii)分析柱柱温35°C分析流动相包括A和B，其中A为2mM甲酸胺和0. 05%甲酸的水溶液，B为2mM甲酸胺 和0. 05%甲酸的乙腈 流速0. 2mL · mirT1iii)进样量100μL。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述MS条件如下 检测方式多反应监测(MRM)扫描方式正离子扫描 电喷雾电压3200V 雾化气流速N2600L/hr 锥孔反吹气流速N250L/hr 离子源温度105°C 碰撞气氩气 内标地西泮-D5。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述LC-MS色谱采用流动相梯度洗脱。
6.根据权利要求1-5任一项所述的分析方法，其特征在于，所述安眠镇静药物及其代 谢物选白7_氨基硝基安定、哌唑嗪、7-氨基氯硝安定、唑匹坦、延胡索乙素、氯氮平、氟西泮、咪达唑仑、苯海拉明、多塞平、α-羟基咪达唑仑、苯海索、阿米替林、氯丙嗪、α-羟基三 唑仑、α -羟基阿普唑仑、卡马西平、艾司唑仑、奥沙西泮、硝西泮、阿普唑 仑、劳拉西泮、三唑 仑、氯硝西泮、安眠酮、氟硝西泮、去甲基安定、羟基安定、异安定酮、甲基劳拉西泮、地西泮、 普拉西泮。
全文摘要
本发明公开了一种检测尿中安眠镇静药物及其代谢物的柱切换LC-MS/MS分析方法，包括如下步骤1)配置双泵输液系统和高压流路选择阀系统；2)按设定的LC-MS/MS条件分析样品；3)结果分析。本发明方法对尿中各安眠镇静药物或代谢物的检测限为0.01～10ng·mL-1；线性范围2～3个数量级，相关系数γ均在0.991以上，线性关系良好。本发明方法的待测尿样只需简单处理即可进样，简化了实验步骤，节约了分析时间，降低了成本。本发明的柱切换LC-MS/MS分析方法快速、灵敏、可靠，可以分析尿中的共32种常见安眠镇静药物及其代谢物，可广泛应用于实际案例分析中。
文档编号G01N30/20GK101963602SQ20101027848
公开日2011年2月2日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者丁敏菊, 叶海英, 张润生, 张玉荣, 梁晨, 汪蓉 申请人:上海市公安局刑事侦查总队