专利名称：一种用膜透性法验证蕨类植物配子体化感作用的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用膜透性法验证蕨类植物配子体化感作用的方法，属于植物生理生态学领域。
背景技术：
化感作用的英文为“Allelopathy”，它源于希腊语“Allelon (相互)”和uPathos (损害、妨碍)”。植物化感作用的理论是1937年由德国科学家H.Molish第一次提出，他把化感作用定义为:所有类型植物(含微生物)之间生物化学物质的相互作用。但是Molish认为，这种相互作用包括有害和有益两个方面。20世纪70年代中期E.L.Rice根据H.Molish的定义和对植物化感作用的进一步研究，界定植物化感作用是指植物(含微生物)通过释放到环境中的化学物质产生对其他植物(含微生物)的直接或间接的有害作用。Rice的定义中的化感作用物质是由植物所释放的化学物质，并强调了化感作用的结果对其他植物或微生物均是有害的。近年来，研究表明，化感物质作用的对象不仅仅是其他植物，有时甚至是同种植物。而化感作用的结果不仅包括有害的，同时也包括一些相互促进的效果。因此，又有人把化感作用称之为植物的相生相克。1984年Rice在《Allelopathy》第二版中，将化感作用给出了较完整的定义:植物或微生物的代谢分泌物对环境中其他植物或微生物有利或不利的作用。现在这个定义已被广泛的接受。化感物质(Allelochemical)是生物体内产生的非营养性物质，能影响其他植物生长、发育、行为或种群的关系，作为化感作用的媒介，其主要是植物的次生代谢物质。植物化感作用的媒介是化学物质，被称为“化感物质”。孔垂华提到“Allelochemical”是指植物所产生并影响其他生物生长、行为和种群的化学物质，不仅包括植物间的化学作用物质，也包括植物和动物间的化学作用物质，而且这些化学物质并没有被要求必须进入环境，也可以在体内进行。现已发现，许多化感物质不仅对植物，而且对微生物、动物特别是昆虫都有作用。植物细胞的细胞质由一层质膜包围着，这种质膜具有选择透性的独特功能。植物细胞与外界环境之间发生的一切物质交换都必须通过质膜进行。各种不良环境因素对细胞的影响往往首先作用于这层由类脂和蛋白质所构成的生物膜。如极端的温度、干旱、盐溃，重金属离子(如Cd2+等)和大气污染物(如so2、hf、o3)等都会使质膜受到不同程度的损伤，其表现往往为细胞膜透性增大，细胞内部分电解质外渗，外液电导率增大。该变化可用电导仪测定出来。细胞膜透性变得愈大，表示受害愈重，抗性愈弱，反之则抗性愈强。

发明内容
本发明提出的是一种用膜透性法验证蕨类植物配子体化感作用的方法，其目的旨在快速、有效且目的明确的判断化感作用对植物的生理变化的响应，特别是对植物膜透性变化的影响。本发明的技术解决方案:一种用膜透性法验证蕨类植物配子体化感作用的方法，包括如下步骤:一、蕨类配子体膜透性数据收集与分析；二、化感作用对植物膜透性变化的验证。本发明的优点:可快速、直接、有效、目的明确的判断化感作用对植物的生理变化的响应，特别是对蕨类配子体的膜透性的影响。
具体实施方式
实施例一种用膜透性法验证蕨类植物配子体化感作用的方法，包括如下步骤:
一、蕨类配子体膜透性数据收集与分析；
二、化感作用对植物膜透性变化的验证。所述的步骤一、蕨类配子体膜透性数据收集与分析；具体包括:
1、实验材料:
DDS-307雷磁直读电导率仪(上海精密科学仪器有限公司)；一次性塑料培养皿15皿；预培养20天的井栏边草配子体；
2、实验处理设计:
1)取预培养20天的井栏边草配子体，放入IOmL设置体积浓度梯度分别为100%、50%、25%、12.5%以及空白组的0.lg/mL的三叶鬼针草叶的水提液的一次性塑料培养皿中，每皿约100枚配子体，每组质量浓度梯度有三个平行组；实验时间为10天，在第2、4、6、8、10天进行井栏边草配子体的膜透性的测定；
2)校准DDS-307雷磁直读电导率仪:将电极放入注入30mL的去离子水的50mL高悬杯中，把“选择”开关指向“检查”，“常数”补偿旋钮指向“ I ”刻度线，“温度”补偿旋钮指向“25”度线，调节“校准”调节旋钮，使仪器显示“100.0PS/cm”，至此校准完毕；每次实验前均需校准DDS-307雷磁直读电导率仪；
3)配子体处理:每组每次选取6枚长势相近的配子体，用直径3mm的钢针在选取的配子体叶片上穿孔，一枚配子体进行两次穿孔；
4)膜电导率的测定:取50mL高悬杯，注入30mL的去离子水，将每组进行过穿孔的配子体放入杯中，I分钟后，用DDS-307雷磁直读电导率仪在I档进行读数，记录此时数值，记为处理电导率值；随后，将盛有配子体的高悬杯，通过恒温电热板加热煮沸，冷却后，用去离子水补充至30mL体积，用DDS-307雷磁直读电导率仪在I档进行读数，记录此时数值，记为煮沸电导率值；
5)实验公式:
电解质的相对外渗率(％)=(处理电导率值-空白电导率值)/ (煮沸电导率值-空白电导率值)
膜伤害度(％)=(处理组电解质的相对外渗率-空白组电解质的相对外渗率)/ (1-空白组电解质的相对外渗率)
3、数据分析:
电解质的相对外渗率(％):在不同浓度梯度的三叶鬼针草叶的水提液的处理下，配子体的电解质的相对外渗率(％)，基本呈现空白组〈12.5%〈25%〈50%〈100%，即随着三叶鬼针草叶的水提液浓度升高电解质的相对外渗率(％)呈上升的趋势，得证随着三叶鬼针草叶的水提液浓度的升高，三叶鬼针草叶的水提液对配子体的化感作用呈加强趋势；
权利要求
1.一种用膜透性法验证蕨类植物配子体化感作用的方法，其特征是该方法包括如下步骤: 一、蕨类配子体膜透性数据收集与分析； 二、化感作用对植物膜透性变化的验证。
2.根据权利要求1所述的一种用膜透性法验证蕨类植物配子体化感作用的方法，其特征是所述的步骤一、 蕨类配子体膜透性数据收集与分析；具体包括， 1、实验材料准备: DDS-307雷磁直读电导率仪；一次性塑料培养皿15皿；预培养20天的井栏边草配子体； 2、实验处理设计: O取预培养20天的井栏边草配子体,放入IOmL质量浓度为0.lg/mL的三叶鬼针草叶的水提液，并设置体积浓度梯度分别为100%、50%、25%、12.5%以及空白组，转移入一次性塑料培养皿中，每皿约100枚配子体，每组体积浓度梯度有三个平行组；实验时间为10天，在第2、4、6、8、10天进行井栏边草配子体的膜透性的测定； 2)校准DDS-307雷磁直读电导率仪:将电极放入注入30mL的去离子水的50mL高悬杯中，把DDS-307雷磁直读电导率仪“选择”开关指向“检查”，“常数”补偿旋钮指向“ I”刻度线，“温度”补偿旋钮指向“25”度线，调节“校准”调节旋钮，使仪器显示“ 100.0PS/cm”，至此校准完毕；每次实验前均需校准DDS-307雷磁直读电导率仪； 3)配子体处理:每组每次选取6枚长势相近的配子体，用直径3mm的钢针在选取的配子体叶片上穿孔，一枚配子体进行两次穿孔； 4)膜电导率的测定:取50mL高悬杯，注入30mL的去离子水，将每组进行过穿孔的配子体放入杯中，I分钟后，用DDS-307雷磁直读电导率仪在I档进行读数，记录此时数值，记为处理电导率值；随后，将盛有配子体的高悬杯，通过恒温电热板加热煮沸，冷却后，用去离子水补充至30mL体积，用DDS-307雷磁直读电导率仪在I档进行读数，记录此时数值，记为煮沸电导率值； 5)实验公式: 电解质的相对外渗率(％)=(处理电导率值-空白电导率值)/ (煮沸电导率值-空白电导率值) 膜伤害度(％)=(处理组电解质的相对外渗率-空白组电解质的相对外渗率)/ (1-空白组电解质的相对外渗率)、数据分析: 电解质的相对外渗率(％):在不同浓度梯度的三叶鬼针草叶的水提液的处理下，配子体的电解质的相对外渗率(％)，基本呈现空白组〈12.5%〈25%〈50%〈100%，即随着三叶鬼针草叶的水提液浓度升高电解质的相对外渗率(％)呈上升的趋势，得证随着三叶鬼针草叶的水提液浓度的升高，三叶鬼针草叶的水提液对配子体的化感作用呈加强趋势； 膜伤害度(％):在不同浓度梯度的三叶鬼针草叶的水提液的处理下，配子体的膜伤害度(%)，基本呈现空白组〈12.5%〈25%〈50%〈100%，即随着三叶鬼针草叶的水提液浓度升高膜伤害度(％)呈上升的趋势，得证随着三叶鬼针草叶的水提液浓度的升高，三叶鬼针草叶的水提液对配子体的化感作用呈加强趋势。
3.根据权利要求1所述的一种用膜透性法验证蕨类植物配子体化感作用的方法，其特征是所述的步骤二、化感作用对植物膜透性变化的验证，具体包括: `1、实验步骤: 1)取100%、50%、25%、12.5%以及空白组的三叶鬼针草叶的水提液的配子体0.1OOg, 2)酶粗提取液的制备:用5mL的pH=7.5的磷酸缓冲液冰浴研磨，5000转/分离心，10分钟后取出待用； 3)丙二醛含量测定: 将体系为质量分数为0.5%的2-硫代巴比妥酸3.5mL和1.5mL酶粗提取液涡旋混匀；在100°C水浴锅上煮沸20分钟；放入冰浴中迅速冷却；在转速10000转/分条件下离心15分钟；取离心后体系的上清液在可见光分光光度仪SP-2100上，分别在450nm、532nm和600nm处测定其吸光度OD值；计算公式:丙二醛(u g_1F ff)=[6.452X (OD532-OD600)-0.559XOD450] XVt+ (VsXff)(式中:Vt:提取液总体积(mL) ；Vs:测定用提取液体积(ml) ；ff:样品鲜重(g))； 4)TBARs含量的测定: 将体系为质量分数为0.1%的三氯乙酸2.5mL和ImL酶粗提取液涡旋混匀；在转速12000转/分条件下离心20分钟；取出上清液，加入1.5mL质量分数为0.6%的2-硫代巴比妥酸2.4mL ;在95°C水浴条件下30分钟；在转速12000转/分条件下离心30分钟；取离心后体系的上清液在可见光分光光度仪SP-2100分别在532nm和600nm处测定其吸光度OD值；计算公式: TBARs (nmol g_1F W)= (OD532-OD600)XVtXVs+ (155XWXA)(式中:Vt:提取液总体积(mL) ；Vs:测定用提取液体积(ml) ；ff:样品鲜重(g) ；A:体系酶提取液体积(mL))； `2、数据分析: O丙二醛含量分析:在不同浓度梯度的三叶鬼针草叶的水提液的处理下，配子体的丙二醛含量，基本呈现空白组〈12.5%〈25%〈50%〈100%，即随着三叶鬼针草叶的水提液浓度升高丙二醛含量呈上升的趋势，证明随着三叶鬼针草叶的水提液浓度的升高，三叶鬼针草叶的水提液对配子体的化感作用呈加强趋势； 2)TBARs含量分析:在不同浓度梯度的三叶鬼针草叶的水提液的处理下，配子体的TBARs含量，基本呈现空白组〈12.5%〈`25%〈50%〈100%，即随着三叶鬼针草叶的水提液浓度升高TBARs含量呈上升的趋势，证明随着三叶鬼针草叶的水提液浓度的升高，三叶鬼针草叶的水提液对配子体的化感作用呈加强趋势； 通过丙二醛和TBARs两个膜相关指数的数据分析，证明三叶鬼针草配子体的化感作用通过膜透性的电导率指标来判定。
全文摘要
本发明是一种用膜透性法验证蕨类植物配子体化感作用的方法，包括如下步骤一、蕨类配子体膜透性数据收集与分析；二、化感作用对植物膜透性变化的验证。本发明的优点可快速、直接、有效、目的明确的判断化感作用对植物的生理变化的响应，特别是对蕨类配子体的膜透性的影响。
文档编号G01N33/50GK103197052SQ201310141380
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月23日 优先权日2013年4月23日
发明者张开梅, 沈羽, 方炎明 申请人:南京林业大学