专利名称：免疫组化检测试剂盒及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种NDPK免疫组化检测试剂盒及其制备工艺。
用nm23基因产物制成的试剂盒在国外已被用于临床肿瘤转移的检测之中。这对于精确预测肿瘤转移趋势、制订合理的治疗方案及预后判断均很有意义。研究表明，如果转移灶中nm23基因表达高于平均水平，则这种病人在转移灶切除后总体存活率显著提高。已知nm23基因低表达是乳腺癌存在转移的一个可靠标志，故检测乳腺癌组织中nm23基因表达水平有助于筛选对化疗敏感的患者，并对其进行治疗。
nm23基因是Steeg等用消减杂交技术从高转移和低转移鼠K-1735黑色素瘤细胞系cDNA文库中分离出来的。人类nm23基因有两个亚型，即nm23-H1和nm23-H2。两者均定位于17号染色体靠近着丝点的位置，即17q21.3。nm23-H1全部编码区由533个核苷酸组成，其蛋白质含152个氨基酸。nm23-H2基因编码的蛋白质氨基酸顺序与nm23-H1基因产物有88％的同源性。nm23-H2蛋白与二磷酸核苷激酶(NDPK)的氨基酸顺序有90％左右的同源性。人类红细胞NDPK由两条多肽链组成，其中A链与nm23-H1编码的氨基酸顺序一致，B链与nm23-H2编码的氨基酸顺序一致。故证实nm23蛋白就是NDPK。NDPK是一组分子量为17KD的泛醌类酶，主要存在于胞浆和质膜上。NDPK功能呈多样性，它能把结合于蛋白质上的二磷酸核苷(NDP)磷酸化成三磷酸核苷(NTP)，是细胞内NTP的主要制造者。NDPK通过两种途径参与细胞调节，一是影响微管聚合，在微管聚合过程中，需要将GDP转换成GTP，微管相关的NDPK通过催化这一反应而参与由微管聚合而成的纺缍体的形成，并调节细胞运动；二是通过影响G蛋白(包括P21及延长因子)的信号传递而发挥负调节作用。G蛋白是一类信号结合蛋白，其与GTP结合后便可发挥催化活性，将GTP水解为GDP，从而引发一系列细胞内信号传递过程。NDPK可介异GDP转化成GTP。故nm23基因的正常表达是维持信号传导系统正常运作的前提。GTP供给不足，微管聚合异常，纺锤体减数分裂障碍，导致细胞异倍体率增高，促进肿瘤发展；微管聚合异常，细胞不能维持正常形态结构而引起运动，参与肿瘤浸润转移和发生发展过程。
本发明的目的在于提供一种NDPK免疫组化检测试剂盒及其试剂盒中nm23单克隆抗体、多克隆抗体和其它缓冲剂的制备工艺，能够快速的普查肿瘤组织nm23的表达，评估肿瘤的转移能力及趋势。
本试剂盒每盒是由以下物质组成PBS(20倍浓度)1瓶过氧化氢液(30％) 1瓶阻断试剂(浓硫酸95-98％) 1瓶nm23单克隆抗体 1瓶多克隆抗体 1瓶辣根过氧化物酶标记物 1瓶邻苯二胺 1瓶其中PBS PBS(20倍浓度)、过氧化氢液(30％)、阻断试剂(浓硫酸95-98％)、辣根过氧化物酶标记物、邻苯二胺为现有物质；nm23单克隆抗体、多克隆抗体是由本发明的工艺制备而成。
本发明的制备工艺是通过以下步骤实现的1.多克隆抗体的制备1.1 NDPK-A抗原瑞森基因项目工程药物研究所制备1.2动物成年纯种大耳白兔
1.3方法A.免疫准备于每只家兔两后肢脚掌皮下注入活BCG各0.5ml，共1ml含蛋白5-6mg。
B.第一次免疫注射弗氏完全佐剂(FCA)抗原的制备，取不完全佐剂5ml，缓慢滴加BCG，边滴边研磨。再逐滴加入等量NDPK-A抗原液(边滴边研磨)直至形成油包水乳剂，滴1滴于冷水上久置不散为合格，滴加BCG及抗原时不可太快，加1滴充分研匀再滴下1滴，最后所制弗氏完全佐剂中，应含BCG5-6mg/ml，抗原5mg/ml。
免疫准备后10天左右，于每只兔两后支窝已肿大的淋巴结构内或其近旁各注入弗氏完全佐剂抗原(NDPK-A)0.5ml，共1ml，含蛋白5mg。
C.第二次免疫注射间隔2-3周后，于每只兔脊柱两侧，两肩部，两臀部及两腹股沟皮下作多点注射，每点0.2ml弗氏完全佐剂抗原，共8-10点。
D.第三次免疫注射间隔2-3周后，再于每只家兔脊柱两侧、肩部、两臀部选不同点上，作皮下多点注射，共8点，每点注射弗氏不完全佐剂抗原(不含BCG)0.2ml。
E.试血测抗体效价间隔7-10天，无菌采兔耳静脉血0.5-1ml，分离血清，以双向琼脂扩散试验测抗体效价。效价＞1∶32时，可以放血。
否则，以不加佐剂的抗原作静脉注射免疫，一周内注射3次，
依次为0.1、0.3、0.5m.l(含人NDPK-A分为1mg，3mg，5mg)。
一周后再试血测效价，达到要求，立即放血。
F.放血采用颈动脉采血法。
G.分离血清将放出或抽出的血液倾斜放入37℃孵箱15-30分钟，再移至4℃数小时，待血块收缩，血清析出时，吸出血清，放入试管中，2000转/分钟离心30分钟。
H.IgG的分离纯化IgG的提取分两步进行，第一步采用盐析法粗提人γ球蛋白；第二步将提取的γ球蛋白再以DEAE-Sephadex A50柱层析提纯IgG。具体方法如下取血清60ml+生理盐水60ml，于搅拌下逐滴加入饱合硫酸铵120ml，4℃，30分钟，离心3000转X20分钟，弃上清，加生理盐水60ml溶液，于搅拌下逐滴加入饱合硫酸铵1/2 30ml，4℃，3小时，离心3000转/分X20分钟，弃上清，以0.02M PH7.4 PBS溶解沉淀物至Xml。在PH7.2-7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A50吸附，只有IgG不被吸附，而成为穿过峰，获得较纯的IgG。
2.单克隆抗体的制备2.1小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug NDPK-A加福氏完全佐剂腹腔注射，间隔2-3周后，用同样剂量NDPK-A腹腔加强免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾细胞融合。
2.2抗原NDPK-A，由陕西瑞森基因工程药物研究所提供。
2.3细胞融合，免疫小鼠脾细胞和Sp2/0细胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，进行细胞融合，用ELISA间接法初步筛选出阳性克隆，再用中和抑制试验证实为阳性克隆后，经有限稀释法克隆2-3次，筛选出分泌抗体阳性的单个克隆，稳定传代3个月，制备腹水和液氮冻存。
2.4单克隆抗体的鉴定2.4.1杂交瘤细胞系染色体分析取对数生长期的杂交瘤细胞用秋水仙素处理，经Giemsa染色，镜检计数。
2.4.2 Ig类及IgG类测定用美国Sigma公司的抗鼠Ig亚类抗血清与浓缩至原容积1/20的杂交瘤细胞培养上清液作琼脂双向免疫扩散。
2.4.3单克隆抗体特异性的测定将NDPK-A进行电转移，而后用各株单抗分别进行ELISA染色。
2.4.4单克隆抗体比活性测定将各株单抗的蛋白进行定量，然后按不同稀释度测定各株的滴度。
3.多克隆抗体或单克隆抗体测定肿瘤组织中的NDPK-A3.1试剂盒组成PBS(20倍浓度)1瓶过氧化氢液(30％) 1瓶阻断试剂(浓硫酸95-98％) 1瓶nm23单克隆抗体 1瓶多克隆抗体 1瓶辣根过氧化物酶标记物 1瓶邻苯二胺 1瓶3.2标本收集切片及保存A.收集肿瘤手术新鲜组织1小块。
B.组织快浸入冰冻组织介质中。
C.浸入液氮直至全组织硬化。
D.放入干冰中。
E.移至-70℃冰箱中，直至切片(不能贮存组织在无霜冰箱中)。
F.切片厚度5微米。
G.切片在-20℃丙酮中固定5分钟。
H.切片完全干后，-70℃保存。3.3石腊切片A.石腊组织块切片室温下干燥过夜(或60℃烤干1小时)室温下备用。
B.二甲苯脱腊2次，每次10分钟。
C.100％乙醇2次，每次2分钟。
D.将切片置于3％过氧化氢甲醇溶液中10分钟(阻断内源过氧化物酶活性)。
E.水冲洗切片后置PBS中。
F.PBS洗2次后，擦干多余液体，加1抗100ul，湿盒(有盖饭盒内平铺几层湿纱布)4℃过夜。3.4试剂贮存A.4C保存有效期6个月，-20℃可长期保存。
B.加二抗及酶酸物不宜冰冻，置4℃保存。3.5检测步骤A.冰冻切片从冰箱取出置室温，PBS冼3次。石腊切片见石腊切片部分。
B.切片在PBS溶解的0.3％的过氧化氢中10分钟。
C.擦干样品周围液体，用封闭阻断剂室温浸润5分钟(不能超过10分钟)擦干。
D.加一抗使用液100ul，置湿盒，室温1小时。
E.PBS洗3次，每次2分钟。
F.擦去多余液体，加100ul二抗使用液，湿盒内室温30分钟。
G.同4步H.擦去多余液体，加酶酸物100ul，湿盒内室温30分钟。
I.同4步J.加底物I 20-50ul到1ml底物II混匀，在20分钟内加到切片上，温育切片5-20分钟。
K.除去底物残液，蒸馏水洗3次。
L.苏木素复染。
M.逐级脱水、透明、封片。
N.显微镜下观察。3.6判断结果A镜检下癌转移者应无染色。
B染色程度与癌转移呈负相关。
权利要求
1.NDPK免疫组化检测试剂盒，包括20倍浓度的PBS、30％的过氧化氢液、95-98％的浓硫酸、辣根过氧化物酶标记物、邻苯二胺，其特征在于，还包括nm23单克隆抗体和nm23多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒的制备工艺，其特征在于，按以下A、B、C、D、E、F、G、H八种步骤制备nm23多克隆抗体A.免疫准备于每只家兔两后肢脚掌皮下注入活BCG各0.5ml，共1ml含蛋白5-6mg；B.第一次免疫注射弗氏完全佐剂(FCA)抗原的制备，取不完全佐剂5ml，缓慢滴加BCG，边滴边研磨，再逐滴加入等量NDPK-A抗原液(边滴边研磨)直至形成油包水乳剂，滴1滴于冷水上久置不散为合格，滴加BCG及抗原时不可太快，加1滴充分研匀再滴下1滴，最后所制弗氏完全佐剂中，应含BCG5-6mg/ml，抗原5mg/ml；免疫准备后10天左右，于每只兔两后支窝已肿大的淋巴结构内或其近旁各注入弗氏完全佐剂抗原(NDPK-A)0.5ml，共1ml，含蛋白5mg；C.第二次免疫注射间隔2-3周后，于每只兔脊柱两侧，两肩部，两臀部及两腹股沟皮下作多点注射，每点0.2ml弗氏完全佐剂抗原，共8-10点；D.第三次免疫注射间隔2-3周后，再于每只家兔脊柱两侧、肩部、两臀部选不同点上，作皮下多点注射，共8点，每点注射弗氏不完全佐剂抗原(不含BCG)0.2ml；E.试血测抗体效价间隔7-10天，无菌采兔耳静脉血0.5-1ml，分离血清，以双向琼脂扩散试验测抗体效价。效价＞1∶32时，可以放血，否则，以不加佐剂的抗原作静脉注射免疫，一周内注射3次，依次为0.1、0.3、0.5m.l(含人NDPK-A分为1mg，3mg，5mg)，一周后再试血测效价，达到要求，立即放血；F.放血采用颈动脉采血法；G.分离血清将放出或抽出的血液倾斜放入37℃孵箱15-30分钟，再移至4℃数小时，待血块收缩，血清析出时，吸出血清，放入试管中，2000转/分钟离心30分钟；H.IgG的分离纯化IgG的提取分两步进行，第一步采用盐析法粗提人γ球蛋白；第二步将提取的γ球蛋白再以DEAE-Sephadex A50柱层析提纯IgG。具体方法如下取血清60ml+生理盐水60ml，于搅拌下逐滴加入饱合硫酸铵120ml，4℃，30分钟，离心3000转X20分钟，弃上清，加生理盐水60ml溶液，于搅拌下逐滴加入饱合硫酸铵1/2 30ml，4℃，3小时，离心3000转/分X20分钟，弃上清，以0.02M PH7.4 PBS溶解沉淀物至Xml，在PH7.2-7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A50吸附，只有IgG不被吸附，而成为穿过峰，获得较纯的IgG。
3.根据权利要求1所述的试剂盒的制备工艺，其特征在于，按以下步骤制备nm23单克隆抗体(1)小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug NDPK-A加福氏完全佐剂腹腔注射，间隔2-3周后，用同样剂量NDPK-A腹腔加强免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾细胞融合；(2)细胞融合，免疫小鼠脾细胞和Sp2/0细胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，进行细胞融合，用ELISA间接法初步筛选出阳性克隆，再用中和抑制试验证实为阳性克隆后，经有限稀释法克隆2-3次，筛选出分泌抗体阳性的单个克隆，稳定传代3个月，制备腹水和液氮冻存。
全文摘要
本发明提供一种NDPK免疫组化检测试剂盒,包括20倍浓度的PBS、30%的过氧化氢液、95—98%的浓硫酸、辣根过氧化物、酶标记物、邻苯二胺、nm23单克隆抗体和nm23多克隆抗体,同时,本发明还提供了nm23单克隆抗体、nm23多克隆抗体的制备工艺,能够快速地普查肿瘤组织nm23的表达,评估肿瘤的转移能力及趋势。
文档编号G01N33/531GK1260491SQ99115900
公开日2000年7月19日 申请日期1999年11月9日 优先权日1999年11月9日
发明者赵永同, 祁淼 申请人:赵永同, 祁淼