专利名称：利用重组病毒分析法评价病毒受体/辅助受体使用和病毒侵入抑制剂的组合物和方法
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背景技术：
病毒侵入是抗病毒治疗的一个令人关注的新目标，大约有10个用于阻断病毒接触或膜融合的药物处于临床前研究或临床研究阶段(Richman，1998；PhRMA，1999；Stephenson，1999)。带有包膜的动物病毒和宿主细胞接触，并通过病毒颗粒膜上病毒蛋白(包膜蛋白)和细胞表面蛋白(病毒受体)的相互作用侵入宿主细胞。受体识别和结合由表面的包膜蛋白所介导。
发明概述相应地，本发明的目的之一是提供用于检测病毒对病毒侵入抑制剂敏感性的一种快捷、灵敏的表型分析法。
本发明的另一个目的是提供一种逆转录病毒载体系统，该系统产生的病毒颗粒包含各种来源的病毒包膜蛋白，并能够识别表达有病毒受体、允许病毒复制的细胞系。
本发明的另一个目的是提供一种能够接受病人来源的、编码包膜的基因片段的病毒包膜表达载体。
本发明的另一个目的是提供一种包含HIV-1病毒基因组大部分的、在包膜区位置带有荧光素酶报道基因的生物安全性载体。
本发明的另一个目的是提供一种表型分析方法，该方法通过使用HIV-1基因组中转录调控区(U3的3′拷贝)缺失了的病毒表达载体，减小了形成重组的感染性HIV-1的可能性。
本发明的另一个目的是提供一种能够鉴定并测定受体/辅助受体向性(tropism)的分析方法，该方法能够快捷、准确地鉴定感染了向性病毒(tropic virus)毒株的病人。
本发明的这些目的和其他目的可通过以下实现一种鉴定化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法，其包括(a)从感染了病毒的病人获得编码病毒包膜蛋白的核酸；(b)将(i)步骤(a)中的核酸，和(ii)缺失编码包膜蛋白的核酸、包含能产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体共转染第一细胞，使得第一细胞产生包含包膜蛋白的病毒颗粒，所述包膜蛋白由从病人获得的核酸编码；(c)在化合物存在的条件下，将步骤(b)中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；(d)测定第二细胞产生的信号量，以检测病毒颗粒的感染性；和(e)将步骤(d)中测定的信号量和无化合物存在时产生的信号量相比较，其中化合物存在时信号量的减少意味着化合物抑制了病毒向第二细胞的侵入。
附图简述本发明的文件中至少含有一份彩图。专利商标局可以应要求提供带有彩图的本专利的复本，并收取相应的费用。


图1A.包膜表达载体和病毒表达载体的结构。
HIV包膜表达载体(pHIUVenv)含有从病人血浆样本扩增得到的包膜序列。a/b和c/d指位于HIV-1包膜多聚蛋白(gp160)基因5′和3′末端的限制性内切酶位点。HIV表达载体(pHIVlucAU3)编码除包膜蛋白之外的所有HIV蛋白。其中删除了一部分包膜基因，并插入一个用于监测在抗病毒药存在或不存在的情况下病毒的复制能力的指示性基因序列，在本发明中是“萤火虫荧光素酶”基因序列。部分删除了3′U3区域，以阻止受感染细胞中5′LTR起始的转录。这一系统产生的病毒仅限于一轮复制。
图1B.以细胞为基础的侵入分析法通过将pHIVenv和pHIVlucU3共转染宿主细胞，进行药物敏感性、辅助受体向性和病毒中和性试验。宿主细胞产生与来源于受试病毒或病人样本的包膜蛋白序列相仿的HIV病毒颗粒。转染后(约48h)收集病毒颗粒，用之感染表达HIV受体(如CD4)和辅助受体(如CXCR4、CCR5)的靶细胞。感染后(约72h)将靶细胞裂解，测定荧光素酶活性。为了成功感染目标宿主细胞并产生荧光素酶活性，HIV必须完成一轮复制。如果病毒不能够进入靶细胞，荧光素酶活性则较弱。该系统可以用于评价对侵入抑制剂的敏感性、受体和辅助受体向性及病毒中和性。
图2.HIV包膜表达载体从病人样本中扩增HIV包膜序列，并利用限制性内切酶位点(5′a/b和3′c/d)将之插入表达载体。包膜的转录由人巨细胞病毒(CMV)的即早基因启动子驱动。包膜RNA通过猴病毒40(SV40)的腺苷酸化信号序列(A+)得以腺苷酸化。在CMV启动子HIV包膜序列之间设计有一个内含子，以增加受转染细胞中包膜mRNA的水平。FL-表达全长的包膜蛋白(gp120、gp41)；CT-表达缺失gp41中C-端胞质尾结构域的包膜蛋白(gp120、gp21)；+CT-表达包含恒定、未成熟gp41胞质尾结构域的包膜蛋白(gp120、gp41)；gp120-表达来源于病人的gp120蛋白和恒定、未成熟的gp41。gp41-表达恒定、未成熟的gp120和来源于病人的gp41。
图3A.辅助受体向性筛选分析法在该图中，该分析法利用两种细胞系进行。一种细胞系表达CD4和CRR5(上面6组)。另一种细胞系表达CD4和CXCR4(下面6组)。使用从pHIVenv和pHIVlucU3载体转染的细胞中获得的大量重组病毒原种感染细胞，来进行这种分析。图中示例是对96孔板中形成的96种病毒的分析。感染在不存在药物(没有药物)或存在抑制R5向性病毒(CCR抑制剂)或X4向性病毒(CXCR4抑制剂)的药物的条件下进行。通过将药物存在或不存在条件下各种细胞产生的荧光素酶活性相比较，确定辅助受体向性(对分析结果的解释见图3B)。
图3B.测定辅助受体向性在该图中，通过将各样本中的病毒对CD4/CCR5表达细胞(R5细胞)和CD4/CXCR4表达细胞(X4细胞)的感染能力(产生的荧光素酶活性)相比较，对分析结果加以解释。另外，还评价了CCR5或CXCR4抑制剂特异性阻断感染(抑制荧光素酶活性)的能力。X4向性病毒(绿色组)——感染X4细胞，但不感染R5细胞。CXCR4抑制剂能够阻断对X4细胞的感染。R5向性病毒(蓝色组)——感染R5细胞，但不感染X4细胞。CCR5抑制剂能够阻断对R5细胞的感染。具有双重向性的病毒或X4/R5向性病毒混合物(黄色组)——感染X4和R5细胞。CCR5抑制剂能够阻断对R5细胞的感染，CXCR4抑制剂能够阻断对X4细胞的感染。无生存力的病毒(红色组)——在X4和R5细胞中均不能复制。
图4A.测定侵入抑制剂的敏感性融合抑制剂该图说明对融合抑制剂T-20的敏感性。在不存在T-20和存在不同浓度T-20(X-轴log10刻度值)的条件下，分别感染表达CD4、CCR5和CXCR4的细胞。通过将T-20存在的条件下产生的荧光素酶活性和无T-20存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。对R5向性、X4向性和双重向性的病毒进行试验。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的T-20浓度(IC50，以垂直的虚线表示)对药物的敏感性进行定量。具有较低IC50值的病毒对T-20的敏感性高于具有较高IC50值的病毒。NL4-3已鉴定的X4向性株；JRCSF已鉴定的R5向性株；91US005.11从NIH AIDS研究和参照药剂项目组(AIDS Research and ReferenceReagent Program，ARRRP)中得到的R5向性分离物；92HT593.1从NIH ARRRP中得到的双重向性分离物(X4R5)；92HT599.24从NIHARRRP中得到的X4向性分离物。
图4B.测定侵入抑制剂的敏感性耐药性突变该图说明在gp41包膜蛋白中引入特定的耐药性突变导致融合抑制剂T-20的敏感性降低。在不存在T-20和存在不同浓度T-20(X-轴log10刻度值)的条件下，分别感染表达CD4、CCR5和CXCR4的细胞。通过将T-20存在的条件下产生的荧光素酶活性和无T-20存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。对gp41跨膜包膜蛋白中包含一个或两个特定突变的同基因病毒进行试验(在图注中以红色标出)。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的T-20浓度(IC50，以垂直的虚线表示)对药物的敏感性进行定量。具有较低IC50值的病毒对T-20的敏感性高于具有较高IC50值的病毒。
无突变(野生型序列)GIV单位点突变GIV、DIM、SIV双位点突变DIM、SIM、DTV图5A.测定侵入抑制剂的敏感性CCR5抑制剂该图说明了CCR5抑制剂(Merck化合物)的敏感性。在不存在CCR5抑制剂和存在不同浓度CCR5抑制剂(X-轴log10刻度值)的条件下，分别感染表达CD4和CCR5的细胞。通过将CCR5抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶活性和无CCR5抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。对R5向性、X4向性和具有双重向性的病毒进行试验。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的CCR5抑制剂浓度(IC50，以垂直的虚线表示)对药物的敏感性进行定量。具有较低IC50值的病毒对CCR5抑制剂的敏感性高于具有较高IC50值的病毒。X4向性病毒不能感染R5细胞。NL4-3已鉴定的X4向性株；JRCSF已鉴定的R5向性株；92HT593.1从NIH ARRRP中得到的双重向性株(X4R5)图5B.测定侵入抑制剂的敏感性CXCR4抑制剂该图说明了CXCR4抑制剂(AMD3100)的敏感性。在不存在CXCR4抑制剂和存在不同浓度CXCR4抑制剂(X-轴log10刻度值)的条件下，分别感染表达CD4和CXCR4的细胞。通过将CXCR4抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶活性和无CXCR4抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。对R5向性、X4向性和具有双重向性的病毒进行试验。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的CXCR4抑制剂浓度(IC50，以垂直的虚线表示)对药物的敏感性进行定量。
具有较低IC50值的病毒对CXCR4抑制剂的敏感性高于具有较高IC50值的病毒。R5向性病毒不能感染X4细胞。
NL4-3已鉴定的X4向性株；JRCSF已鉴定的R5向性株；92HT593.1从NIH ARRRP中得到的双重向性株(X4R5)图6.侵入抑制剂敏感性融合抑制剂该图说明与全长包膜序列或胞质尾缺失的包膜序列相对应的扩增子的产生。在凝胶图谱的右面依次列出了和辅助受体向性相对应的泳道号。
图7.敏感性降低融合抑制剂图中所示散点是利用抗CCR5或CXCR4的抗体(在Y轴上标出)进行的FACS(荧光激活的细胞分选)分析。在图的下方列出了表达辅助受体的细胞系，CD4荧光在X轴上表示。抗CXCR4的抗体和表达相应辅助受体CXCR4的细胞结合作用最强。
图8.侵入抑制剂敏感性CCR5抑制剂图示为辅助受体拮抗剂处理后的抑制作用。
图9.侵入抑制剂敏感性CXCR4抑制剂图示为抑制病毒膜和细胞膜之间融合的肽段的图谱和氨基酸序列。
图10.辅助受体拮抗剂的抑制作用图11.T-20耐药性突变图12.鉴定侵入抑制剂耐药性突变图13.融合抑制剂肽下面参照附图及实施例所作的发明详述会使本发明的特点变得更为直观。下面的描述讨论了实施本发明所借助的手段和方法，它们和鉴定及评价病毒侵入抑制剂相关的表型分析法有关，包括但不限于，例如HIV-1和HIV-1病毒侵入抑制剂。
发明详述本发明提供了鉴定化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法。该方法包括(a)从感染病毒的病人获得编码病毒包膜蛋白的核酸；(b)将(i)步骤(a)中的核酸和(ii)缺失编码包膜蛋白的核酸并包含产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体共转染第一细胞；(c)在化合物存在的条件下，将步骤(b)中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；(d)测定第二细胞产生的信号量，以检测病毒颗粒的感染性；和(e)将步骤(d)中产生的信号量和无化合物存在时的信号量相比较，其中化合物存在时信号量的减少意味着化合物抑制了病毒向第二细胞的侵入。
在本发明的一个实施方案中，指示性核酸包括一个指示性基因。在本发明的另一个实施方案中，指示性基因是荧光素酶基因。
在本发明的一个实施方案中，细胞表面受体是CD4。在本发明的一个实施方案中，细胞表面受体是一种趋化因子受体。在本发明的一个实施方案中，细胞表面受体是CXCR4或CCR5。
在本发明的一个实施方案中，病人感染有HIV-1病毒、肝炎病毒(如HCV或HBV病毒)或其他病毒。
在本发明的一个实施方案中，步骤(a)中的核酸包括编码gp120和gp41的DNA。
在本发明的一个实施方案中，病毒表达载体包括HIV核酸。
在本发明的一个实施方案中，病毒表达载体包括HIV gag-pol基因。
在本发明的一个实施方案中，病毒表达载体包括编码vif、vpr、tat、rev、vpu和nef的DNA。
在本发明的一个实施方案中，第一细胞是哺乳动物细胞。
在本发明的一个实施方案中，哺乳动物细胞是人类细胞。
在本发明的一个实施方案中，人类细胞是人胚肾细胞。
在本发明的一个实施方案中，人胚肾细胞是293细胞。
在本发明的一个实施方案中，第二细胞是人类T细胞。
在本发明的一个实施方案中，第二细胞是人类T细胞白血病细胞系。
在本发明的一个实施方案中，第二细胞是外周血单核细胞。
在本发明的一个实施方案中，第二细胞是星形胶质瘤细胞。
在本发明的一个实施方案中，星形胶质瘤细胞是U87细胞。
在本发明的一个实施方案中，第二细胞是人类骨肉瘤细胞。
在本发明的一个实施方案中，人类骨肉瘤细胞是HT4细胞。
在本发明的一个实施方案中，化合物和细胞表面受体相结合。
在本发明的一个实施方案中，化合物是细胞表面受体的配体。
在本发明的一个实施方案中，化合物包括抗体。
在本发明的一个实施方案中，化合物抑制膜融合。
在本发明的一个实施方案中，化合物是肽、肽模拟物(peptidomimetic)、有机分子或合成化合物。
在本发明的一个实施方案中，化合物和病毒包膜蛋白相结合。
本发明提供了一种制备组合物的方法，包括将通过本文描述的筛选法(鉴定化合物的方法)鉴定的化合物和载体(carrier)混合。
在本发明的一个实施方案中，载体是盐水、聚乙二醇、缓冲液、淀粉或有机溶剂。
本发明提供了一种鉴定在病毒感染细胞时，和病毒相结合的细胞表面受体的方法。该方法包括(a)获得包含(i)病毒核酸和(ii)产生可检测信号的指示性核酸的病毒颗粒；(b)将表达有细胞表面受体的细胞和步骤(a)中获得的病毒颗粒相接触；和(c)测定细胞内产生的可检测信号，其中信号的产生说明细胞表达的细胞表面受体为病毒所结合，因此病毒感染细胞时病毒的结合说明细胞表面受体的存在。
本发明还提供了鉴定一种抗体是否抑制病毒侵入细胞的方法。该方法包括(a)从感染病毒的病人获得编码病毒包膜蛋白的核酸；(b)将(i)步骤(a)中的核酸和(ii)缺失编码包膜蛋白的核酸并包含能产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体共转染第一细胞，以使第一细胞产生包含包膜蛋白的病毒颗粒，该包膜蛋白由病人获得的核酸所编码；(c)在抗体存在的条件下，将步骤(b)中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；(d)测定第二细胞产生的信号量，以检测病毒颗粒的感染性；和(e)将步骤(d)中产生的信号量和无抗体存在时的信号量相比较，其中抗体存在时信号量的减少意味着抗体抑制了病毒向第二细胞的侵入。
本发明提供了一种测定病毒对抑制病毒侵入细胞的化合物的敏感性的方法。该方法包括(a)从感染病毒的病人获得编码病毒包膜蛋白的核酸；(b)将(i)步骤(a)中的核酸和(ii)缺失编码包膜蛋白的核酸、包含能产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体共转染第一细胞，以使第一细胞产生包含包膜蛋白的病毒颗粒，该包膜蛋白由病人获得的核酸所编码；(c)在化合物存在的条件下，将步骤(b)中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；(d)测定第二细胞产生的信号量，以检测病毒颗粒的感染性；和(e)将步骤(d)中产生的信号量和无化合物存在时的信号量相比较，其中抗体存在时信号量的减少意味着病毒对化合物敏感。
本发明提供了测定病毒对抑制病毒侵入细胞的抑制剂耐药性的一种方法。该方法包括(a)按照权利要求33的方法测定一种病毒对一种化合物的敏感性，其中在第一时间从病人获得编码病毒包膜蛋白的一种核酸；(b)按照权利要求33的方法测定一种病毒对一种化合物的敏感性，其中在稍后的第二时间从病人获得编码病毒包膜蛋白的核酸；和(c)比较步骤(a)和步骤(b)中测得的敏感性，其中在稍后的第二时间测得的敏感性的降低意味着病毒对化合物产生了耐药性。
本发明提供了鉴定病毒中的突变能否使病毒对抑制病毒侵入细胞的化合物产生耐药性的方法。该方法包括(a)在使用化合物对病毒进行处理之前测定病毒的核酸序列或氨基酸序列；(b)获得对化合物产生耐药性的病毒；(c)测定步骤(b)中病毒的核酸序列或氨基酸序列；和(d)将步骤(a)和步骤(c)中的核酸序列或氨基酸序列分别进行比较，以鉴定病毒中的突变是否使病毒对化合物产生耐药性。
在本发明的一个实施方案中，步骤(b)中获得的病毒是在化合物存在的条件下生长直至产生耐药性的步骤(a)中的病毒。
在本发明的一个实施方案中，步骤(b)中获得的病毒是从接受化合物治疗的病人中分离的。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种准确、可重复地测定HIV-1对病毒侵入抑制剂的敏感性的手段和方法。
在另一个优选实施方案中，本发明也提供了一种准确、可重复地测定HIV-1辅助受体向性的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种准确、可重复地测定抗体介导的HIV-1中和作用的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种发现、优化并表征靶向病毒吸附(attachment)和侵入过程中多个明确或不明确步骤的新药的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种发现、优化并表征靶向病毒吸附和侵入过程中多个明确或不明确步骤的HIV-1疫苗(预防性或治疗性的)的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种鉴定HIV-1包膜蛋白(gp41TM和gp120SU)中改变对病毒侵入抑制剂敏感性的氨基酸替换/突变的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种对HIV-1包膜中特定突变对病毒侵入抑制剂所具有的影响进行定量分析的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种测定对病毒侵入抑制剂敏感性发生改变的病毒中经常单独或联合发生的HIV-1包膜氨基酸替换/突变的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种鉴定改变了受体或辅助受体向性的HIV-1包膜蛋白(gp41TM和gp120SU)中氨基酸替换/突变的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种对HIV-1包膜中特定突变对受体或辅助受体向性所具有的影响进行定量分析的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种鉴定表现为CXCR4或CCR5辅助受体向性的病毒中经常单独或联合发生的HIV-1包膜氨基酸替换/突变的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种鉴定HIV-1包膜蛋白(gp41TM和gp120SU)中改变抗体介导的中和作用的氨基酸替换/突变的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种对HIV-1包膜中特定突变对抗体介导的中和作用所具有的影响进行定量分析的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种测定对表现出抗体介导的病毒中和作用的病毒中经常单独或联合发生的HIV-1包膜氨基酸替换/突变的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种鉴定在病人样本病毒中经常发现的、能够中和HIV-1的抗体的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种鉴定CD4结合为感染所必需的病毒的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种鉴定CD4结合不为感染所必需的病毒的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明还提供了一种鉴定病人样本表现为CD4非依赖性感染的发生率的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种鉴定CD8结合为感染所必需的病毒的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明还提供了一种鉴定病人样本表现为CD8依赖性感染的发生率的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种鉴定CXCR4趋化因子受体结合、CCR5趋化因子受体结合、或CXCR4或CCR5结合(双重向性)为感染所必需的病毒的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种鉴定CXCR4趋化因子受体结合、CCR5趋化因子受体结合、或CXCR4或CCR5结合(双重向性)为感染所必需的病毒发生率的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种鉴定表现出(a)对病毒侵入抑制剂的敏感性发生改变；(b)CXCR4或CCR5辅助受体向性；和(c)抗体介导的病毒中和作用的病毒中经常单独或联合发生的HIV-1包膜氨基酸替换/突变的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种利用病毒侵入抑制剂的敏感性指导HIV-1治疗的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种利用病毒侵入抑制剂的敏感性指导治疗抗逆转录病毒药物治疗失败的病人的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种利用病毒侵入抑制剂的敏感性指导治疗刚刚感染HIV-1的病人的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种利用HIV-1辅助受体向性指导HIV-1治疗或指导治疗抗逆转录病毒药物治疗失败的病人的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种利用HIV-1辅助受体向性指导治疗刚刚感染HIV-1的病人的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种测定抗体介导的HIV-1中和作用以监测疫苗接种后初级保护性抗体应答的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种测定抗体介导的HIV-1中和作用以监测疫苗接种后初级治疗性抗体应答的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种随时间测定抗体介导的HIV-1中和作用以监测疫苗接种后保护性抗体应答的持久性的手段和方法。
在一个优选实施方案中，本发明进一步提供了一种测定抗体介导的HIV-1中和作用以形成并优化使接种效力和持久性最大化的接种启动-加强方案的手段和方法。
比如，对于HIV-1来说，SU蛋白(gp120-SU)和跨膜的包膜蛋白(gp41-TM)紧密地结合在一起，后者将复合物锚定在病毒膜上。包膜蛋白gp120和gp41都来源于未剪切的前体包膜基因产物gp160。HIV-1和其细胞受体(CD4)及辅助受体(CCR5或CXCR4)的结合促使TM蛋白的构象改变，导致病毒膜和细胞膜的融合及病毒核心向细胞质的侵入(Retroviruses，1997)。虽然新的HIV侵入抑制剂以病毒包膜蛋白(gp120/gp41)或宿主蛋白(CD4、CCR5、CXCR4)为靶点，HIV-1中的大多数耐药性相关突变也都位于病毒包膜基因。例如，病毒进化的一种可能方式是改变所使用的辅助受体。侵入阻断剂是一类新型的抗逆转录病毒药物，对于目前存在的多药耐药性HIV-1变体可能会具有高广谱活性。融合抑制剂、受体/辅助受体拮抗剂和疫苗均属于这类潜在的病毒侵入阻断剂。
然而，病毒侵入抑制剂也有可能使包膜基因突变而产生耐药性病毒，从而使病人的治疗变得复杂，和用于治疗HIV的蛋白酶抑制剂(PRI)、逆转录酶抑制剂(RTI)情况类似。事实上，FDA批准任何一个阻断病毒侵入的新药都要对其耐药性数据进行评价。对侵入阻断剂敏感性进行诊断试验的必要性已在融合抑制剂T-20的档案内说明。有报道表明在T-20存在的条件下将病毒在体外传代，病毒对T-20的敏感性降低。此时，还没有便于操作的、用于测定对阻断病毒侵入的抑制剂敏感性的表型分析法。随后，在没有必需的工具来说明药物敏感性的情况下，医生们很快就得面对鸡尾酒疗法所带来的挑战。因此，准确测定对抑制受感染病人中病毒侵入的药物敏感性的可靠分析方法将变得极有价值。
比如，最近据世界卫生组织估计，全世界有超过3千3百万人感染有AIDS传染病的致病因子HIV-1。在美国将近有1百万人受感染，300,000人目前正接受抗病毒治疗(CDC，1999；WHO 1999)。和AIDS作战已经成为政府机构、学术性实验室和医药/生物工程工业史无前例的共同奋斗目标。FDA已经批准了14个用于治疗HIV-1感染的抗病毒药物(Carpenter等，2000)，并有20多个药物处于临床研究阶段(PHRMA，1999)。已获批准的药物通过干扰蛋白酶(PR)或逆转录酶(RT)的酶活性抑制HIV-1的复制。PR抑制剂(PRIs)阻断病毒感染和复制所需的适当病毒蛋白的形成，而RT抑制剂(RTIs)阻断病毒遗传物质的复制。但PRIs和RTIs效力都不是很强，所以最常见的情况是二者联合用于抑制病毒复制(Carpenter等，2000)。
因此，需要提供一种快捷、准确且安全的病毒分析法，可用于评价33.病毒吸附和侵入抑制剂(包括融合、受体及辅助受体抑制剂)的活性；34.受体/辅助受体向性，以加速病毒侵入抑制剂药物设计和治疗；35.来源于病人的病毒对吸附和侵入抑制剂的敏感性的变化；和36.利用病毒包膜蛋白抗原接种后产生的病毒中和活性。
本发明的方法可以用于对病毒侵入抑制剂有应答，且抗病毒药物敏感性和对病毒侵入抑制剂的耐药性是一要事的任何病毒性疾病，包括但不仅限于慢病毒(如HIV-2)、其他逆转录病毒(如HTLV-1和HTLV-2)、噬肝DNA病毒(如人乙型肝炎病毒)、黄病毒(如人丙型肝炎病毒)和疱疹病毒(如人巨细胞病毒)。
侵入阻断剂是一类新型的抗逆转录病毒药物，对于目前存在的多药耐药性HIV-1变体可能会具有高的广谱活性。融合抑制剂、受体/辅助受体拮抗剂和疫苗
均属于这类潜在的病毒侵入阻断剂。
融合抑制剂用于竞争性抑制TM构象变化的化合物，称作融合抑制剂，是HIV-1复制的强抑制剂。虽然它们的活性已经在细胞培养系统和HIV-1感染的病人中都得以证实(Wild等，1992；Judice等，1997；Kilby等，1998)，但在美国还没有一个用于治疗HIV-1感染的融合抑制剂获得批准。这种类型的药物，如T-20和T-1249(Trimeris公司，美国)处于高级临床研究阶段。
受体/辅助受体拮抗剂除了在HIV-1和其受体相互作用之后起作用的融合抑制剂，人们正致力于开发抑制HIV-1和CD4或两个主要辅助受体相互作用的药物。这类药剂抑制HIV-1感染的能力已经在细胞培养系统和动物模型中得以证实。已经鉴定到一些以gp120、CD4、巨噬细胞向性病毒(R5)使用的CCR5辅助受体、T细胞向性病毒(X4)使用的CXCR4辅助受体为靶点的先导化合物(Allaway等，1993；Reimann等，1995；Baba等，1999；Bridger等，1999)。
目前，在美国还没有一个用于治疗HIV-1感染的辅助受体拮抗剂获得批准。这种类型的药物，如PRO 542(Progenics公司，美国)、5a8(Tanox，美国)、TAK-779(Takeda公司，日本)和AMD-3100(Anormed公司，加拿大)都处于临床前研究或早期临床研究阶段。因此，如果有一种鉴定并测定受体/辅助受体向性的分析方法能够快捷、准确地鉴定受向性病毒株(如HIV-1)感染的病人，则将加速病毒侵入抑制剂药物的设计和治疗。
疫苗有证据表明，疫苗是和人病源性病毒感染相对抗的一种有效策略。用于预防HIV-1感染的几个疫苗候选物正处于临床开发阶段。包膜蛋白gp120和gp41是处于深入研究阶段的、最明显的HIV-1疫苗候选物。处于临床评价阶段的11个疫苗候选物中许多都是以包膜为基础的(PhRMA，1999)。一般来说，一种有效的包膜疫苗可以刺激中和性抗体的产生，从而阻断病毒感染(Mascola等，2000)。因此，迫切需要建立一种能够可靠地测定中和抗体效价、而不需延长病毒培养时间的、灵敏的高通量分析法。这种分析法将大大有助于有效AIDS疫苗的研究。这一点是千真万确的，因为晚期临床试验涉及到数以千计的病人群体。既然中和性抗体可以预防对靶细胞的成功感染，包膜受体分析法可用作一种病毒分析法。
不幸的是，大多数这些药物的联用都只在有限的时间内有效，其部分原因是耐药性病毒的出现。RT和RNA聚合酶II缺少校对功能，和高水平、易出错的复制相偶联，使HIV-1之类的病毒易于发生突变(Coffin，1995)。这种高突变发生率使HIV-1有能力躲过连续的长期药物治疗，导致病毒负荷反弹。已有报道描述了对14个已批准药物和多个处于研究阶段的化合物的耐药相关突变(Schinazi等，1999)。因此，多药耐药性HIV-1变体引发了受感染病人护理中一个日益严重的问题。为了获得长期的临床疗效，就要选择那些能够最大限度抑制病毒复制的药物，而避免使用患者病毒对之有耐药性的药物(DHHs，2000)。长期的解决办法取决于能够指导医生选择最有效对抗病人病毒的药物的耐药性试验。最近DHHs的指导原则中证实了进行耐药性试验的需要(DHHs，2000)，建议治疗HIV-1感染病人时耐药性试验可以定期使用。敏感性试验也有助于以耐药性病毒为靶点的新药开发。最近FDA咨询委员会(1999年11月)建议在新型抗HIV-1药物的开发中使用耐药性试验。
已经有数种策略用于评价抗病毒药物的敏感性。通过基因型试验对待测核苷酸序列或基因型中的突变进行分析，并将之和耐药性相联系(Rodriguez-Rosado等，1999；Schinazi等，1999)。但是，基因型和表型之间的关系是复杂的，不易进行解释，对这些试验的结果也不能加以定量。基因型药物敏感性数据需要由专家或计算机算法进行解释(Baxter等，1999)，对治疗结果并不总是有预测性(Piketty等，1999)。
表型药物敏感性试验直接测定病毒在药物存在条件下的复制能力并加以定量。早期的表型试验需要进行较长时间的病毒培养过程，耗时且耗力，不易用于自动化的高通量筛选。因此，这些早期的表型试验不适于病人管理。重组病毒分析法的建立(Shi和Mellors，1997；Hertogs等，1998)简化了表型试验，增加了筛选通量。但是，这些分析方法的一个主要缺点是需要4周～8周的较长周转时间。最近，建立的重组病毒分析法和其他分析法能够在一轮复制的过程中测定药物敏感性(Zennou等，1998；Petropoulos等，2000)，将周转时间大大缩短至8天～10天。抗逆转录病毒治疗失败的病人将得益于表型分析法。这类分析法是病人管理的一个有力工具，这是因为它们提供了一种直接、快捷测定药物敏感性的方法。
本发明的分析方法可以用于其他的病毒性感染，这些病毒性感染可以是这些家族内的其他病毒感染引起的，也可以是其他病毒家族内的病毒引起的。另外，本发明的药物敏感性和耐药性试验对于治疗目前尚无治疗方法的病毒性疾病的化合物的筛选是有用的。
本发明药物敏感性和耐药性试验中受试病毒的结构、生命周期和遗传因素是本技术领域中一种常规知识。例如，了解逆转录病毒的生命周期，了解病毒营救和感染力所需的病毒基因将有助于本发明的实施。受逆转录病毒感染的细胞包含二倍体RNA基因组的病毒。带有包膜糖蛋白(决定感染的宿主范围)的病毒吸附在受感染细胞质膜上的细胞受体上。和受体结合后，病毒内化，通过宿主细胞的质膜时脱去衣壳。在进入细胞核的途中或细胞核中，位于病毒核心中的逆转录酶分子驱动双链RNA前病毒的合成。这种合成是由一种tRNA分子和基因组病毒RNA分子的结合所引发的。双链RNA前病毒随后整合到宿主细胞的基因组中，在那里用作编码病毒蛋白和病毒颗粒基因组RNA(将被包装到病毒的核心颗粒中)的mRNA的转录模板。在病毒颗粒从受感染细胞中释放的途中，核心颗粒穿过细胞质、吸附在新的受感染细胞的质膜内侧、出芽并被包含病毒编码的包膜糖蛋白基因产物的膜所包裹。当感染传播时，包括逆转录、转录、翻译、病毒颗粒组装和出芽的感染周期周而复始地重复。
病毒RNA和前病毒DNA编码多个对于病毒周期连续完成至关重要的顺式作用元件。病毒颗粒RNA的3′末端带有病毒启动子。由于基因组进行逆转录，复制性特技又使病毒启动子位于前病毒基因组的5′末端。3′到5′逆转录病毒LTR中存在有病毒包装位点。逆转录病毒生命周期需要病毒编码的反式作用因子的存在。病毒-RNA依赖的DNA聚合酶(pol)——逆转录酶也包含在病毒核心中，对于病毒的生命周期是至关重要的。它负责基因组RNA向可整合的中间型前病毒DNA的转变。病毒包膜糖蛋白env是病毒吸附在未受感染的细胞上以及病毒传播所必需的。还有称作反式激活因子的转录反式作用因子，它可以调节整合的亲本前病毒的转录水平。典型地说，有复制能力(无缺陷)的病毒是自含的，自身编码所有这些反式作用因子。而有缺陷的病毒则不具有自含性。
如果是噬肝DNA病毒之类的DNA病毒，了解感染所必需的生命周期和病毒基因将有助于本发明的实施。HBV的侵入过程尚不明确。HBV的复制使用一个RNA中间体模板。在受感染的细胞中，复制的第一步是不对称松弛环形DNA(rc-DNA)转变为共价闭合环形DNA(cccDNA)。在受感染肝细胞的细胞核中发生的这一过程涉及到DNA正链的合成和DNA末端的连接。在第二步中，宿主RNA聚合酶将cccDNA转录，产生一条3.5kb的RNA模板(前基因组)。这一前基因组和病毒核心中的蛋白质形成复合物。第三步涉及到利用病毒编码的P蛋白逆转录酶复制前基因组RNA，合成第一条负义链。P蛋白还作为负链DNA引物。最后，利用P蛋白DNA聚合酶的活性，以病毒RNA为引物复制第一条DNA链，合成第二条正义DNA链。前基因组还转录形成主要结构性核心蛋白的mRNA。
设计和方法37)构建能够容纳编码包膜蛋白的病人基因片段的病毒包膜蛋白表达载体在一个实施方案中，构建了能够在受转染细胞中表达HIV-1包膜蛋白的包膜表达载体。相似的表达载体以前有所报道，包括美国专利No.5,837,464和参考文献(Petropoulos等，2000)中报道的表达兼噬性鼠源白血病病毒(A-MLV)包膜蛋白的质粒(pAmphoEnv)。PAmphoEnv载体使用人巨细胞病毒(CMV)的即早基因启动子和SV40多聚腺苷酸化信号序列，在受转染细胞中产生A-MLV包膜mRNA。可以通过去掉A-MLV包膜基因，引入能够插入来源于HIV-1之类的多种分离物的病毒包膜片段的限制性酶切位点，对pAmphoEnv质粒进行改造。对于HIV-1来说，包膜的开放阅读框跨约2,600个核苷酸，编码包膜糖蛋白gp160。细胞中弗林蛋白酶类的蛋白酶对gp160进行切割，产生两个亚基gp41和gp120。HIV-1包膜表达载体可以按以下步骤进行构建(a)将包膜表达载体(pAmphoEnv)中的A-MLV包膜核酸序列替换为一个多克隆位点多聚接头可以通过限制酶的切割作用将pAmphoEnv载体中的A-MLV包膜核酸序列去掉。为了插入包膜序列，消化后的载体和双链寡核苷酸多聚接头相连接重新得以环化，其中该接头含有4个唯一存在的限制性内切酶位点(a、b、c、d)。连接反应物可以转化大肠杆菌EscherichiaColi，通过限制性图谱和DNA测序鉴定并确认包含正确多聚接头序列的分子克隆。载体中多克隆位点的引入将促进HIV-1包膜序列的插入。选用的多聚接头中的限制性位点在HIV-1包膜序列中不经常出现(LANL HIV-1数据库，www.lanl.gov)。这一载体称作pCX。通过往pCX多克隆位点中插入一个荧光素酶之类的报道基因或指示性核酸，并测定受转染细胞中指示性核酸或报道基因活性，可以证实pCX载体的功能性。这里所用的“指示性核酸”指的是编码一种直接或通过反应产生可检测或可观测信号的蛋白质、DNA或RNA结构的核酸。这些可检测或可观测信号可以是可检测波长的颜色或光，或作为指示剂的、利用任何一种定量扩增分析法即可得以扩增的特定DNA或RNA结构的产生。
(b)将病毒包膜序列插入pCX包膜表达载体利用诱变引物进行PCR扩增，得到包含有两个唯一存在的限制性位点(分别为a、b和c、d)的病毒包膜基因片段。这两个限制性位点和HIV-1包膜开放阅读框的起始密码子和终止密码子相邻。在包膜开放阅读框的两端引入两个唯一限制性位点，
可以提高包含pCX载体多克隆位点中任何一种酶的限制性位点的HIV-1包膜片段克隆的机率。
对于HIV-1来说，两种已经得以鉴定的、其包膜基因存在差别的HIV-1分子克隆可以用作PCR扩增的模板。它们是NL4-3(一种合胞体诱导的、T细胞向性的、实验室驯化的病毒株)和JR-CSF(一种非合胞体诱导的、巨噬细胞向性的原代分离物)。2,600核苷酸的扩增产物可以使用两个限制性酶(两个酶各自在片段的一个末端进行切割，如a和c或b和d)进行消化，随后通过连接并转化大肠杆菌Escherichia Coli将之插入pCX载体。包含有适当包膜序列的分子克隆可以通过限制性图谱加以鉴定，通过DNA测序加以证实。所获得的质粒pHIVenv(NL4-3)和pHIVenv(JR-CSF)可以在受转染细胞中表达HIV-1包膜蛋白(图1A)。通过测定受转染细胞中病毒包膜蛋白的合成(Western印迹分析)，或通过它们能够和包膜蛋白缺陷的逆转录病毒形成假型病毒的能力来证实pHIVenv之类包膜表达载体的功能性。有报道表明利用人胚肾293细胞系能够产生高滴度的病毒原种(Petropoulos等，2000)。然而，本发明并不限于使用那些细胞系。对于接受病人来源、编码病毒包膜蛋白的核酸转染的第一细胞来说，其它的合适细胞系包括5.25、HOX、U87、MT2、PM1、CEM等。但本发明并不仅限于这些。对细胞系最好加以改造，使之表达一种或多种辅助受体。
(c)改造pCX载体，提高病毒包膜序列的克隆效率为了提高病毒包膜基因片段的克隆效率，可以对pCX表达载体加以改造，在多克隆位点中插入一个受大肠杆菌lac启动子控制的细菌致死基因序列盒(如细胞死亡b基因的控制序列ccdB或hok致死基因家族的一个成员)(Gerdes等，1990；Bernard等，1992；Bernard等，1993)。这一改造的载体称作pCXccdB。在表达laciq阻遏蛋白的菌株，如JM109中ccdB致死基因的转录受到抑制。JM109或相当菌株可以用于扩增带有ccdB致死基因(位于lac启动子控制下)的质粒。相反的，这一系统中DH5α和Top10之类的菌株并不超表达laciq阻遏蛋白，因此不能用于扩增表达ccdB基因的质粒。ccdB活性会将转化子杀死。DH5α和Top10可以购自多个卖主(Life Technologies或Invitrogen)。利用这种选择性克隆方法，亲本表达载体在laciq菌株中得以扩增。利用两个限制性酶对载体进行消化。这两个限制性酶不但能够去除ccdB基因序列盒，对于HIV-1来说还适合HIV-1包膜序列的插入(a、b、c、d)。将载体和包膜片段相连接后，转化缺失laciq的菌株。转化后，所含质粒中ccdB致死基因为病毒包膜片段所置换的菌株能够存活；而所含质粒中保留或重构有ccdB致死基因的菌株则死亡。通过这种方式，转化菌的群体富集了包含病毒包膜插入片段的质粒，而丧失了包含ccdB基因的亲本载体。pCXccdB载体的构建对于该项目中阶段I的成功与否并不是至关重要的，但是能够大大提高病人来源HIV-1包膜序列的克隆效率，进而提高维持病毒序列异质性的可能性。pCXccdB载体的结构可以通过限制性图谱和DNA测序得以证实。
(d)将病毒包膜序列插入pCXccdB表达载体中进行病毒包膜序列和未完全消化的pCXccdB载体DNA的连接反应，评价pCXccdB载体的功能性。转化细菌之后，从单菌克隆中制备质粒DNA，用限制性酶进行消化，分析病毒包膜片段的存在和ccdB序列的不存在。通过对从马里兰州Rockville的AIDS研究和参考药剂计划(ARRRP)中获得的13个通用HIV-1克隆(pCRII-91US005.11、pCRII-91006.10、pCRII-92US657.1、pCRII-92US711.14、pCRII-91US712.4、pCRII-92US714.1、pCRII-91HT652.11、pCRII-92BR020.4、pCRII-91HT651.1A、pCRII-92HT593.1、pCRII-92HT594.10、pCRII-92HT596.4、pCRII-92HT599.24)进行包膜序列的扩增，验证了这一方法的可行性。将各个片段分别插入pCXccdB中，通过限制性图谱和/或DNA测序证实所获得的pHIVenv表达载体。各个pHIVenv载体的功能性通过测定受转染细胞中HIV-1包膜蛋白的合成(Western印迹分析)，或它们能够和包膜蛋白缺陷的逆转录病毒形成假型病毒的能力来证实。
(2)在编码包膜蛋白的区域位置包含指示性核酸的生物安全性病毒表达载体的构建为了评价病毒侵入抑制剂，按照美国专利No.5,837,464和Petropoulos等，2000描述的、用于评价PR和RT抑制剂的手段和方法构建了生物安全性病毒载体。本发明中的病毒表达载体可以和(如上所述的)包膜表达载体共转染细胞，产生高滴度的病毒原种。可以评价这种病毒原种对病毒侵入抑制剂，包括抗病毒药物和中和性抗体的敏感性。对于HIV-1来说，病毒表达载体可以从一个已鉴定的感染性HIV-1分子克隆——NL4-3产生。可以对控制病毒基因表达的5′长末端重复(LTR)加以改造，使病毒基因在转染细胞中的转录受CMV即早启动子的驱动(Naviaux等，1996)。可以将大多数包膜基因去除，但是应保留rev反应元件(RRE)、附加性蛋白质编码区(ret、tat)之类的重要控制元件。在去除包膜序列的位置，插入位于CMV启动子-增强子序列控制下的一种指示性核酸，如荧光素酶报道基因序列盒(图1B和3)。通过测定受感染细胞中荧光素酶的活性检测病毒的感染。逆转录载体之间发生质粒内部的重组，比如受转染细胞中pHIVenv序列导致产生感染性的HIV-1，这种情况虽然不太可能，但也是可信的。为了获得生物安全性载体，可以在HIV基因组中引入几个遗传突变。比如，去除大多数包膜基因；保留重要的控制序列RRE；并且去除3′LTR的U3区中转录增强子序列(图2)。逆转录病毒基因组在受感染细胞的复制过程中，位于病毒基因组3′末端的U3区作为前病毒5′LTR中U3区的模板。前病毒在5′LTR的U3区缺少强启动子元件，因此不能够在受感染细胞中产生逆转录病毒RNA。这一自我灭活(SIN)策略已经成功地用于多种逆转录病毒系统，包括HIV-1(Hwang等，1997；Miyoshi等，1998)。在本发明的分析方法中，在受感染细胞中并不需要病毒基因的表达，这是因为病毒的感染是通过测定指示性核酸产生的可检测信号，如受自身独立的启动子驱动产生的荧光素酶活性得以检测的(图1B)。通过常规的分子克隆方法即可以将包膜序列和转录增强子区(U3)去除，每种缺失都可以通过DNA序列分析进行证实。
对于HIV-1来说称作pHIVlucU3的这种载体的功能性，可以通过和上述的pHIVenv载体共转染293细胞得以证实。在受转染细胞中两种载体产生的病毒蛋白有效地进行反式互补，产生病毒颗粒。病毒颗粒可以从培养上清液中得以收集，通过Western印迹法进行分析。通过p24 ELISA、定量PCR或TaqMan分析法等常规方法对病毒滴度进行定量。
实施本发明时，产生自我灭活的病毒表达载体并不是必需的，但是这样可望提高分析方法的重复性和生物安全性。
3)鉴定表达受体和辅助受体、并可受病毒感染的适当细胞系可以对以前介绍的、可受特定病毒感染的多种哺乳动物细胞系进行评价。这里讨论的关于HIV-1的一个实施方案是通过(a)将pHIVenv和pHIVlucU3共转染第一细胞；(b)转染后收集病毒；(c)在存在或不存在病毒侵入抑制剂的条件下使用该病毒感染第二细胞；和(d)测定受感染细胞中产生的荧光素酶进行分析。
表1列出了这种评价HIV-1感染的代表性细胞系的例子，包括细胞系和相关的受体/辅助受体。这些细胞系中有一些可以从公共细胞库中得到。
从受转染的293细胞培养物收集到的病毒颗粒可以用于感染各种不同的细胞系。对于HIV-1来说，如上所述pHIVlucU3载体缺失了包膜基因和U3启动子-增强子。因此利用这种载体产生的病毒颗粒感染可受感染的细胞系仅限于一轮复制。包括(a)由上述pHIVenv载体反式产生的病毒包膜蛋白介导的病毒吸附及侵入；(b)在RT的作用下单链的病毒RNA转变为双链的DNA；和(c)病毒DNA整合到宿主细胞基因组上(前病毒形成)。可以通过去除pHIVlucU3载体中必要的病毒启动子-增强子序列，来限制前病毒整合后、受感染细胞中正常发生的、由RNA聚合酶II催化的、病毒基因的活跃转录。这种限制并不干扰受感染细胞中荧光素酶的表达，因为该基因的转录受内在CMV启动子的驱动，和病毒基因的表达相独立(图1B)。感染后所产生的荧光素酶的活性可以用于测定病毒的感染力。
HIV-1的吸附及向宿主细胞的侵入需要和主要受体(CD4)及多种辅助受体之一，经常是CCR5或CXCR4的相互作用。可以对已知表达CD4、CCR5和CXCR4各种组合的细胞系进行筛选。具体地说，就是对表1所列出的表达(a)CD4和CCR5；(b)CD4和CXCR4；和(c)CD4、CCR5和CXCR4的细胞系进行评价。只表达CD4受体和只表达CCR5或CXCR4辅助受体的细胞系，可以用作对照来评价不需要CD4结合或使用CCR5及CXCR4之外辅助受体的HIV-1分离物。判断细胞系合适性的主要标准是以所产生的荧光素酶表示的感染力(104～106相对光单位)。另外，还可以根据需要，对细胞的生长速度、生存力、稳定性和其他参数进行评价。可以选择易于培养、感染后能产生大量荧光素酶活性的细胞系，这些细胞系可以有不同的包膜受体向性，如CD4/CXCR4和CD4/CCR5。其他已经鉴定了的、支持HIV复制并表达HIV-1受体和辅助受体(如CEM-NKr-CCR5；a类)的细胞系可以从ARRRP之类的公共库中获得。
另外，可以利用常规的方法加强细胞的可感染性。如往细胞中加入polybrene促进感染(Porter等，1998)。例如，在HIV情况下，可以使用HIV-1实验室保存株进行感染，将重组蛋白病毒感染滴度和具有感染性的HIV-1的感染滴度进行比较，对其他潜在的细胞系加以鉴定。也可以直接用这里所述的病毒表达质粒转染细胞，对所产生的病毒进行评分，鉴定其他潜在的细胞系。可以使用定量RT-PCR分析法检测积累的病毒转录物。对适合其他病毒的细胞系以同样的方法进行鉴定。
本发明可以利用自动操作来优化分析条件，实现病人样本的高通量试验。可以对样本制备方法进行优化，以便有效地获得病毒基因组和包膜RNA。可以对RT-PCR条件进行优化，以便在病毒上样量较低时(～500拷贝/mL)扩增到病人来源的病毒包膜序列，如HIV-1包膜序列(～2,600碱基对)。
4)分析方法的用途的例示从下面试验中得到的结果可以说明本发明中分析方法的实用性(1)在已知病毒抑制剂存在的条件下验证对病毒侵入的剂量依赖性抑制作用；(2)在已知HIV-1中和性抗体存在的条件下验证对感染的剂量依赖性抑制作用。
对本发明中病毒侵入分析方法的下列应用进行评价i)测定病毒吸附和侵入抑制剂(包括融合、受体和辅助受体抑制剂)对病毒复制的抑制作用；ii)测定对HIV-1吸附和侵入抑制剂敏感性的变化；和iii)测定疫苗应答过程中产生的抗HIV-1包膜蛋白的抗体的中和活性。
在一个优选实施方案中，通过下列步骤进行该分析(a)将pHIVenv和pHIVlucU3载体共转染第一细胞；(b)转染48h后收集病毒；(c)在病毒侵入抑制剂存在或不存在的条件下，使用该病毒感染第二细胞；和(d)转染约48h～72h后测定所产生的荧光素酶活性。可以使用96孔板评价多个浓度的病毒侵入抑制剂对HIV-1复制的剂量依赖性抑制作用。根据经验，测定每种抑制剂的合适浓度范围。用荧光素酶活性抑制百分率和药物浓度(log10)对数据进行作图。利用计算机软件对数据进行分析。使用抑制曲线计算特定药物或抗体的50％抑制浓度(IC50)(图6)。
如上所述使用构建好的pHIVenv载体评价从各种已知HIV-1分离物中获得的包膜蛋白。为了确定辅助受体向性，在HIV-1的情况下，如上所述评价对表达CD4和CXCR4、CD4和CCR5的细胞进行的感染。已知抑制HIV-1侵入的许多化合物(表2)，包括磺酸盐聚阴离子(硫酸葡聚糖和肝素)之类的非特异性试剂都可用于本发明的分析。趋化因子Rantes和SDF-1分别是趋化因子受体CCR5和CXCR4的天然配体(参见Alkhatib等，1996；Bleul等，1996)，也适用于本发明的分析。另外，病毒侵入抑制剂T-20和T-1249(Trimeris，Inc)、PRO 542(Progenics)、5a8(Tanox)等也用于评价本发明分析法的实用性。
使用常规的生存力分析法或细胞毒分析法(如染料排斥、MTS、ATP)评价药物在靶细胞中的毒性。
对融合抑制剂T-20的敏感性下降的HIV-1突变体(Rimsky等，1998)和使病毒在药物存在的条件下能够复制的、包膜蛋白(gp41-TM)中遗传决定簇(突变)已见有报道。为了说明本发明中的分析方法能够测定药物敏感性(即耐药性)的变化，(a)构建了带有突变包膜基因的pHIVenv载体；(b)使用这些载体和pHIVlucU3载体共转染第一细胞；(c)收集包含突变包膜蛋白的病毒；和(d)在T20存在的条件下测定病毒的感染力。通过将包含突变包膜蛋白的病毒的IC50和缺失明确耐药突变的病毒的IC50进行比较，评价对T20敏感性的降低。包含耐药突变的包膜蛋白的病毒和缺失耐药突变的包膜蛋白的病毒相比，IC50值较高，也就是说抑制作用需要较高的药物浓度(和图8中的数据相当)。可以按照常规方案，采用常规的定点诱变技术往包膜表达载体(pHIVenv)中引入耐药突变(Petropoulos等，2000；Ziermann等，2000)。
保护肌体免受HIV-1感染的有效疫苗能够激发一种以广泛交叉反应的中和性抗体为特征的强体液免疫应答，这一点是大家所公认的。随后，以常规方法测定接种个体的血清中高滴度、抗免疫原的中和性抗体的存在。最近，利用HIV-1/猴免疫缺陷病毒(SIV)嵌合病毒猕猴模型(SHIV)，Mascola和同事发现粘膜激发后这种中和性抗体的被动转运使病毒负荷减少(Mascola等，2000)。本发明的分析方法可用于快速、可靠地测定以包膜抗原，如HIV-1包膜抗原为靶点的疫苗所激发产生抗体的病毒中和活性。例如，本发明中的分析方法可以(a)产生表达各种已鉴定包膜蛋白的pHIVenv载体；(b)将这些载体和pHIVlucU3载体共转染第一细胞；(c)收集病毒，将之和系列稀释的抗体制剂或疫苗血清一起孵育；(d)在第二细胞中验证这些病毒的感染力。如前文和文献中所述进行数据分析和IC50的计算。在HIV-1的情况下，可以选择代表不同HIV-1遗传背景、不同细胞和辅助受体向性(巨噬细胞/CCR5、T细胞/CXCR4)和不同包膜特性(合胞体和非合胞体诱导的，实验室培养的或原代分离物)的病毒(如进化枝(clade)A、B、C、D、E、F) (表2)。制备具有一定滴度的病毒原种，通过加入约20～100 TCID50/孔的病毒、并根据需要作相应调整来优化分析方法的灵敏性和可重复性是有益的。根据前面所列的它们中和原代分离物的中和特性或功能，或它们和特异gp120或gp41表位相结合的物理特性选择抗体制剂(表2)。根据科研文献中所述的、传统病毒中和分析中已鉴定的抗体试剂的活性判断本发明中分析方法的性能。从具有广泛代表性HIV-1受感染人群获得的血清可以用于设定血清稀释的合适范围，从而使分析方法的敏感性达到最大，而细胞毒性最小。利用常规的生存力分析法或细胞毒分析法(如染料排斥、MTS、ATP)测定细胞毒性。
下文提供了一些实施例，以进一步说明并解释本发明。这些实施例对本发明构成任何限制。
实施例1测定对HIV-1侵入抑制剂的表型药物敏感性本实施例提供了一种准确、可重复地测定对HIV-1吸附和侵入(在此以前概括性地称作侵入)抑制剂的敏感性的手段和方法。根据本实施例，测定对HIV-1侵入抑制剂的敏感性的手段和方法适用于其他病毒，包括包括慢病毒(如HIV-2)、其他逆转录病毒(如HTLV-1和HTLV-2)、噬肝DNA病毒(如人乙型肝炎病毒)、黄病毒(如人丙型肝炎病毒)和疱疹病毒(如人巨细胞病毒)，但不仅限定于这些病毒。本实施例进一步提供了一种测定对侵入抑制剂的敏感性变化(增加或降低)的手段和方法。
使用这里以文献方式引用的美国专利No.5,837,464(国际公开号WO 97/27319)中介绍的表型药物敏感性和耐药性试验法进行侵入抑制剂敏感性的测定。
设计一种载体，一种包膜表达载体(pHIVenv)，该载体表达由病人来源的HIV包膜序列编码的包膜多聚蛋白(gp160)(图1)。随后gp160由细胞内蛋白酶切割产生组成HIV-1病毒颗粒表面包膜蛋白的表面亚基(gp120SU)和跨膜亚基(gp41TM)。设计了第二载体，一种病毒表达载体(pHIVluc或pHIVlucU3)，该载体表达基因组和亚基因组病毒RNAs和除包膜多聚蛋白之外的所有HIV蛋白质(图1A-1B)。
在本申请中，病人来源的基因片段对应于HIV-1包膜多聚蛋白(gp160)的编码区(～2.5kB)，可以是(a)利用从受HIV感染的病人中得到的病毒RNA、通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到的包膜序列；或者(b)来源于包含特定突变的HIV-1分子克隆的包膜序列，该突变是通过定点诱变向亲本分子克隆(典型地是NL4-3)中引入的。
利用常规的方法(如Madison，Promega的RNAgent总RNA分离系统或TX，Friendswood，Tel-Test的RNAzol)提取病毒RNA。RT-PCR方案分两个步骤进行。使用一种逆转录酶[如Superscript II(Invitrogen，Life Technologies)、Moloney MuLV逆转录酶(RocheMolecular Systems，Inc，Branchburg，NJ)或禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)]将病毒RNA拷贝成第一链cDNA。使用一种热稳定的DNA聚合酶[如Taq(RocheMolecular System，Inc，Branchburg，NJ)、Tth(Roche Molecular System，Inc，Branchburg，NJ)、PrimeZyme(从Thermus brockianus中分离，Biometra，Gottingen，Germany)]或按照“长PCR”方法(Bames，W.M.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 91，2216-2220)联合使用热稳定的聚合酶[如Expand High Fidelity PCR系统(Taq+Pwo)(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)或GeneAmp XL PCR试剂盒(Tth+Vent)(Roche Molecular Systems，Inc，Branchburg，NJ)，Advantage-2(CloneTech)]将cDNA扩增至高拷贝数。
用Oligo-dT将病毒RNA逆转录成第一链cDNA。使用包膜PCR引物正向引物Xho/Pin和反向引物Mlu/Xba(表3)扩增病人来源的基因片段。这些引物意在扩增编码gp160包膜多聚蛋白的～2.5kB包膜基因，同时在PCR扩增产物的5′末端引入Xho I和Pin AI识别位点，在PCR扩增产物的3′末端引入Mlu I和Xba I位点。
对美国专利No.5,837,464(国际公开号WO 97/27319)中所述方法略加改动，通过限制性内切酶消化、DNA连接和细菌转化法将病人来源的基因片段(2.5kB包膜序列扩增产物)插入HIV-1包膜表达载体中。利用5′末端的Xho I或Pin AI和3′末端的Mlu I或Xba I对～2.5kB扩增产物进行消化。利用DNA连接酶，将产生的消化产物连接到改造的pCXAS或pCXAT表达载体的5′Xho I/Pin AI和3′Mlu I/XbaI位点上。(在基础专利的CPT中，我认为是美国专利号No.5,837,464(国际公开号WO 97/27319)的实施例6)对pCXAS和pCXAT载体的构建作了介绍。改造后的pCXAS和pCXAT载体除了含有pCXAS和pCXAT载体中的Xho I、Mlu I和Xba I等限制性位点外，还含有一个Pin AI限制性位点。通过定点诱变，将Pin AI位点引入到了Xho I和Mlu I位点之间，因此，从5′末端到3′末端四个位点的顺序依次为Xho I、Pin AI、Mlu I和Xba I。在一个优选的实施方案中，利用Pin AI和Mlu I对2.5kB扩增产物进行消化，连接到改造的pCXAS表达载体的5′Pin AI和3′Mlu I位点上。连接反应的产物转化大肠杆菌E.Coli。在30℃～37℃的温度下温育24h～36h后，从E.Coli培养物中纯化表达载体质粒DNA。为了保证表达载体制剂完全代表在给定病人血清中存在的HIV准物种，收集了许多(＞100)单克隆E.Coli转化子，从中提取pHIVenv质粒DNA。以这种方式收集的、用于表达病人病毒来源的包膜蛋白的载体总称为pHIVenv(图1和图3)。
设计基因组HIV表达载体pHIVluc和pHIVlucU3，以便转录HIV基因组RNA和亚基因组mRNA，并表达除包膜多聚蛋白之外的所有HIV蛋白质(图1B)。在这些载体中，去除了部分包膜基因，以插入一个功能性的指示基因序列盒。此处使用“萤火虫荧光素酶”检测抗病毒药物存在或不存在的条件下病毒的复制能力。在pHIVlucU3中，去除了部分3′U3区，以阻断受感染细胞中病毒RNAs从5′LTR的转录。
HIV-1侵入抑制剂的敏感性分析法使用由人胚肾细胞系293(细胞培养机构，UC SanFrancisco，SF，CA)组成的包装宿主细胞；和由一种表达CD4(HT4)、CCR5及CXCR4的人类骨肉瘤(HOS)细胞系或表达CD4和CCR5或CD4和CXCR4的星形细胞瘤(U-87)细胞系组成的靶宿主细胞。
利用pHIVenv、pHIVluc或pHIVlucU3进行药物敏感性试验。通过转染一种包装宿主细胞(HEK293)，产生假型HIV病毒颗粒。该病毒颗粒含有病人来源的基因片段编码的包膜蛋白。转染后(～48h)收集病毒颗粒，并用之感染表达HIV受体(即CD4)和辅助受体(即CXCR4、CCR5)的靶细胞(HT4/CCR5/CXCR4或U-87/CD4/CXCR4或U-87/CD4/CCR5)。感染后(～72h)将靶细胞裂解，测定其荧光素酶活性。HIV必须完成一轮复制才能成功地感染靶细胞，产生荧光素酶活性。受感染细胞中测得的荧光素酶的活性是反映“感染力”的直接指标(图1和图2)。如果由于某种原因(如缺少合适的受体或辅助受体、存在抑制性药物活性和中和性抗体的结合)使病毒不能够侵入靶细胞，则荧光素酶活性降低。通过将药物不存在时的感染力和药物存在时的感染力进行比较，评价药物敏感性。通过将“受试”病毒感染力和来源于NL4-3或HXB2之类的一种HIV-1分子克隆的、已得以鉴定的参照病毒(野生型)感染力相比较，对相对药物敏感性进行定量。
将包装宿主细胞接种在直径为10cm的平皿中，铺板1天后使用pHIVenv、pHIVluc或pHIVlucU3对细胞进行转染。利用磷酸钙共转染法进行转染。转染后1h～24h之间，将含有DNA沉淀的细胞培养基更换为新鲜的培养基。一般在转染后2天收集包含病毒颗粒的细胞培养基，并使用0.45mm的滤膜进行过滤。在感染前，将靶细胞铺到细胞培养基内。一般在感染时(有时在感染前一天)加入侵入抑制剂药物。典型地，感染3天之后利用Steady-Glo试剂(Promega)和荧光仪分析荧光素酶的活性。
在一个实施方案中，说明了对融合抑制剂药物(T-20，也称为DP178；Trimeris，Research Triangle Park，NC)的敏感性(图6)。在不存在T-20和存在不同浓度T-20(X-轴log10刻度值)的条件下，分别感染表达CD4、CCR5和CXCR4的靶细胞(HT4/CCR5/CXCR4)。通过将T-20存在的条件下产生的荧光素酶活性和无T-20存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。受试病毒为R5向性(JRCSF，91US005.11)、X4向性(NL4-3，92HT599.24)和双重向性(92HT593.1)病毒。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的T-20浓度(IC50，图6中以垂直的虚线表示)对药物的敏感性进行定量。具有较低IC50值的病毒对T-20的敏感性高于具有较高IC50值的病毒。
在更进一步的实施方案中，可以测定病毒对多种侵入抑制剂的敏感性。这些抑制剂包括表4(抗HIV药物表)中列出的药物和化合物，但不局限于此表中的抑制剂。
在第二个实施方案中，说明了对属于4-(哌啶-1-基)丁烷类化合物的、一种CCR5抑制剂的敏感性(Dorn，C等，(2001)；Finke P.E.等，(2001)；Merck West Point，PA)。在不存在CCR5抑制剂和存在不同浓度CCR5抑制剂(X-轴log10刻度值)的条件下，感染表达CD4和CCR5(R5细胞)的靶细胞(U-87/CD4/CCR5)。通过将CCR5抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶活性和无CCR5抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。受试病毒为R5向性(JRCSF，91US005.11)、X4向性(NL4-3，92HT599.24)和双重向性(92HT593.1)病毒。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的CCR5抑制剂浓度(IC50，图8中以垂直的虚线表示)对药物的敏感性进行定量。具有较低IC50值的病毒对CCR5抑制剂的敏感性高于具有较高IC50值的病毒。X4向性病毒不感染U-87/CD4/CCR5靶细胞。
在第三个实施方案中，说明了对CXCR4抑制剂(AMD3100；AnorMED)的敏感性。在不存在CXCR4抑制剂和存在不同浓度CXCR4抑制剂(X-轴log10刻度值)的条件下，感染表达CD4和CXCR4的靶细胞(U-87/CD4/CCR5)。通过将CCR5抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶活性和无CXCR4抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。受试病毒为R5向性(JRCSF)、X4向性(NL4-3)和双重向性(92HT593.1)病毒。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的CCR5抑制剂浓度(IC50，图9中以垂直的虚线表示)对药物的敏感性进行定量。具有较低IC50值的病毒对CXCR4抑制剂的敏感性高于具有较高IC50值的病毒。R5向性病毒不感染U-87/CD4/CXCR4靶细胞。
可以测定对CD4抑制剂(如鼠源单克隆抗体5A8；Tanox，Houston，TX)的敏感性。在不存在CD4抑制剂和存在不同浓度CD4抑制剂(X-轴log10刻度值)的条件下，感染表达CD4和一种或两种辅助受体的靶细胞(HT4/CCR5/CXCR4、U-87/CD4/CXCR4或U-87/CD4/CCR5)。通过将CD4抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶活性和无CD4抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。受试病毒可为R5向性(如JRCSF)、X4向性(如NL4-3)和双重向性(如92HT593.1)病毒。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的CD4抑制剂浓度(IC50)对药物的敏感性进行定量。具有较低IC50值的病毒对CD4抑制剂的敏感性高于具有较高IC50值的病毒。
实施例2新的病毒侵入抑制剂的发现、优化和表征在一个实施方案中，病毒侵入分析法可以用于鉴定抑制病毒侵入的新化合物/化学实体。大的化学文库中各个成员存在的条件下，感染表达CD4和一种或两种辅助受体的靶细胞(如HT4/CCR5/CXCR4、U-87/CD4/CXCR4或U-87/CD4/CCR5)(高通量筛选，HTS)。通过将特定化合物存在的条件下产生的荧光素酶活性和无特定化合物存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定化合物抑制病毒复制(一次“击中(hit)”)的能力。
在一个进一步的实施方案中，可以使用病毒侵入分析法对通过HTS鉴定到的先导化合物的抗病毒活性进行优化。经化学修饰的先导化合物衍生物可以作为受试化合物，鉴定病毒侵入抑制活性有所提高的特定衍生物。在不存在抑制剂候选物和存在不同浓度抑制剂候选物(X-轴log10刻度值)的条件下，感染表达CD4和一种或两种辅助受体的靶细胞(如HT4/CCR5/CXCR4、U-87/CD4/CXCR4或U-87/CD4/CCR5)。通过将候选物存在的条件下产生的荧光素酶活性和无抑制剂候选物存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的抑制剂候选物浓度(IC50)对药物的敏感性进行定量。和具有较高IC50值的衍生物相比，具有较低IC50值的衍生化合物是更强的病毒侵入抑制剂(具有更高的抗病毒活性)。
在更进一步的实施方案中，病毒侵入分析法可以用于表述新病毒抑制剂药物候选物作用的机制特征，其中这些候选物对广谱病毒的抗病毒活性在敏感性上可能会有差别。在不存在新侵入抑制剂药物候选物和存在不同浓度侵入抑制剂药物(X-轴log10刻度值)的条件下，感染表达CD4和一种或两种辅助受体的靶细胞(如HT4/CCR5/CXCR4、U-87/CD4/CXCR4或U-87/CD4/CCR5)。通过将新侵入抑制剂存在的条件下产生的荧光素酶活性和无新侵入抑制剂存在的条件下、受感染细胞中产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。受试病毒为R5向性(如JRCSF)、X4向性(如NL4-3)和双重向性(如92HT593.1)病毒。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的CD4抑制剂浓度(IC50)对药物的敏感性进行定量。
为了确定新侵入抑制剂是否通过阻断CCR5或CXCR4辅助受体发挥作用，在U-87/CD4/CCR5细胞中检验R5向性病毒对新抑制剂的敏感性；在U-87/CD4/CXCR4细胞中检验X4向性病毒对新抑制剂的敏感性。对R5病毒感染的抑制作用说明拮抗了CCR5辅助受体，而对X4病毒感染的抑制作用表明拮抗了CXCR4辅助受体。对R5和X4双重向性病毒感染的抑制作用表明或者拮抗了CD4，或者抑制了膜融合。
为了分析新抑制剂对抗耐药性病毒，即对其他同类型或不同类型病毒侵入抑制剂表现出耐药性或敏感性降低的病毒的活性，在病毒侵入分析法中使用新病毒侵入抑制剂对多组耐药性病毒进行试验。各组可以包括对CCR5抑制剂、CXCR4抑制剂、CD4抑制剂和膜融合抑制剂具有不同敏感性的病毒。各组也可以包括具有和一个或多个特异性突变的病毒，所述突变和病毒对一个或多个侵入抑制剂敏感性的降低/耐药相关。
实施例3鉴定改变病毒侵入抑制剂敏感性的包膜氨基酸替换/突变本实施例提供了一种鉴定HIV-1包膜中赋予病毒侵入抑制剂敏感性降低/耐药性的突变的手段和方法。本实施例还提供了一种对由特定包膜突变所致的侵入抑制剂敏感性降低程度进行定量的手段和方法。
在侵入分析法中对来源于病人样本的包膜序列，或来源于病人样本的单个克隆，或通过定点诱变进行人工改造使含有特定突变的包膜序列进行试验，根据参照标准(如NL4-3、HXB2)对药物敏感性进行定量。
在一个实施方案中，评价了对纵向病人样本(在不同时间点从同一病人收集的病毒)的敏感性。例如，在开始治疗之前，药物治疗变化之前或之后，或疾病恶化的病毒标记物(RNA拷贝数)、免疫标记物(CD4T细胞)或临床标记物(条件性感染)变化之前或之后测定对侵入抑制剂的敏感性。
病人HIV样本的基因型分析可以使用任何广泛采用的DNA测序法对代表病人样本库的包膜序列，或来源于病人库的克隆进行分析。在本发明的一个实施方案中，通过病毒RNA纯化、RT-PCR和双脱氧核苷酸链末端测序化学和毛细管凝胶电泳(Applied Biosystems，Foster City，CA)测定病人HIV样本序列。将病人病毒库的包膜序列或克隆，和参照序列、其他病人样本或可能会有的、来源于治疗之前同一病人的样本相比较。验证与参照序列或处理前序列不同的序列的基因型，并和侵入抑制剂敏感性的差异相对应。
定点突变体的侵入抑制剂敏感性通过在明确的、药物敏感的遗传背景基础(如NL4-3参照株)上构建含有特定突变的包膜表达载体(pHIVenv)，对和适合度变化相关的基因型变化进行评价。突变可以单独引入，和/或同其他调节侵入抑制剂敏感性的突变联合引入。使用任何一种广为有效的定点诱变方法将包膜突变引入到pHIVenv载体中。在本发明的一个实施方案中，使用了用于定点诱变的mega引物PCR法(Sarkar G和SummerS.S.，1990)。使用实施例1中介绍的病毒侵入分析法对包含特定包膜突变或突变组的pHIVenv载体进行试验。将含有包膜突变的病毒的药物敏感性和不含受评价突变、遗传上具有明确药物敏感性的病毒的药物敏感性相比较。观察到的侵入抑制剂敏感性变化应归因于pHIVenv载体中引入的特定突变所致。
在本发明的一个实施方案中，说明了由gp41包膜蛋白中药物抗性突变所赋予的融合抑制剂T-20敏感性降低(图7)。在不存在T-20和存在不同浓度T-20(X-轴log10刻度值)的条件下，分别感染表达CD4、CCR5和CXCR4的细胞。通过将T-20存在的条件下产生的荧光素酶活性和无T-20存在的条件下产生的荧光素酶活性相比较，测定对病毒复制的抑制百分率(Y轴)。受试病毒为gp41跨膜包膜蛋白中包含一个或两个特定突变的同基因病毒(在图注中以红色标出；Rimsky et al.，J.Virol.72986-993)。通过测定病毒复制抑制率为50％时所需的T-20浓度(IC50，以垂直的虚线表示)对药物的敏感性进行定量。具有较低IC50值的病毒对T-20的敏感性高于具有较高IC50值的病毒。
在一个实施方案中，向已知的X4向性(NL4-3)和R5向性(JRCSF)病毒中引入耐药突变。使用病毒侵入分析法测定T-20敏感性(图7)。受试病毒的IC50除以HIV-1 HXB2株的IC50，计算各病毒T-20敏感性的倍数变化。在科研文献中曾报道了类似突变病毒的T-20敏感性(Rimsky等)。在此实施方案中，gp41的GIV基序中存在一个突变的病毒(DIV、GIM、SIV)和野生型病毒相比，对T-20的敏感性较低(图11)。GIV基序中含有两个突变的病毒(DIM、SIM、DTV)和GIV基序中含有一个突变或不含突变的病毒相比，对T-20的敏感性较低(图11)。
在另一个实施方案中，通过测定敏感性和耐药性病毒的包膜基因序列，对导致侵入抑制剂敏感性降低(或增加)的突变进行鉴定。将由敏感性和耐药性病毒所推断的氨基酸序列相比较，鉴定候选的耐药突变。通过往药物敏感性病毒中引入突变并在病毒侵入分析中测定突变病毒的敏感性，以确认或否定特定突变导致药物敏感性改变的能力。在本例中，HIV-1 gp41跨膜包膜蛋白的第一个七肽重复(HR-1)中一小段氨基酸和病毒对T-20表现出不同的敏感性相关(图11)。标出的氨基酸是已知能导致T-20敏感性降低的突变。
可以使用相似的表型和基因型分析法鉴定(a)改变/影响CCR5或CXCR4抑制剂敏感性的；(b)改变/影响特定X4、R5和双重向性的；和(c)刺激中和性抗体产生的包膜氨基酸序列。
在一个实施方案中，表明了由特定包膜氨基酸序列/突变所导致的辅助受体(CCR5、CXCR4)抑制剂敏感性的下降。
在另一个实施方案中，表明了由特定包膜氨基酸序列/突变所导致的受体(CD4)抑制剂敏感性的下降。
实施例4测定HIV-1辅助受体和受体向性本实施例提供了一种测定HIV-1辅助受体向性的手段和方法。本实施例还提供了一种HIV-1受体向性的手段和方法。
在一个实施方案中，鉴定使用CCR5辅助受体的病毒。在一个相关的实施方案中，鉴定使用CXCR4辅助受体的病毒。在一个进一步的相关实施方案中，鉴定使用CCR5和CXCR4的病毒。在一个进一步的相关实施方案中，鉴定使用CCR5和CXCR4以外的辅助受体的病毒。
在另一个实施方案中，鉴定使用CD4受体的病毒。在一个相关的实施方案中，鉴定使用CD8的病毒。在一个进一步的相关实施方案中，鉴定不需要CD4或CD8就能感染细胞的病毒。
在本实施方案中，使用两个细胞系进行该分析。一个细胞系表达CD4和CCR5(U-87/CD4/CCR5)，本申请中亦称之为R5细胞。另一个细胞系表达CD4和CXCR4(U-87/CD4/CXCR4)，本申请中亦称之为X4细胞。使用从pHIVenv和pHIV luc或pHIVlucDU3转染细胞中获得的重组病毒原种感染各类型细胞培养物，进行病毒侵入分析。PHIVenv载体包含病人病毒来源的序列，表达HIV-1包膜蛋白(gp120SU、gp41TM)。在此实施方案中，使用在96孔板中培养的R5和X4靶细胞对病毒进行评价(图3A)。典型地，在感染前一天将R5和X4细胞铺在板子上。在不存在药物的条件下(无药物)，存在抑制性浓度的、优先地抑制R5向性病毒的药物(CCR抑制剂，如哌啶1基丁烷化合物)的条件下，和存在抑制性浓度的、优先地抑制X4向性病毒的药物(CXCR4抑制剂，如AMD3100)的条件下使用各种病毒原种进行感染。将存在和不存在药物的条件下，各细胞类型产生的荧光素酶活性进行比较来评价辅助受体向性。在此实施方案中，通过将各病毒优选感染(产生荧光素酶活性)R5细胞或X4细胞或同时感染X4及R5细胞(病毒为双重向性的情况下)的能力相比较，对分析结果进行解释。另外此实施例还评价了CCR5抑制剂或CXCR4抑制剂特异性阻断感染(抑制荧光素酶活性)的能力(图3B)。在此实施方案中，X4向性病毒感染X4细胞，而不感染R5细胞。对X4细胞的感染为CXCR4抑制剂(AMD3100)所阻断。在此实施方案中，R5向性病毒感染R5细胞，而不感染X4细胞。对R5细胞的感染为CCR5抑制剂(哌啶-1-基丁烷化合物)所阻断。在此实施方案中，双重向性病毒或X4向性和R5向性病毒混合物感染X4和R5细胞，对R5细胞的感染为CCR5抑制剂所阻断，对X4细胞的感染为CXCR4抑制剂所阻断。在此实施方案中，无存活力的病毒在X4或R5细胞中均不能复制(不产生荧光素酶活性)。
在另一个实施方案中，利用三种或多种细胞系进行分析。一个细胞系表达CD4和CCR5(U87/CD4/CCR5)，本申请中亦称之为R5细胞。另一个细胞系表达CD4和CXCR4(U87/CD4/CXCR4)，本申请中亦称之为X4细胞。还有一个细胞系表达CD4和其他候选HIV-1辅助受体，包括BONZO、BOB等，但并不只限于这些。参见表1。后一细胞系表达其他的候选辅助受体，而不表达CCR5或CXCR4。使用从pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucDU3载体转染细胞中获得的重组病毒原种感染各类型细胞培养物，进行病毒侵入分析。PHIVenv载体包含病人病毒来源的序列，表达HIV-1包膜蛋白(gp120SU、gp41TM)。在此实施方案中，使用在96孔板中培养的R5和X4靶细胞对病毒进行评价。在R5细胞；X4细胞和表达CD4及候选辅助受体的细胞系中使用各病毒原种进行感染。对各细胞类型产生的荧光素酶活性进行比较来评价辅助受体向性。在此实施方案中，通过将各病毒优选感染(产生荧光素酶活性)R5细胞或X4细胞或表达候选辅助受体的细胞系的能力相比较，对分析结果进行解释。在此实施方案中，X4向性病毒感染X4细胞，而不感染R5细胞。在此实施方案中，R5向性病毒感染R5细胞，而不感染X4细胞。在此实施方案中，双重向性病毒或X4向性和R5向性病毒混合物感染X4和R5细胞。在此实施方案中，表达可替换候选辅助受体的细胞系的感染归因于可替换辅助受体的向性。在此实施方案中，无存活力的病毒在X4或R5细胞中均不能复制。
在另一个实施方案中，利用四种细胞系进行分析。一个细胞系表达CD4和CCR5(U-87/CD4/CCR5)，本申请中亦称之为R5细胞。第二个细胞系表达CD4和CXCR4(U-87/CD4/CXCR4)，本申请中亦称之为X4细胞。第三个细胞系表达CD8和CCR5(U-87/CD8/CCR5)，本申请亦称之为CD8/R5细胞。第四个细胞系表达CD8和CXCR4(U-87/CD8/CXCR4)，本申请亦称之为CD8/X4细胞。使用从pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucDU3载体转染细胞中获得的重组病毒原种感染各类型细胞培养物，进行病毒侵入分析。PHIVenv载体包含病人病毒来源的序列，表达HIV-1包膜蛋白(gp120SU、gp41TM)。在此实施方案中，使用在96孔板中培养的细胞对病毒进行评价。在R5细胞、X4细胞、CD8/R5细胞和CD8/X4细胞中使用各病毒原种进行感染。对各细胞类型产生的荧光素酶活性进行比较来评价辅助受体向性。在此实施方案中，通过将各病毒优选感染(产生荧光素酶活性)R5细胞、X4细胞、CD8/R5细胞或CD8/X4细胞的能力相比较，对分析结果进行解释。在此实施方案中，CD4向性病毒感染X4细胞和/或R5细胞。在此实施方案中，CD8向性病毒感染CD8/R5细胞和/或CD8/X4细胞。在此实施方案中，双重向性病毒(使用CD4和CD8受体)感染X4向性和/或R5向性细胞及CD8/X4和/或CD8/R5细胞。在此实施方案中，表达CD8而非CD4的细胞系的感染归因于CD8受体的向性。在此实施方案中，无存活力的病毒在X4或R5细胞中均不能复制。
在一个进一步的相关实施方案中，使用两种细胞系进行分析。一个细胞系表达CD4、CCR5和CXCR4(HT4/CCR5/CXCR4)。第二个细胞系表达CD8、CCR5和CXCR4(HOS/CD8/CCR5/CXCR4)。使用从pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucDU3转染细胞中获得的重组病毒原种感染各类型细胞培养物，进行病毒侵入分析。PHIVenv载体包含病人病毒来源的序列，表达HIV-1包膜蛋白(gp120SU、gp41TM)。在此实施方案中，使用在96孔板中培养的细胞对病毒进行评价。在HT4/CCR5/CXCR4和HOS/CD8/CCR5/CXCR4细胞中进行各病毒原种的感染。对各细胞类型产生的荧光素酶活性进行比较来评价辅助受体向性。在这一个实施方案中，通过将各病毒优选感染(产生荧光素酶活性)HT4/CCR5/CXCR4或HOS/CD8/CCR5/CXCR4细胞的能力相比较，对分析结果进行解释。在此实施方案中，CD4向性病毒感染HT4/CCR5/CXCR4细胞，而不感染HOS/CD8/CCR5/CXCR4细胞。在此实施方案中，CD8向性病毒感染HOS/CD8/CCR5/CXCR4细胞，而不感染HT4/CCR5/CXCR4细胞。在此实施方案中，双重向性病毒(使用CD4和CD8受体)感染HT4/CCR5/CXCR4和HOS/CD8/CCR5/CXCR4细胞。在此实施方案中，表达CD8而非CD4的细胞系的感染归因于CD8受体的向性。在此实施方案中，无存活力的病毒在X4或R5细胞中均不能复制。
在另一个实施方案中，使用两种细胞系进行分析。一个细胞系表达CD4、CCR5和CXCR4(HT4/CCR5/CXCR4)。第二个细胞系表达CCR5和CXCR4，而不表达CD4或CD8(HOS/CCR5/CXCR4)。使用从pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucDU3转染细胞中获得的重组病毒原种感染各类型细胞培养物，进行病毒侵入分析。PHIVenv载体包含病人病毒来源的序列，表达HIV-1包膜蛋白(gp120SU、gp41TM)。在此实施方案中，使用在96孔板中培养的细胞对病毒进行评价。在HT4/CCR5/CXCR4和HOS/CCR5/CXCR4细胞中进行各病毒原种的感染。对各细胞类型产生的荧光素酶活性进行比较来评价CD4和CD8非依赖性的感染。在此实施方案中，通过将各病毒优选感染(产生荧光素酶活性)HT4/CCR5/CXCR4或HOS/CCR5/CXCR4细胞的能力相比较，对分析结果进行解释。在此实施方案中，CD4依赖性病毒感染HT4/CCR5/CXCR4细胞，而不感染HOS/CCR5/CXCR4细胞。在此实施方案中，CD4非依赖性病毒感染HOS/CCR5/CXCR4细胞和HT4/CCR5/CXCR4细胞。在此实施方案中，双重向性病毒(使用CD4和CD8受体)感染HT4/CCR5/CXCR4和HOS/CD8/CCR5/CXCR4细胞。在此实施方案中，对不表达CD4的细胞系的感染归因于CD4非依赖性的感染。在此实施方案中，无存活力的病毒在X4或R5细胞中均不能复制。
实施例5鉴定改变辅助受体和受体向性的HIV-1包膜氨基酸替换/突变本实施例提供了一种鉴定能够指定使用或改变辅助受体向性(X4对R5对双重X4/R5)的HIV-1包膜氨基酸序列的手段和方法。本实施例还提供了一种鉴定能够指定使用CXCR4或CCR5之外辅助受体使用的HIV-1包膜氨基酸序列的手段和方法。本实施例还提供了一种鉴定能够指定使用或改变受体向性(CD4对CD8)的HIV-1包膜序列的手段和方法。
如实施例4所述，在侵入分析中对来源于病人样本的包膜序列、或来源于病人样本的单个克隆、或通过定点诱变使含有特定突变的人工改造包膜序列进行试验，测定辅助受体向性。
在一个实施方案中，评价纵向病人样本(在不同的时间点从同一病人体内收集的病毒)的辅助受体向性。例如，在开始治疗之前，药物治疗变化之前或之后，或疾病恶化的病毒性标记物(RNA拷贝数)、免疫性标记物(CD4 T细胞)或临床性标记物(条件性感染)变化之前或之后测定辅助受体向性。
在另一个实施方案中，对大量不同病例收集而得的样本进行辅助受体向性分析。在一进一步的实施方案中，对从许多不同病人中收集的、代表不同病毒和病人群体的样本进行辅助受体向性评价。这些病人群体可能包括刚受感染的病人、慢性感染病人、重症病人和接受抗逆转录病毒或免疫治疗的病人，但不只限于这些病人。这些病毒群体可包括具有不同遗传特征的病毒(进化枝A、B、C、D、E、F、G)、对抗逆转录病毒药物敏感的病毒、对抗逆转录病毒敏感性下降/耐药的病毒，但不仅限于这些。
病人HIV样本的基因型分析可以使用广泛采用的DNA测序法对代表病人样本库的包膜序列，或来源于病人库的克隆进行分析。在本发明的一个实施方案中，通过病毒RNA纯化、RT-PCR和双脱氧核苷酸链末端测序化学和毛细管凝胶电泳(Applied Biosystems，Foster City，CA)测定病人HIV样本序列。将病人病毒库的包膜序列或克隆，和参照序列、其他病人样本或可能会有的、来源于治疗之前同一病人的样本相比较。验证序列和参照或处理前序列不同的基因型，并和侵入抑制剂敏感性的差异相对应。
遗传上已表征的病毒的辅助受体和受体向性通过在具遗传背景基础(如X4向性的NL4-3、R5向性的JRCSF)的载体上构建含有特定突变的包膜表达载体(pHIVenv)，对和辅助受体向性相关的包膜氨基酸序列进行评价。突变可以单独掺入，和/或同其他调节辅助受体使用的突变联合掺入。使用任何一种广泛采用的定点诱变方法将包膜突变引入到pHIVenv载体中。在本发明的一个实施方案中，使用了用于定点诱变的mega引物PCR法(Sarkar G和Summer S.S.，1990)。使用实施例1中介绍的病毒侵入分析法对包含特定包膜突变或突变组的pHIVenv载体进行试验。将含有包膜突变的病毒的辅助受体向性和不含受评价突变、遗传上具有明确辅助受体向性的病毒的辅助受体向性相比较。通过往已鉴定的参照病毒中引入突变，如实施所描述在病毒侵入分析中评价突变病毒的辅助受体向性，来确认或否定特定突变导致辅助受体变化的能力。观察到的辅助受体向性变化归因于向pHIVenv载体中引入的特定突变。
在本发明的一个实施方案中，通过对gp120表面包膜蛋白V3环中的氨基酸序列进行评价，鉴定R5向性的遗传决定簇。通过与大量X4向性病毒和R5向性病毒的氨基酸序列相比较，鉴定受评价的氨基酸序列。选择X4病毒和R5病毒之间固有的差异加以评价。通过定点诱变构建了以已鉴定的X4亲本克隆(如NL4-3、HXB2)为基础的、gp120包膜蛋白V3环中包含特定“R5候选”突变的同基因病毒，如实施例4所描述验证其辅助受体向性。在不存在一种R5抑制剂(哌啶-1-基丁烷化合物)和一种X4抑制剂(AMD3100)的条件下，及存在R5和X4抑制性药物浓度的条件下，感染表达CD4和CCR5的细胞(如U-87/CD4/CCR5)或表达CD4和CXCR4的细胞(U-87/CD4/CXCR4)。将X4向性病毒变为R5向性病毒的氨基酸替换被表征为R5向性的遗传决定簇。
在本发明的一个相关实施方案中，通过对gp120表面包膜蛋白V3环中的氨基酸序列进行评价，鉴定X4向性的遗传决定簇。通过与大量X4向性病毒和R5向性病毒的氨基酸序列相比较，鉴定受评价的氨基酸序列。选择X4病毒和R5病毒之间固有的差异加以评价。通过定点诱变构建了以已鉴定的R5亲本克隆(如JRCSF)为基础的、gp120包膜蛋白V3环中包含特定“X4候选”突变的同基因病毒，如实施例4所描述验证其辅助受体向性。在不存在一种R5抑制剂(哌啶-1-基丁烷化合物)和一种X4抑制剂(AMD3100)的条件下，及存在R5和X4抑制性药物浓度的条件下，感染表达CD4和CCR5的细胞(如U-87/CD4/CCR5)或表达CD4和CXCR4的细胞(U-87/CD4/CXCR4)。将X4向性病毒变为R5向性病毒的氨基酸替换被表征为R5向性的遗传决定簇。
在本发明的一个相关实施方案中，通过对整个gp120表面包膜蛋白中的氨基酸序列进行评价，鉴定X4或R5向性的遗传决定簇。
在本发明的一个相关实施方案中，通过对gp41跨膜包膜蛋白中的氨基酸序列进行评价，鉴定X4或R5向性的遗传决定簇。
在本发明的一个相关实施方案中，通过对gp120表面包膜蛋白V3环中的氨基酸序列进行评价，鉴定指定使用CCR5或CXCR4之外辅助受体的遗传决定簇。将能够在不表达CXCR4或CCR5、而表达其他候选辅助受体的细胞中复制的病毒的氨基酸序列相比较，鉴定受评价的氨基酸序列。选择非X4、非R5病毒和X4病毒、R5病毒之间固有的差异加以评价。通过定点诱变构建了以已鉴定的X4(如NL4-3)或R5亲本克隆(如JRCSF)为基础的、gp120包膜蛋白V3环中包含特定“非X4、非R5候选”突变的同基因病毒，如实施例4所描述验证其辅助受体向性。在无一种R5抑制剂(哌啶-1-基丁烷化合物)和一种X4抑制剂(AMD3100)的条件下，及存在R5和X4抑制性药物浓度的条件下，感染表达CD4和CCR5的细胞(如U-87/CD4/CCR5)或表达CD4和CXCR4的细胞(U-87/CD4/CXCR4)。赋予非X4、非R5辅助受体向性的氨基酸替换被表征为特定辅助受体向性的遗传决定簇。
在本发明的一个相关实施方案中，通过对整个gp120表面包膜蛋白中的氨基酸序列进行评价，鉴定其他辅助受体向性的遗传决定簇。
在本发明的一个相关实施方案中，通过对gp41跨膜包膜蛋白中的氨基酸序列进行评价，鉴定其他辅助受体向性的遗传决定簇。
在本发明的另一个相关实施方案中，通过对gp120表面包膜蛋白V3环中的氨基酸序列进行评价，鉴定指定使用CD8(同时使用CD4和CD8，或使用CD8而不使用CD4)作为HIV-1受体的遗传决定簇。通过将能够在不表达CD4、而表达CD8的细胞中复制的病毒的氨基酸序列相比较，鉴定受评价的氨基酸序列。选择CD4向性病毒和CD8向性病毒之间固有的差异加以评价。通过定点诱变构建了以已鉴定的CD4向性亲本克隆(如NL4-3、JRCSF)为基础的、gp120包膜蛋白V3环中包含特定“CD8候选”突变的同基因病毒，如实施例4所描述验证其辅助受体向性。对表达CD4和CCR5(如U-87/CD4/CCR5)、CD4和CXCR4(如U-87/CD4/CXCR4)、CD8和CCR5(如U-87/CD8/CCR5)、CD8和CXCR4(U-87/CD8/CXCR4)的细胞进行感染。能使病毒在表达CD8而不表达CD4的细胞内复制的氨基酸替换被表征为CD8向性的遗传决定簇。
在本发明的一个相关实施方案中，通过对整个gp120表面包膜蛋白中的氨基酸序列进行评价，鉴定CD8向性的遗传决定簇。
在本发明的一个相关实施方案中，通过对gp41跨膜包膜蛋白中的氨基酸序列进行评价，鉴定CD8向性的遗传决定簇。
实施例6测定HIV-1抗体中和作用本实施例提供了一种评价抗体介导的HIV-1中和作用，此中和作用在本申请中亦称为病毒中和。本实施例还提供了一种评价受HIV-1感染病人中抗体的病毒中和活性的手段和方法。本实施例还提供了一种评价接种有治疗性疫苗或疫苗候选物的个体或动物中抗体的抗病毒活性的手段和方法。本实施例还提供了一种评价接种有保护性(或预防性)疫苗或疫苗候选物的个体或动物中抗体的抗病毒活性的手段和方法。本实施例还提供了一种评价病毒中和活性，或特定单克隆或多克隆抗体制剂的手段和方法。
在侵入分析法中对来源于病人样本的包膜序列，或来源于病人样本的单克隆，或通过定点诱变进行人工改造后含有特定突变的包膜序列进行试验，评价抗体介导的中和作用。
在一个实施方案中，评价纵向病人样本(在不同的时间点从同一病人体内收集的病毒)中抗体介导的中和作用。例如，在接种前、接种过程中、接种后递增的时间点上进行病毒中和作用的评价。在一个相关实施方案中，在接种候选疫苗之前、重复接种过程中、接种完成后递增的时间点上，对包括，但不仅限于小鼠、大鼠、兔、猪和牛等动物血清的评价。在一个实施方案中，对预防性疫苗和疫苗候选物的病毒中和作用进行评价。在另一个实施方案中，对治疗性疫苗的病毒中和进行评价。
在另一个实施方案中，对从许多不同病人体内收集的样本进行病毒中和评价。在一个进一步的实施方案中，对从许多病人中收集的、代表不同病人群体和不同病毒群体的样本进行病毒中和评价。“病人群体”可以包括新感染病人、慢性感染病人、HIV/AIDS重症病人、病情快速恶化的病人、病情缓慢恶化的病人(典型地指长期无恶化者)、接受抗逆转录病毒治疗或免疫治疗(如白介素-2或其他细胞因子)的病人、接种或未接种的个体，但不仅限于这些。“病毒群体”可以包括具有不同遗传特征和地理起源的病毒(进化枝A、B、C、D、E、F、G)、对抗逆转录病毒药物敏感的病毒、对抗逆转录病毒药物敏感性下降/耐药的病毒、原代分离物、适于在细胞培养物中生长的分离物(经常指的是实验室驯化的病毒)、合胞体诱导性(SI)病毒、非合胞体诱导性(NSI)病毒、巨噬细胞(M)向性病毒、T-细胞(T)向性病毒和双重向性(M和T)病毒，但不仅限于这些。
病人抗体的表征(病人抗体对标准病毒组)在此实施方案中，使用一种表达HIV-1受体CD4和HIV-1辅助受体CCR5和CXCR4的靶细胞系(HT4/CCR5/CXCR4)进行分析。这种细胞系能够评价R5和X4向性病毒的抗体中和作用。在一个相关的实施方案中，使用两个靶细胞系进行分析。一个细胞系表达CD4和CCR5(U-87/CD4/CCR5)，用于验证R5向性病毒。另一个细胞系表达CD4和CXCR4(U-87/CD4/CXCR4)，用于评价X4向性病毒。使用从pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucU3转染包装宿主细胞中获得的重组病毒原种感染各类型细胞培养物，进行病毒侵入分析。此方案中，PHIVenv载体包含特定的、已鉴定的病毒的包膜序列序列，表达HIV-1包膜蛋白(gp120SU、gp41TM)，此类病毒称为“标准病毒组”(参见下文所述的病毒群体)。表4中列出了可能作为标准组的一些，而非全部的适当病毒样本。使用一种标准病毒组，比较从多个病人和/或动物体内获得的血清中中和性抗体的活性(参见上述的病人群体)。在此实施方案中，使用在96孔板中培养的细胞对病毒进行评价。典型地，在感染前一天HT4/CCR5/CXCR4靶细胞以5,000个细胞/孔的密度铺板，U-87/CD4/CCR5和U-87/CD4/CXCR4靶细胞以10,000个细胞/孔的密度铺板。在感染靶细胞之前，各病毒原种和待评价的血清或抗体制剂预孵育(典型地为1小时)。对未经过稀释或经过倍比稀释(典型地为4～5次10倍稀释)的血清或抗体制剂进行试验。在不存在抗体的条件(无抗体)下，也将各病毒原种感染靶细胞。对存在和不存在抗体的条件下靶细胞中产生的荧光素酶活性进行比较，评价病毒中和作用。在此实施方案中，通过比较各抗体优选性阻断靶细胞感染(降低或消除荧光素酶活性)的能力，对分析结果进行解释。通过测定能够阻断靶细胞感染的最高抗体稀释度(最稀释的)对病毒中和活性进行定量(比如能够使不存在抗体的条件下产生的荧光素酶活性降低50％的最大稀释度)。
病人HIV-1的表征(病人病毒对标准抗体组)在此实施方案中，使用一种表达HIV-1受体CD4和HIV-1辅助受体CCR5和CXCR4的靶细胞系(HT4/CCR5/CXCR4)进行分析。这种细胞系能够评价R5和X4向性病毒的抗体中和活性。在一个相关的实施方案中，使用两个靶细胞系进行分析。一个细胞系表达CD4和CCR5(U-87/CD4/CCR5)，用于验证R5向性病毒。另一个细胞系表达CD4和CXCR4(U-87/CD4/CXCR4)，用于评价X4向性病毒。使用从pHIVenv和pHIVluc或pHIVlucDU3转染包装宿主细胞中获得的重组病毒原种感染各类型细胞培养物，进行病毒侵入分析。在此实施方案中，PHIVenv载体包含病人病毒来源的包膜序列序列，表达HIV-1包膜蛋白(gp120SU、gp41TM)。在此实施方案中，使用来源于不同病人群体(参见上文所述的病人群体)和/或不同病毒群体(参见下文所述的病毒群体)的病毒构建pHIVenv。在病毒侵入分析中对来源于pHIVenv载体的假型HIV进行评价，测定它们是否对一组特异的、已鉴定的抗体制剂敏感。这种抗体作为“标准抗体组”。表4中列出了可能作为标准组的一些，而非全部的适当抗体。在这一个实施方案中，使用在96孔板中培养的细胞评价病毒中和作用。典型地，在感染前一天HT4/CCR5/CXCR4靶细胞以5,000个细胞/孔的密度铺板，U-87/CD4/CCR5和U-87/CD4/CXCR4靶细胞以10,000个细胞/孔的密度铺板。在感染靶细胞之前，各病毒原种和标准抗体组中的各抗体制剂预孵育(典型地为1小时)。对未经过稀释或经过倍比稀释(典型地说4～5次10倍稀释)的血清或抗体制剂进行试验。还在不存在药物(无药物)的条件下用各病毒原种对靶细胞进行感染。对存在和不存在抗体的条件下靶细胞中产生的荧光素酶活性进行比较，评价病毒中和作用。在此实施方案中，通过比较各抗体优选性阻断靶细胞感染(降低或消除荧光素酶活性)的能力，对分析结果进行解释。通过测定能够阻断靶细胞感染的最高抗体稀释度(最稀释的)对病毒中和活性进行定量(如能够使不存在抗体的条件下产生的荧光素酶活性降低50％的最大稀释度)。
实施例7鉴定能够刺激、改变或防止中和性抗体应答的HIV-1包膜氨基酸序列本实施例提供了一种鉴定能够刺激/促进、或改变、或抑制抗体介导的HIV-1感染中和作用(在本申请中亦称之为病毒中和)的手段和方法。
如实施例6所描述，在侵入分析法中对来源于病人样本的包膜序列，或来源于病人样本的单克隆，或通过定点诱变进行人工改造使含有特定突变的包膜序列进行试验，确定辅助受体向性。
在一个实施方案中，评价纵向病人样本(在不同的时间点从同一病人体内收集的病毒)中抗体介导的中和作用。例如，在接种前、接种过程中、接种完成后递增的时间点上对病毒中和作用的评价。在一个实施方案中，对预防性疫苗的病毒中和作用进行评价。在另一个实施方案中，对治疗性疫苗的病毒中和作用进行评价。
在另一个实施方案中，对从许多不同病人体内收集的样本进行病毒中和性评价。在一个进一步的实施方案中，对从许多病人中收集的、代表不同病人群体和不同病毒群体的样本进行病毒中和性评价。“病人群体”可以包括新感染病人、慢性感染病人、重症病人、病情快速恶化的病人、病情缓慢恶化的病人(典型地指长期无恶化者)、接受抗逆转录病毒治疗或免疫治疗的病人、接种或未接种的个体，但不仅限于这些。“病毒群体”可以包括具有不同遗传特征的病毒(进化枝A、B、C、D、E、F、G)、对抗逆转录病毒药物敏感的病毒、对抗逆转录病毒药物敏感性下降/耐药的病毒、原代分离物或适于在细胞培养物中生长的分离物(经常指的是实验室驯化的病毒)、合胞体诱导性(SI)病毒或非合胞体诱导性(NSI)病毒、巨噬细胞(M)向性病毒、T-细胞(T)向性病毒和双重向性(M和T)病毒，但不仅限于这些。
病人HIV样本的基因型分析可以使用广泛采用的DNA测序法对代表病人样本库的包膜序列，或来源于病人库的克隆进行分析。在本发明的一个实施方案中，通过病毒RNA纯化、RT-PCR和双脱氧核苷酸链末端测序化学和毛细管凝胶电泳(Applied Biosystems，Foster City，CA)测定病人HIV样本序列。将病人病毒库的包膜序列或克隆，和参照序列、其他病人样本或可能会有的、来源于治疗之前同一病人的样本相比较。鉴定基因型中与参照序列或处理前序列不同，并与侵入抑制剂敏感性差异相关的序列。
遗传上已表征的病毒的抗体介导的中和作用通过在具遗传背景基础(如X4向性的NL4-3、R5向性的JRCSF)上构建含有特定突变的包膜表达载体(pHIVenv)，对和辅助受体向性相关的包膜氨基酸序列进行评价。突变可以单独掺入，和/或同其他调节病毒中和作用突变联合掺入。使用任何一种广为有效的定点诱变方法将包膜突变引入到pHIVenv载体中。在本发明的一个实施方案中，使用了用于定点诱变的mega引物PCR法(Sarkar G和SummerS.S.，1990)。使用实施例6中介绍的病毒侵入分析法对包含特定包膜突变或突变组的pHIVenv载体进行试验。可以选用特定抗体制剂(即已鉴定的单克隆或多克隆抗体制剂)、受HIV感染的病人的血清或接种个体的血清来比较抗体中和活性。将含有包膜突变的病毒的抗体中和活性和不含受评价突变、遗传背景明确的病毒的抗体中和活性相比较。通过往已鉴定的参照病毒中引入突变，如实施例6所描述在病毒侵入分析中评价抗体所介导的、突变病毒的抗体中和作用，来肯定或否定特定突变赋予、改变或抑制抗体中和作用的能力。观察到的病毒中和作用的变化归因于向pHIVenv载体中引入的特定突变。
在本发明的一个实施方案中，通过对gp120表面包膜蛋白V3环中的氨基酸序列进行评价，鉴定病毒中和的遗传决定簇。通过将大量能被或不能被各种已坚定的抗体制剂、病人血清或接种个体的血清所中和的病毒的氨基酸序列相比较，鉴定受评价的氨基酸序列。选择V3环氨基酸序列中、能被或不能被中和的病毒之间固有的差异加以评价。通过定点诱变构建了以已鉴定的亲本克隆(如NL4-3、HXB2、JRCSF)为基础的、gp120包膜蛋白V3环中包含特定“病毒中和候选”突变的同基因病毒，如实施例6所描述验证抗体介导的中和作用。对表达CD4和CCR5(如U-87/CD4/CCR5)、CD4和CXCR4(U-87/CD4/CXCR4)、或CD4、CCR5和CXCR4(HT4/CCR5/CXCR4)的细胞进行感染。能够刺激、改变或抑制抗体中和作用的氨基酸替换对于病毒中和作用是重要的。
在本发明的一个相关实施方案中，通过对整个gp120表面包膜蛋白中的氨基酸序列进行评价，鉴定抗体中和的遗传决定簇。
在本发明的一个相关实施方案中，通过对gp41跨膜包膜蛋白中的氨基酸序列进行评价，鉴定抗体中和的遗传决定簇。
实施例8测定对病毒侵入抑制剂的敏感性，用以指导治疗决策本实施例提供了一种使用病毒侵入抑制剂敏感性指导HIV-1治疗的手段和方法。本实施例进一步提供了一种使用病毒侵入抑制剂敏感性指导曾接受过抗逆转录病毒药物——病毒侵入抑制剂治疗的病人治疗的手段和方法。本发明进一步提供了一种使用病毒侵入抑制剂敏感性指导不曾接受过病毒侵入抑制剂治疗的病人治疗的手段和方法。
在一个实施方案中，使用病人病毒对病毒侵入抑制剂的敏感性指导抗逆转录策略——使用一种或多种病毒侵入抑制剂失败的病人的治疗。治疗失败(也指病毒学失败)通常定义为部分抑制性抗病毒治疗结果产生可检测水平的病毒，典型地可以在病人血浆中检测到。指导原则包括，但不仅限于(a)阐明有效的药物治疗选择；(b)选择较积极的治疗策略；(c)阐明接受治疗的病人所携带病毒增加的病因学(即粘附性较差、耐药性)；和(d)减少消极的、有潜在毒性的药物的使用。在此实施方案中，用于耐药试验的载体来源于病人病毒样本，使用表型病毒侵入分析法检验其对各种病毒侵入抑制剂的敏感性。病毒侵入抑制剂可以包括，但并不仅限于融合抑制剂(如T-20、T-1249)、辅助受体拮抗剂(AMD3100、AMD8664、TAK779、PRO542和哌啶-1-基丁烷类化合物)和CD4拮抗剂(Mab5A8)。适当的治疗决策取决于病毒侵入分析结果(如参见图4B)、其他相关实验室试验结果和临床信息。
在另一个实施方案中，病人病毒对病毒侵入抑制剂的敏感性用于指导未曾接受过抗逆转录病毒策略的病人的治疗，其治疗策略包括一种或多种病毒侵入抑制剂。指导原则可以包括，但并不仅限于(a)阐明有效的药物治疗选择；(b)选择较积极的治疗策略；(c)阐明对病毒侵入抑制剂的基准敏感性；和(d)减少消极的、有潜在毒性的药物的使用。在治疗受次接受治疗的病人过程中，测定对病毒侵入抑制剂的基准敏感性是重要的。其原因有二。首先，病毒对侵入抑制剂的天然敏感性差别很大(如参见图4A)。其次，病毒侵入抑制剂使用的增加无疑会导致耐药变种的产生，该变体可以传播给新感染的病人。在此实施方案中，用于耐药试验的载体来源于病人病毒样本，使用表型病毒侵入分析法检验其对各种病毒侵入抑制剂的敏感性。病毒侵入抑制剂可以包括，但并不仅限于融合抑制剂(如T-20、T-1249)、辅助受体拮抗剂(AMD3100、AMD8664、TAK779、PRO542和哌啶基丁烷类化合物)和CD4拮抗剂(Mab5A8)。适当的治疗决策取决于病毒侵入分析结果、其他相关实验室试验结果和临床信息。
实施例9测定HIV-1辅助受体向性，用以指导治疗决策本实施例提供了一种使用HIV-1辅助受体(CCR5、CXCR4)向性指导HIV-1治疗的手段和方法。本实施例进一步提供了一种使用HIV-1辅助受体向性指导抗逆转录病毒药物治疗失败的病人治疗的手段和方法。本发明还进一步提供了一种使用HIV-1辅助受体向性指导新感染HIV-1的病人治疗的手段和方法。
本实施例提供了一种使用HIV-1病毒辅助受体向性指导HIV-1治疗的手段和方法。本实施例进一步提供了一种使用HIV-1辅助受体向性指导曾接受过利用病毒侵入抑制剂进行抗逆转录病毒治疗的治疗的手段和方法。本发明进一步提供了一种使用HIV-1辅助受体向性指导未曾接受过病毒侵入抑制剂的病人治疗的手段和方法。
在一个实施方案中，病人病毒的辅助受体向性用于指导抗逆转录策略——使用一种或多种病毒侵入抑制剂失败的病人的治疗。治疗失败(也指病毒学失败)通常定义为部分抑制性抗病毒治疗结果产生可检测水平的病毒，典型地可以病人血浆中检测到。指导原则包括，但不仅限于(a)阐明接受治疗的病人所携带病毒增加的病因学(即粘附性较差，耐药性、辅助受体向性改变)；(b)阐明有效的药物治疗选择；(c)选择较积极的治疗策略；和(d)减少消极的、有潜在毒性的药物的使用。对接受CCR5拮抗剂的病人进行辅助受体向性的监测具有临床意义，这是因为药物压力会将其辅助受体向性转换为CXCR4向性。和R5病毒(CCR5辅助受体向性)相比，X4病毒(CXCR4辅助受体向性)的预后较差。在此实施方案中，用于耐药性试验的载体来源于病人病毒样本，使用表型病毒侵入分析法检验其对各种辅助受体拮抗剂的敏感性。辅助受体拮抗剂可以包括，但并不仅限于AMD3100、AMD8664、TAK779、PRO542和哌啶-1-基丁烷类化合物。适当的治疗决策取决于病毒侵入分析结果(如参见图4B)、其他相关实验室试验结果和临床信息在另一个实施方案中，病人病毒对病毒侵入抑制剂的敏感性用于指导未曾接受过抗逆转录病毒策略——包括一种或多种病毒侵入抑制剂的病人的治疗。指导原则可以包括，但并不仅限于(a)阐明基准辅助受体向性；(b)阐明有效的药物治疗选择；(c)选择较积极的治疗策略；和(d)减少消极的、有潜在毒性的药物的使用。测定基准辅助受体向性具有重要的临床意义。使用适当的一种辅助受体拮抗剂(R5对X4向性)或多个辅助受体拮抗剂(双重向性或混合向性)有可能产生更强、更持久的应答。在此实施方案中，用于耐药性试验的载体来源于病人病毒样本，使用表型病毒侵入分析法检验其对各种病毒侵入抑制剂的敏感性。辅助受体拮抗剂可以包括，但并不仅限于AMD3100、AMD8664、TAK779、PRO542和哌啶基丁烷类化合物。适当的治疗决策取决于病毒侵入分析结果、其他相关实验室试验结果和临床信息。
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表1细胞
表2代表性的病毒和试剂
aR5(CCR5辅助受体)，X4(CXCR4辅助受体)SI(合胞体诱导)，NSI(非合胞体诱导)，A、B、C、D、E、F(包膜进化枝名称)bAIDS研究和参照药剂组表3
表4(组1)抗HIV药物
表4(组2) FDA approved drugs are shown In boldfacered＝discontlnued development，blue＝not sure about development statue
表4(组3)Generic Name Brand Name Firm FDA Approval(abbreviation) Datezldovudine，AZT Retrovir Glaxo Wellcome March 87didanosine，ddI Videx Bristol Myers-Squibb October 91zalcitabine，ddC Hivtd Hoffman-La Roche June 92stavudine，d4TZerit Bristol Myers-Squibb June 94lamivudine，3TC Epivir Glaxo Wellcome November 95saquinavir，SQV，hgc Invirase Hoffman-La Roche December 95saquinavir，SQV，sgc Fortovase Hoffman-La Roche November 97ritonavir，RTVNorvir Abbott LaboratoriesMarch 96indinavir，IDVCrixivan Merck & Co.，Inc. March 96nevirapine，NVP Viramune Boehringer Ingelheim June 96nelfinavir，NFV Viracept Agouron PharmaceuticalsMarch 97delavirdine，DLV Rescriptor Pharmacia & Upjohn April 97ZDV+3TC Combivir Glaxo Wellcome September 97efavirenz，EFVSustivaDuPont Pharmaceuticals September 98abacavir，ABC Ziagen Glaxo Wellcome February 99amprenavirAgenerase Glaxo Wellcome April 99Iopinavir/ritonavir KaletraAbbott September 2000ZDV+3TC+ABC Trizivir GlaxoSmithKlineNovember 2000
辅助受体测试筛选模板
辅助受体测试筛选模板
辅助受体测试筛选模板
R5 X4No DrugNo Drug34 14.140 46 21.65630 3.98830 4942.206 45 44.589 32 26.47155 6.849 38.1447.33631 1.217 1.128 701.159 9729.1184.55214967.389 611 46 264 100 11.2991.273 7.3754.397 16.115 19.10222672 19.7153.9484.3305.204 52 2010.8567.130 5067.826 14.982 3.78850658 231 53 177 24.739 612 2.997 4166812.020 4.384 37242 35 974 32 33459.695 31100 3.724 450 148 32 60 45 714 11.029 2.90813.997 24.377 392.310 668 2422 61 338 45 1843523435 83 18.099 39.2575.41397.733 9.254 5.249 47019.175 5133.264 107 4.209 8.451 3840 29 23.84620.393 39126 31283.769786340 5.189 4.318196 3.853 411 7.857 25.437 17.443 16.707 4048 21 4337 51 7734 41384538391 98 4.4494.357 6.0901.886263 3.890 2.089 475 8.475 4.107 2638 28 9.102 105 3.635389.577 1.698 433833510 979491 300 297 39 443 3422 45 43 46 3359 33 3.815 3.61561.594 13.452128.23862334235L83 L8330 54 29 2732 34 27 3790 35 60 40 19.25832 4.696 25.5425.46828814 93432761 4622.27928 40 99 3021 38 32 2226 40 42 68 9.956 15338 14.9852.9532.918 3.05833 336.455 3.874 38129 11159 3832 47 28 3231 48 22 28 4310.839 3.397 60221 43828 33 36547.281 3329 38 37 3330 30 32 3116 31 73 59 302.656 463 3528 65207 35 2332393331 11513.895 8535 30 43 3837 96 35 30 683.502 6.220 3433 349.1508.290 33183 333329 39 31 3428 23 39 2242 35 40 1042438 42 2828 2787 34 4739432950 31 43 3473 38 33 4433 30 30 28 3545 40 7.832 77 2.092 58 6.140 1.224 50443042 55 49 2932 25 33 3533 36 20 27 2742 55 3.661 2.94656.73912.051 85.018 33393725AMD AMD39 12.188 32 7.226 35 3.66434 4033.192 44 30.510 35 3228 40 3239 142 42 37 40333731838 41 42.295 7645 25 30 8.232 1.129 3.9611.656 11.980 3424 32 1.022 152 48 4834 35 292.283 1.285 3351.146 8.580 2.04953493 219 26 361 21.767 479 925597383.384 538 4938 3495 28 34403530153 1.984 206 139 33 42 30 366 8.390 2.30612.139 16.045 2827272 3026 3629 40 4330284036 37 16.980 27.6325.04348.452 2.219 784 31019.838 5003.038 3488 8.711 3543 3340 38 383542472.773797282 5.358 3.461184 2.108 253 4.595 14.749 13.708 12.486 4122 40 3944 2634 28 37383224340 47 3.752906 4.473279 143 986 1.105 159 6.862 2.571 3431 39 3651 2733 45 160 362736564 813376 268 256 35 451 3527 28 44 29 3469 55 3630 4051 45 17394127
PlateRepeatEnd time Start temp End temp.BarCode11 6:39:36 PM 21.621.7 N/A0.5 CPS(CPS)182664854 6970374067158 38 1386 930 100118419248262 72 189723478 39465010 46 14 11004106 9038400232 238 26 976 34 38 4838 2000528 16 16 36 298 52 14 54122 2984726440 38 20 233441534044 15636 52 28 40 28 40 62 32 38 2222 32 28 9858 68 380246 114701950 4230 64 36 3846 3390 57858 12620126186 68 34PlateRepeatEnd timeStart temp End temp.BarCode21 6:41:51 PM 21.521.6 N/A0.5 CPS(CPS)342629456 6728388827514 24 1048 1326 40113418956190 72 204584418 47145398 58 261070830 15002 476642 44 972 30 284240 2620808 32 86 378 38 223292 5434963836 38 243482544 349644 44 14 46 62 923 44 5430 44 28 8346142 346830 7684 1438 4436 54 30 37843840 65330 14284130290 5632PlateRepeatEnd timeStart temp End temp.BarCode3 1 6:44:06 PM 21.6 21.6 N/A0.5 CPS(CPS)1618590 18 4306239025386 30 924 894 32 6608698148 34 140882880 31423160 40 46 761630 10252354238 172 34 842 30 32 4428 2396 370 28 26 66 172 32 22 2864 3784 482232 28 24 6188 570234 12016 28 62 26 28 30 38 38 38 4438 52 40 7020 68 179862 732410765032 50 70 3824 3138 53670 13088104608 32 38Plate RepeatEnd timeStart temp End temp.BarCode416:46:20 PM21.7 21.8 N/A0.5 CPS(CPS)2419926 46 5086271825550 26 704 974 32 862
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PlateRepeat End time Start temp.End temp.BarCode11########21.7 21.8 N/A0.5 CPS(CPS)3224 1421856 21586 28 4034 36 52 42088 404780 174 71276 730 48 326 28 120221288 71986945215306400844792 180 50 182 25292 71872 3922 546 128 44 66 30 900 11984 319430 88 18820 40438 4882105946 84664934 470 203863420 934 344 6268 5012170 3546504 8164 22214344 82 53445330 67101880 338 4286 2112 466580 1018 516 318 302 40 414 32 2052PlateRepeatEnd time Start temp.End temp.BarCode21########21.9 21.9 N/A0.5 CPS (CPS)2244 14062 36 21726 32 3942 24 46 42324 504324 124 63502492 44 242 172 10576 1258 755266204 3568 524 282 56 172 24186 506128 354 20 54 60 528 10074 26224017378 59448952010042 5564470 179644118 638 336 4110 3624222 4160318 7550 28660438 114 3554 3384 54701892 188 34942066 484440 940 466 282 292 38 472 36 2438PlateRepeatEnd time Start temp.End temp.BarCode3 1########21.9 22 N/A0.5 CPS (CPS)3636 38 28 2838 28 36 42 114 4032 34 80 2616 36 30 18 2630126 106 34 4230 46 22 26 325826 46 42 3834 20 18 34 243628 146 157567632 26 42 52 3610634 50 20 2432 18 38 18 363838 38 28 3680 50 38 44 343840 30 38 3024 22 38 36 3436PlateRepeatEnd time Start temp.End temp.BarCode41########21.9 22 N/A0.5 CPS(CPS)1624 70 30 2626 40 18 32 6630
24 46 118 34 26 40 34 26265013211684 34 34 48 34 38303832 30 32 28 26 40 46 28122634 84 1203694 38 34 44 24388624 28 42 44 24 28 40 26483262 24 58 32 66 26 28 44322244 80 60 28 40 28 28 343236Plate Repeat End time Start temp.End temp.BarCode5 1######## 22 22 N/A0.5 CPS(CPS)3438 1113226 669634 396044 40 2954840762 48 3988888 40 30 36 84161262 4096520588050 2524 60 450 168 32 340 22410534106 2080 172 170 38 38 30 444 7478 245830 46 1642825792 424045094 2092630 334 171302498 732 358 50443236202 2124292 4806 13736290 30 3986 886 4584240 110 940 1286 162456 816 438 294 260 44 524 40 34 22PlateRepeatEnd time Start temp.End temp.BarCode61######## 22 22.1 N/A0.5 CPS(CPS)3240 1324038 775638 3368 24 40 36836 48914 34 4470264 50 20 24 8048996 3826502349110 1574 46 536 270 20 382 21124 424200 1888 240 108 28 46 30 288 9302215446 28 1753229872 5846518102346938 286 221463048 862 206 56683686166 2092214 438415762390 64 3518 926 4362318 176 1032924 156672 810 314 242 252 26 378 30 20 34
43332 38431417856357242416106 23794548 337615146 195927752407848 4245846 26448014374242240811888 24960478 315219740 138229198413638 5060 4648 808 28100 6034 2450 5830 2822 2660 34
3656362846583636301503028162830628 341598 123721046 51210024 15470388 273013012 123866768 2204382030392 361714 11588804 68214254 16620612 334614404 125866956 29385038

序列表<110>ViroLogic公司<120>利用重组病毒分析法评价病毒受体/辅助受体使用和病毒侵入抑制剂的组合物和方法<130>2793/65166APCT<140>09/874,475，60/295,871<141>2001-06-04<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>26<212>DNA<213>HIV包膜的RT引物<400>1ggagcattta caagcagcaa cacagc26<210>2<211>21<212>DNA<213>HIV包膜的RT引物<400>2ttccagtcav acctcaggta c21
<210>3<211>19<212>DNA<213>HIV包膜的RT引物<400>3agaccaatga cttayaagg19<210>4<211>35<212>DNA<213>PCR引物<400>4gggctcgaga ccggtcagtg gcaatgagag tgaag35<210>5<211>37<212>DNA<213>PCR引物<400>5gggctcgaga ccggtgagca gaagacagtg gcaatga37<210>6<211>36
<212>DNA<213>PCR引物<400>6gggctcgaga ccggtgagca gaagacagtg gcaatg36<210>7<211>35<212>DNA<213>PCR引物<400>7gggtctagaa cgcgttgcca cccatcttat agcaa35<210>8<211>38<212>DNA<213>PCR引物<400>8gggtctagaa cgcgtccact tgccacccat bttatagc38<210>9<211>34<212>DNA<213>PCR引物
<400>9gggtctagaa cgcgtccact tgccacccat btta34<210>10<211>38<212>DNA<213>PCR引物<400>10gatggtctaa gacgctgttc aatatccctg cctaactc38<210>11<211>10<212>PRT<213>病毒侵入抑制剂抗性突变<400>11Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln1 5 10<210>12<211>10<212>PRT<213>病毒侵入抑制剂抗性突变<400>12
Gln Leu Leu Ser Ser Ile Met Gln Gln Gln1 5 10<210>13<211>10<212>PRT<213>病毒侵入抑制剂抗性突变<220>
<221>MISC_特性<222>(5)..(5)<223>X＝G或S<220>
<221>MISC_特性<222>(7)..(7)<223>X＝V或M<400>13Gln Leu Leu Ser Xaa Ile Xaa Gln Gln Gln1 5 10<210>14<211>10<212>PRT<213>病毒侵入抑制剂抗性突变
<400>14Gln Leu Leu Ser Asp Ile Val Gln Gln Gln1 5 10<210>15<211>10<212>PRT<213>病毒侵入抑制剂抗性突变<220>
<221>MISC_特性<222>(5)..(5)<223>X＝G或D<400>1Gln Leu Leu Ser Xaa Ile Val Gln Gln Gln1 5 10<210>16<211>36<212>PRT<213>融合抑制剂肽<400>16Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln1 5 10 15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu20 25 30Trp Asn Trp Phe3权利要求
1.鉴定化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法，包括(a)从感染病毒的病人获得编码病毒包膜蛋白的核酸；(b)使用(i)步骤(a)中的核酸，和(ii)缺失编码包膜蛋白的核酸并包含产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体，共转染第一细胞，使得第一细胞产生包含包膜蛋白的病毒颗粒，所述包膜蛋白由从病人获得的核酸编码；(c)在化合物存在的条件下，将步骤(b)中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；(d)测定第二细胞产生的信号量，以测定病毒颗粒的感染性；并(e)将步骤(d)中测得的信号量和无化合物存在时产生的信号量相比较，其中化合物存在时测得信号量减少意味着化合物抑制病毒侵入第二细胞。
2.权利要求1的方法，其中指示性核酸包括指示性基因。
3.权利要求2的方法，其中指示性基因是荧光素酶基因。
4.权利要求1的方法，其中细胞表面受体是CD4。
5.权利要求1的方法，其中细胞表面受体是趋化因子受体。
6.权利要求1的方法，其中细胞表面受体是CXCR4或CCR5。
7.权利要求1的方法，其中病人感染了HIV-1病毒。
8.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的核酸包括编码gp120和gp41的DNA。
9.权利要求1的方法，其中病毒表达载体包括HIV核酸。
10.权利要求9的方法，其中病毒表达载体包括HIV gag-pol基因。
11.权利要求9的方法，其中病毒表达载体包括编码Vif、vpr、tat、rev、vpu和nef的DNA。
12.权利要求1的方法，其中第一细胞是哺乳动物细胞。
13.权利要求12的方法，其中哺乳动物细胞是人类细胞。
14.权利要求13的方法，其中人类细胞是人胚肾细胞。
15.权利要求14的方法，其中人胚肾细胞是293细胞。
16.权利要求1的方法，其中第二细胞是人类T细胞。
17.权利要求1的方法，其中第二细胞是人类T细胞白血病细胞系。
18.权利要求1的方法，其中第二细胞是外周血单核细胞。
19.权利要求1的方法，其中第二细胞是星形胶质瘤细胞。
20.权利要求19的方法，其中星形胶质瘤细胞是U87细胞。
21.权利要求1的方法，其中第二细胞是人类骨肉瘤细胞。
22.权利要求2的方法，其中人类骨肉瘤细胞是HT4细胞。
23.权利要求1的方法，其中化合物和细胞表面受体相结合。
24.权利要求1的方法，其中化合物是细胞表面受体的配基。
25.权利要求23的方法，其中化合物包括抗体。
26.权利要求1的方法，其中化合物抑制膜融合。
27.权利要求1的方法，其中化合物是肽、肽模拟物、有机分子或合成化合物。
28.权利要求1的方法，其中化合物和病毒包膜蛋白相结合。
29.一种制备组合物的方法，包括将权利要求1中鉴定的化合物和载体相混合。
30.权利要求29的方法，其中载体是盐溶液、聚乙二醇、缓冲液、淀粉或有机溶剂。
31.鉴定病毒感染细胞时与病毒结合的细胞表面受体的方法，包括(a)获得包含(i)病毒核酸和(ii)产生可检测信号的指示性核酸的病毒颗粒；(b)将步骤(a)中的病毒颗粒和表达细胞表面受体的细胞相接触；并(c)测定细胞中产生的可检测信号的量，其中信号的产生意味着细胞表达的细胞表面受体与病毒结合，由此鉴定细胞感染时与病毒结合的细胞表面受体。
32.鉴定抗体是否抑制病毒侵入细胞的方法，包括(a)从感染病毒的病人获得编码病毒包膜蛋白的核酸；(b)使用(i)步骤(a)中的核酸，和(ii)缺失编码包膜蛋白的核酸并包含产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体，共转染第一细胞，使得第一细胞产生包含包膜蛋白的病毒颗粒，所述包膜蛋白由从病人获得的核酸编码；(c)在抗体存在的条件下，将步骤(b)中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；(d)测定第二细胞产生的信号量，以检测病毒颗粒的感染性；并(e)将步骤(d)中测得的信号量和无化合物存在时的信号量相比较，其中抗体存在时测得信号量减少意味着抗体抑制了病毒侵入第二细胞。
33.测定病毒对抑制病毒侵入细胞的化合物的敏感性的方法，包括(a)从感染病毒的病人获得编码病毒包膜蛋白的核酸；(b)使用(i)步骤(a)中的核酸，和(ii)缺失编码包膜蛋白的核酸并包含产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体，共转染第一细胞，使得第一细胞产生包含包膜蛋白的病毒颗粒，所述包膜蛋白由从病人获得的核酸编码；(c)在化合物存在的条件下，将步骤(b)中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；(d)测定第二细胞产生的信号量，以确定病毒颗粒的感染性；并(e)将步骤(d)中测得的信号量和无化合物存在时的信号量相比较，其中化合物存在时测得信号量减少意味着病毒对该化合物敏感。
34.测定病毒对抑制病毒侵入细胞的化合物的耐药性的方法，包括(a)根据权利要求33的方法测定病毒对化合物的敏感性，其中编码病毒包膜蛋白的核酸在第一时间从病人获得；(b)根据权利要求33的方法测定病毒对化合物的敏感性，其中编码病毒包膜蛋白的核酸在稍后的第二时间从病人获得；并(c)将步骤(a)和步骤(b)中测得的敏感性相比较，其中在稍后的第二时间敏感性降低意味着病毒对化合物具有耐药性。
35.鉴定病毒中的突变的方法，所述突变赋予对抑制病毒侵入细胞的化合物的耐药性，所述方法包括(a)在使用化合物对病毒进行处理之前测定病毒的核酸序列或氨基酸序列；(b)获得对化合物具有耐药性的病毒；(c)测定步骤(b)中耐药性病毒的核酸序列或氨基酸序列；(d)将步骤(a)和步骤(c)中的核酸序列和氨基酸序列分别进行比较，鉴定病毒中赋予化合物耐药性的突变。
36.权利要求35的方法，其中步骤(b)中获得的病毒是在化合物存在的条件下培养至产生耐药性的步骤(a)中的病毒。
37.权利要求35的方法，其中步骤(b)中获得的病毒是从接受化合物治疗的病人分离得到的。
全文摘要
本发明涉及鉴定化合物是否抑制病毒侵入细胞的方法。该方法包括(a)从感染病毒的病人体内获得编码病毒包膜蛋白的核酸；(b)将(i)步骤(a)中的核酸和(ii)缺失编码包膜蛋白的核酸并包含产生可检测信号的指示性核酸的病毒表达载体共转染第一细胞；(c)在化合物存在的条件下，将步骤(b)中产生的病毒颗粒和第二细胞相接触，其中第二细胞表达能与病毒结合的细胞表面受体；(d)测定第二细胞产生的信号量，以检测病毒颗粒的感染性；和(e)将步骤(d)中产生的信号量和无化合物存在时的信号量相比较，其中化合物存在时信号量的减少意味着化合物抑制了病毒向第二细胞的侵入。
文档编号G01N33/15GK1547618SQ02815323
公开日2004年11月17日 申请日期2002年6月4日 优先权日2001年6月4日
发明者C·J·佩特罗普洛斯, N·T·帕金, J·惠特科姆, W·黄, C J 佩特罗普洛斯, 乜颇, 帕金 申请人:瓦罗洛吉克公司