专利名称：一种液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法
技术领域：
本发明属于卷烟烟气暴露生物标志物的研究，具体涉及一种液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法，即苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、I-氨基萘、
2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯的检测。
背景技术：
·芳香胺类化合物广泛存在于环境大气、染料、药物、食品添加剂、杀虫剂、塑料、橡胶、化妆品、排放的废水、烟草以及烟气中。芳香胺类化合物一般都具有毒性，可通过呼吸或皮肤接触进入人体。一些芳香胺化合物还具有致癌性，接触使用萘胺等染料的人群是膀胱癌、白血病的高危人群[1]。卷烟烟气中含有多种致癌芳香胺，如I-氨基萘(1_NA)、2-氨基萘(2-NA)、4-氨基联苯(4-ABP)、苯胺(ANL)、邻甲苯胺(o-TOL)等[2’3]。其中 2_NA、4_ABP、
o-TOL被国际癌症研究机构(IARC)列为I类人类致癌物，ANL、I-NA被IARC列为3类人类致癌物[3]。另外，卷烟烟气中的1-NA、2-NA、3-ABP、4-ABP被列入加拿大卫生部烟气有害成分检测名单中[4]，且2-NA和4-ABP被列入Hoffmann烟气有害成分名单中[5]。生物标志物法是通过检测人体体液中的代谢物含量来综合反映人体对环境污染物的暴露情况。由于尿液容易获得，较稳定，又可有效反映近期环境污染物多途径的暴露，从而成为近年来研究的热点[6_9]。已有文献报道芳香胺类化合物2-NA、4-ABP及o-TOL可作为卷烟烟气暴露生物标志物，且吸烟人群尿液中这三种芳香胺含量明显高于非吸烟者人群[6_9]。因此，建立一种稳定可靠的分析检测尿液中芳香胺类化合物的方法是研究人群对芳香胺的暴露情况的技术基础。现有技术采用液相色谱法(HPLC) [6]、气相色谱法(GC) [7]、气相色谱/质谱法(GC-MS) [8’9]等测定人体尿液中芳香胺类化合物含量。HPLCte]和GC法m方法灵敏度低，不适合尿样中低含量芳香胺的检测。而6^3法[8'9]因灵敏度高，是目前最常用的检测方法。该方法首先采用浓HCl加热水解尿样，处理后的样品先采用正己烷萃取，然后采用无水Na2SO4干燥处理，再用五氟丙酸酐对芳香胺进行衍生化反应，之后还要采用多步萃取及浓缩步骤，所得样品才能进行GC-MS分析。可见，GC-MS法样品前处理非常繁琐耗时，不利于分析效率的提闻。

发明内容
本发明的目的正是针对现有技术中人体尿液中芳香胺化合物的测定方法前处理繁琐费时的问题，而提供的一种液相色谱-串联质谱方法。该方法可检测人体尿液中七种芳香胺类化合物，其灵敏度、重现性、稳定性及回收率均可达到相关要求。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的采用浓HCl水解尿液，采用PAH分子印迹柱对样品进行纯化处理后，进液相色谱-串联质谱联用仪(LC-MS/MS)分析。具体包括以下步骤
a、将于_18°C中储存的尿样取出并于室温下解冻。取一定量解冻的尿样置于塑料离心管中，加入浓盐酸溶液，恒温水浴。待样品冷却后，加入一定量NaOH溶液中和至pH约7. 0，随后加入一定量乙酸铵-氨水缓冲溶液。加入氘代内标溶液。采用PAH分析印迹柱对样品进行纯化处理。样品溶液上样到已活化的PAH分子印迹柱，采用环己烷洗涤后，用乙酸乙酯洗脱。洗脱液采用氮气吹干，加入甲醇溶液复溶，进LC-MS/MS分析。b、样品的分析
LC-MS/MS 分析所用色谱柱为 Waters C18 (100 mmX2. Imm i. d. , 2. 7 iim)，柱温30°CV流动相A为含0. 1%甲酸的水溶液，流动相B为含0. 1%甲酸的乙腈溶液；采用梯度洗脱，洗脱条件如表I ;进样体积10 U L0离子源电喷雾电离源(ESI);扫描方式正离子扫描；检测方式多反应监测MRM;电喷雾电压5500V ;气帘气压力30 psi ;辅助气I压力70 psi ;辅助气2压力70 psi ；离子源温度500 °C;各化合物的定量离子对、定性离子对、驻留时间、碰撞能量(CE)及去簇电压(DP)参见表2。表I :液相色谱梯度洗脱条件_
权利要求
1.一种液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法，即苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、I-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯的检测，其特征在于该方法采用浓HCl水解尿液，并通过PAH分子印迹柱对样品进行纯化处理，进液相色谱-串联质谱联用仪(LC-MS/MS)分析。
2.根据权利要求I所述的液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法，其特征在于具体包括以下步骤 a、将于-18°C中储存的尿样取出并于室温下解冻，取5mL解冻的尿样置于塑料离心管中，加入ImL浓盐酸溶液，恒温水浴；待样品冷却后，加入NaOH溶液中和至pH约7. 0，随后加入IOmL乙酸铵-氨水缓冲溶液；加入氘代内标溶液,采用PAH分析印迹柱对样品进行纯化处理；样品溶液上样到已活化的PAH分子印迹柱，采用环己烷洗涤后，用乙酸乙酯洗脱；洗脱液采用氮气吹干，加入甲醇溶液复溶，进LC-MS/MS分析； b、样品的分析 LC-MS/MS 分析所用色谱柱为 Waters C18 (100 mmX2. Imm i. d. , 2. 7 iim)，柱温30°CV流动相A为含0. 1%甲酸的水溶液，流动相B为含0. 1%甲酸的乙腈溶液；采用梯度洗脱，进样体积10 ii L ; 离子源电喷雾电离源(ESI);扫描方式正离子扫描；检测方式多反应监测MRM;电喷雾电压5500V ;气帘气压力30 psi ;辅助气I压力70 psi ;辅助气2压力70 psi ;离子源温度500 °C。
3.根据权利要求I所述的液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法，其特征在于恒温水浴温度为80 °C，时间为I h。
4.根据权利要求I所述的液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法，其特征在于氘代内标溶液为D7-1-氨基萘和D5-苯胺混合溶液，加入体积为50 ML，其中D7-1-氨基萘为I-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯的内标；D5_苯胺为苯胺、邻，间甲苯胺的内标。
5.根据权利要求I所述的液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法，其特征在于PAH分子印迹柱活化采用I mL环己烷；环己烷洗涤体积为I mL ;乙酸乙酯洗脱体积为10 mL ;复溶的甲醇溶液体积为100 ML。
6.根据权利要求I所述的液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法，其特征在于液相色谱梯度洗脱条件如表I ;表I
全文摘要
一种液相色谱-串联质谱法检测人体尿液中七种芳香胺化合物的方法，即苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯的检测，其特征在于该方法采用浓HCl水解尿液，并通过PAH分子印迹柱对样品进行纯化处理，进液相色谱-串联质谱联用仪(LC-MS/MS)分析。本发明相比现有技术的优点是采用LC-MS/MS法，灵敏度更高，可大大简化样品前处理步骤(耗时约2h)；而文献报道的GC-MS法样品前处理繁琐费时(耗时大于6h)。因此，本发明方法能有效地提高分析效率，非常适合人体尿液中7种芳香胺化合物的分析。
文档编号G01N30/02GK102788852SQ20121033745
公开日2012年11月21日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者余晶晶, 刘克建, 张晓兵, 潘立宁, 王冰, 王昇, 谢复炜, 赵阁 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院