专利名称：Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及医学检测领域，具体涉及一种奶牛乳房炎检测试剂盒。 背景技术：
在一个牛群中，大多数乳房炎是隐性型的，由于无临床症状，肉眼很难判断。隐性 乳房炎的危害主要体现为(1)隐性乳房炎造成的泌乳母牛产奶量的损失占总生产能力的 10% 15%; (2)隐性乳房炎牛易于转变为临床乳房炎；(3)隐性乳房炎牛所产乳汁中含有 大量的炎性因子、病原微生物及其产生的毒素，可能危害牛奶消费者的身体健康。目前，国内外监测隐性乳房炎的方法有(1)直接(牛奶)体细胞计数法，这是监 控奶牛隐性乳房炎的可靠手段。但是，测定牛奶体细胞数，如果用仪器测定，一台体细胞测 定仪的价格达40 60万元左右；用显微镜(人工)测定，则要对牛奶进行特殊处理，并对每 个乳样进行观察计数，费时费力，且可靠性不高。(2)间接体细胞计数法，现在大多采用“加 州乳房炎检测法”(CMT)，该方法对于隐性乳房炎检测具有较好的效果，便于早期发现，但该 技术的知识产权是国外的，且检测效果只能是定性鉴定，且不能定量准确鉴定；国内在加州 乳房炎检测法的基础上衍生了一些检测方法，如兰州乳房炎检测法(LMT)、杭州乳房炎检测 法(HMT)和上海乳房炎检测法(SMT)，但同样存在上诉问题。(3)其他检测方法，主要根据 隐性乳房炎奶牛的乳汁中Na离子或Cl离子等浓度的变化，或根据乳汁酶含量的变化，而设 计的乳汁PH检测、乳汁电导率检测、乳汁酶检测方法等，但这些检测方法也只是粗略测定， 不能达到定量检测。结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)在血浆中与游离的血红蛋白结合，是一种急性时 相反应蛋白。研究结果表明，结合珠蛋白前体在临床型乳房炎奶牛血浆中表达量上调，与临 床剂乳房炎奶牛或诱导的急性和慢性乳房炎奶牛的血浆中结合珠蛋白的浓度增加，奶牛血 清或乳汁中结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)在乳房炎早期诊断中具有重要价值。是一种显 著的诊断指标。ELISA检测方法以其快速、准确、灵敏且一次能处理多个样品而倍受关注。目前国 内外用于ELISA检测的抗体多为多克隆抗体，而以单克隆抗体为基础建立起来的免疫学检 测试剂盒，检测成本低廉，结果迅速，更加灵敏可靠，而且可以稳定、方便地提供标准化的试 剂，便于实现工业化生产，因而在Hp检测中，具有极为广阔的前景。现有检测Hp指标的试剂盒均为国外产权，且检测主要为血液样本，较难取样；定 性检测无具体参考标准。而以检测容易取样的奶样为主要检测标本，由于牛奶中含有多种 蛋白，直接进行包被也很难获得成功。因此，本研究采用了双抗体夹心(小鼠抗牛Hp抗体 一牛奶一羊抗牛Hp酶标抗体)ELISA方法进行检测。应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定 标本中Hp水平。本发明旨在解决如上问题，以检测容易取样的奶样为主要检测标本，并对定性检 测进行改进，使其在定性检测时做到相对准确的判断。
发明内容本实用新型的目的在于公开一种具有检测奶牛隐性乳房炎符合率高(大于 90%)，以单克隆抗体为基础建立起来的，检测成本低廉，取样容易，反应速度快，结果灵敏 可靠，而且可以稳定、方便地提供标准化试剂，便于实现工业化生产，试剂盒保质期较长的 Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒。本实用新型的目的是这样实现的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒由一块96孔酶 标包被板、酶标试剂、标准品、标准品稀释液、底物溶液、20倍浓缩洗涤液、样品稀释液、终止 液、两片封板膜组成。本实用新型还有这样一些技术特征1、所述的酶标包被板为被鼠抗牛Hp单克隆抗体包被的8 X 12孔酶标板，分为空白 孔、标准孔、待测样品孔三组；2、所述的酶标试剂为碱性磷酸酶AP标记的羊抗牛Hp多克隆抗体；3、所述的标准品为Hp标准品，在检验过程中经标准品稀释液以梯度浓度稀释为5 个浓度加样于标准品孔中；4、所述的标准品稀释液为1 X 3ml/瓶；5、所述的样品稀释液为IX6ml/瓶；6、所述的底物溶液为硝基苯磷酸盐PNPP ；7、所述的20倍浓缩洗涤液为PBST，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍；8、所述的终止液为0. 5mol/L碳酸钠；9、所述的封板膜为96孔，用于酶标板加样和加酶标试剂后的温育过程。本实用新型为一种专用于奶牛隐性乳房炎诊断的试剂盒，研发人员在比较了多种 奶牛乳房炎检测方法后，设计了本检测试剂盒。其原理是结合珠蛋白(Haptoglobin ;Hp) 又称触珠蛋白，是血清α 2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，广泛存在于人类和许多哺乳 动物的血清及其他体液中，其主要功能是通过与游离血红蛋白(heamoglobin，Hb)结合形 成Hp-Hb复合物，将Hb运至肝中代谢，从而避免Hb和铁从肾脏丢失以及对肾脏的损伤。此 外，结合珠蛋白作为一种急性期蛋白，在参与宿主抗感染、损伤组织的修复以及内环境稳定 的过程中起着重要作用，其血清含量在感染、创伤、炎症、肿瘤、心肌梗死等病理状态时显著 升高。本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中Hp水平。通过ELISA方法，制 备的Hp抗体同Hp的特异性反映，从而能够准确的检测到标本中的Hp含量。通过Hp含量和 体细胞数SCC之间的换算，达到检测奶牛隐性乳房炎的目的。用纯化的抗体包被酶标板，制 成固相抗体，往包被单抗的酶标板中依次加入Hp抗原、碱性磷酸酶AP标记的羊抗牛Hp抗 体，经过彻底洗涤后用显色底物溶液硝基苯磷酸盐PNPP显色，PNPP在碱性磷酸酶的作用下 生成对硝基酚(PNP)，其在入=450nm处有最大吸收.在碳酸钠终止液的作用下终止反应， 显色。硝基苯磷酸盐PNPP在碱性磷酸酶AP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成 最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Hp呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度 (0D值)，计算样品浓度。

图1为实施例酶标板结构示意图。(五)具体实施例
以下结合附图和具体实施例对本实用新型做进一步的说明结合图1，本实施例包括被鼠抗牛Hp单克隆抗体包被的8 X 12孔酶标板1 一块，其 中空白孔一个、标准孔十个，其余均为待测样品孔，标准品一瓶，3ml标准品稀释液一瓶，3ml 碱性磷酸酶AP标记的羊抗牛Hp多克隆抗体酶标试剂一瓶，3ml硝基苯磷酸盐PNPP底物溶 液一瓶，30ml20倍浓缩洗涤液一瓶，6ml样品稀释液一瓶，IOml 0. 5mol/L碳酸钠终止液一 瓶，96孔封板膜两片。各试剂在使用前平衡至室温，操作步骤如下1、标准品加样在酶标包被板上设的10个标准品孔，分为两组做重复性实验，以 便保证标准曲线的标准线，也就是做复孔，通过稀释加样，使酶标包被板上标准品孔中的溶 液做梯度浓度稀释，稀释后各孔加样量均为50 μ 1，共做5个梯度浓度；2、待测样品加样各待测样品50ul加入待测样品孔内，注意不要有气泡，轻轻混 勻，酶标板加盖封板膜，37°C反应30分钟；3、弃去液体，甩干，用蒸馏水稀释20倍浓缩洗涤液后洗涤酶标板；4、加酶标试剂每孔加入酶标试剂碱性磷酸酶AP标记的羊抗牛Hp多克隆抗体 50 μ 1，空白孔除外，加盖封板膜温育，37 °C反应30分钟，洗涤；5、显色依序每孔加入底物溶液硝基苯磷酸盐PNPP50ul，37°C避光显色15分钟；6、依序每孔加终止溶液0. 5mol/L碳酸钠50ul，终止反应(此时兰色立转黄色)； 15分钟后，用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(0D值)。结果判定标准经与标准孔反应结果对比，颜色的深浅和样品中的Hp呈正相关， 隐性乳房炎阴性反应的混合液颜色呈无色，隐性乳房炎阳性反应，混合液颜色由蓝色转为 黄色。计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，根据 样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度。
权利要求Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于它是由一块96孔酶标包被板、酶标试剂、标准品、标准品稀释液、底物溶液、20倍浓缩洗涤液、样品稀释液、终止液、两片封板膜组成。
2.根据权利要求1所述的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的酶标包 被板为被鼠抗牛Hp单克隆抗体包被的8 X 12孔酶标板，分为空白孔、标准孔、待测样品孔三组。
3.根据权利要求1所述的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的酶标试剂 为碱性磷酸酶AP标记的羊抗牛Hp多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的标准品为 Hp标准品，在检验过程中经标准品稀释液以梯度浓度稀释为10个浓度加样于标准品孔中。
5.根据权利要求1所述的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的标准品稀 释液为IX 3ml/瓶。
6.根据权利要求1所述的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的样品稀释 液为IX 6ml/瓶。
7.根据权利要求1所述的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的底物溶液 为硝基苯磷酸盐PNPP。
8.根据权利要求1所述的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的20倍浓 缩洗涤液为PBST，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。
9.根据权利要求1所述的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的终止液为 0. 5mol/L碳酸钠。
10.根据权利要求1所述的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒，其特征在于所述的封板膜 为96孔，用于酶标板加样和加酶标试剂后的温育过程。
专利摘要本实用新型的目的在于公开一种具有检测奶牛隐性乳房炎符合率高于90％，以单克隆抗体为基础建立起来的，检测成本低廉，取样容易，反应速度快，结果灵敏可靠，而且可以稳定、方便地提供标准化试剂，便于实现工业化生产，试剂盒保质期较长的Hp奶牛隐性乳房炎检测试剂盒。用纯化的抗体包被酶标板，制成固相抗体，往包被单抗的酶标板中依次加入Hp抗原、碱性磷酸酶AP标记的羊抗牛Hp抗体、底物溶液硝基苯磷酸盐PNPP显色、0.5mol/L碳酸钠终止液。
文档编号G01N33/543GK201622272SQ20092024439
公开日2010年11月3日 申请日期2009年12月21日 优先权日2009年12月21日
发明者吕英, 李庆章, 杨宇, 石晶, 边艳杰, 高学军 申请人:东北农业大学