专利名称：用胶体金免疫层析试检测玉米赤霉烯酮毒素的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测技术领域的方法，特别是一种用胶体金免疫层析试检测玉米赤霉烯 酮毒素的方法。
背景技术：
玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone， ZEN)是镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生 的次级代谢产物。玉米赤霉烯酮毒素可存在于玉米、小麦、大麦、高梁、黑麦等谷物，也可 存在于食用含ZEN饲料的动物组织中，包括牛奶、鸡蛋等。玉米赤霉烯酮毒素与自发性乳腺 癌，输卵管和子宫水肿、增生，精细胞畸变、凋亡等疾病有关。玉米赤霉烯酮毒素具有分布 广泛、残留时间长、难处理、和其他毒素一起有增强毒性的现象。加入WT0之后，农产品及 相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了 保证这类产品的顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门 迫切需要一种快速简便的玉米赤霉烯酮毒素检测方法。
胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用抗原抗体反应的一种免疫标记技术。 胶体金是由氯金酸(HAuC14)在还原剂如白磷、单宁酸/柠檬酸钠和柠檬酸三钠等作用下(本 发明用的是柠檬酸三钠作为还原剂)，聚合成特定大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳 定的胶体状态，故称为胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质高分子被吸附到胶体金颗粒表 面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团因静电作 用而形成牢固结合。这种球型的胶体金颗粒具有高电子密度，能够对多种生物高分子物质如 葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、BSA (牛血清白蛋白)等非共 价结合，形成可见的紫红色，使其成为免疫反应的优良标记物，因此广泛应用于各种物质的 检测。
酶联免疫吸附实验由于液相中的抗原(或抗体)需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反 应，需较长时间，各个步骤需彻底地洗涤，并且需要特定的酶和底物显色，因此耗时长，程 序繁琐；高效液相色谱法因其对检测样品、仪器及操作人员的要求，不利于基层常规检测使 用。胶体金免疫层析法能克服上述方法的不足，胶体金免疫层析试验法利用抗原抗体反应原 理，胶体金标记示踪物与固定在膜上的抗原或抗体形成复合物被截留而显色，不需要特定的 酶和底物显色，也不需要抗原抗体之间的较长时间的物理吸附，而根据显色与否判定阴阳性结果，安全有效，简单方便。
胶体金免疫层析试验的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的胶体金标记。固定在 NC膜上的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，胶体金标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性， 又有示踪的功能。在测定时，受检样品(测定其中的抗体或抗原)通过毛细作用向前移行与 金标垫上的抗原或抗体起反应。继续向前移行，与固定在T线(检测线)抗原或抗体结合形 成免疫复合物被截留而显色，约为一条宽为lmm的棕红色条带，多余的金标抗体继续向前移 动，与固定在C线(质控线)的二抗结合被截留而显色，约为一条宽为lmm的棕红色条带。此 时T线形成金标复合物与标本中受检物质的量呈一定的比例，故可根据T线呈现的颜色深浅进 行定性或半定量分析。本发明采用的是胶体金免疫层析试验竞争结合法，是以ZEN的偶联物 ZEN- 0VA (卵清白蛋白)固定T线，胶体金标记抗ZEN的单克隆抗体附着于金标垫，兔抗鼠的 多克隆抗体固定C线，将样品液滴入样本槽，根据T线的显色与否来判定结果，C线的显色与 否来判定试纸条的本身质量。
关于玉米赤霉烯酮毒素的检测国内外已建立了多种方法。目前检测ZEN的方法主要为高 效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，液谱和质谱联用法(LC-MS)。 然而，这些方法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同 时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速检测玉米赤霉烯酮毒素的方法。 本发明可特异性检测ZEN毒素，准确率高，检测速度快，所需时间仅为5 10分钟。 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤
步骤一，将ZEN (玉米赤霉烯酮毒素)半抗原通过活泼酯法分别与BSA (牛血清白蛋白)和
0VA (卵清白蛋白)偶联，得到ZEN的偶联物ZEN-BSA和ZEN-OVA;
步骤二，利用ZEN-BSA为免疫原，采用常规方法制备抗ZEN的单克隆抗体；
步骤三，用柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金，用该胶体金标记经过透析除盐处理的
抗ZEN的单克隆抗体；
步骤四，将步骤三所得的已标记的单克隆抗体喷涂到金标垫上，将ZEN-OVA喷涂到T线， 兔抗鼠的单克隆抗体喷涂到C线，组装成试纸条，干燥；
步骤五，将待测样品用甲醇提取，离心，取上清，将上清滴入试纸条的样本槽中，获取 T线和C线的显色，鉴定，得到结果。
步骤三中，所述胶体金的制备方法具体为将100ml的0.005。/。HAuCl4溶液加热至沸腾，之后加入O. 5 lml的P/。柠檬酸三钠水溶液，煮沸7 10min，最后加三蒸水至100ml，制备得 到40nm的胶体金溶液；其中，百分数为重量体积百分数。
步骤三中，所述标记具体为在搅拌的条件下，向胶体金溶液中加入单克隆抗体，使其 终浓度达到40ug/mL， 25。C下孵育5min，用O. lmol/L K2C03调节胶体金溶液的pH为9. 0，然后 加入10。/。BSA至BSA的终浓度为0. 1%， 10000rpm离心20min，弃上清，再用O. OlmM pH为9. 0的 Tris缓冲液恢复，重复1次，之后将沉淀重悬于原体积的l/10的0.01mM pH为9. O的Tris缓冲 液中，最后加入10。/。BSA至BSA的终浓度为0. 1%， 4。C储存备用；其中，百分数为重量体积百分 数。
步骤四中，所述干燥为37"C烘箱干燥。 步骤五中，所述甲醇为体积分数为80%的甲醇。 步骤五中，所述离心为2500g离心15分。
步骤五中，所述鉴定具体为在C线上出现棕红色条带，待测样品中含玉米赤霉烯酮毒 素；在T线和C线上均出现棕红色条带，待测样品中不含玉米赤霉烯酮毒素。
本发明是鉴于待测样品若有ZEN毒素，由于毛细效应向前层析移动，样品液中的ZEN与金 标单克隆抗体形成的复合物，竞争了T线上抗原与金标单克隆抗体结合的机会，所以胶体金 不能或仅少量能被T线上的抗原截流而沉积，故而以T线不显色或显色很浅来判定样品中有 ZEN;相应地待测样品若没有ZEN， T线则显色，呈现出清晰的红色条带，由此判定食品、动 物产品等检测样品中ZEN的含量。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明检测对象单一且针对性强，准确 率高。检测速度快，所需时间短，只需5 10分钟、不需经培训的专业人员就可使用本发明 方法来检测，满足粮食储存销售机构、出入境、海关等检验部门快速、正确地判断ZEN毒素 含量的要求，并且便于基层推广和运用。


图l为本发明实施例试纸条的结构图； 图2为本发明实施例试纸条的结果图； 其中，a为阳性结果示意图，b为阴性结果示意图。
具体实施例方式
以下对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施， 给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未 注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。
本实例首先将ZEN连接到OVA或BSA上获得具有免疫原性的完全抗原，并通过透析及超滤 离心纯化该抗原；将该BSA与ZEN偶联的抗原ZEN-BSA作为免疫原免疫Balb/C小鼠制备单克隆 抗体，并用0VA与ZEN偶联的抗原ZEN-0VA作为包被抗原采用间接酶联免疫吸附实验测定抗 ZEN抗体效价；纯化单克隆抗体；用1% (W/V)的柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金，并标 记纯化的单克隆抗体蛋白；按金标单克隆抗体、ZEN-0VA偶联抗原、兔抗鼠多克隆抗体喷涂 金标垫、检测线(T线)、质控线(C线)，然后组装成试纸条，置37'C烘箱烘干，存放-2(TC 冰箱保存备用；检测时，待试纸条于密封包装中恢复至室温后，将测试端插入样品液中，5 10分钟观察结果。
实施例
步骤一，抗原的制备
(1) 免疫抗原的制备取0. 33ml(3mg/ml)ZEN，混合于1.2ml吡啶中，加入2mg 0-羧甲 基羟胺，室温搅拌反应24h。真空干燥后，加入4ml蒸馏水，并使其溶解，调整pH至8.0。未 反应的ZEN用苯抽提除去(3ml苯，共抽提3次)，除去苯相，保留水相。水相调pH至3. 0，用 乙酸乙酯抽提(10ml乙酸乙酯，共抽提4次)，抽出酯相，弃水相。酯相用无水硫酸钠滤过 后吹干。吹干后的结晶物溶于O. 5ml碱性氧化铝处理过的二氧六环中。称取20mgBSA溶于
0. 7ml 0. 05mol/L (pH7. 2)的PBS中，将两溶液于4。C缓慢混合。lmg NHS禾口2mg DCC溶于 0.2ml二氧六环中，并缓慢滴加此溶液。将混合后的溶液放置室温搅拌反应16h。调pH至6.0 ，通风橱中吹干，缓慢滴加DCC溶液(2mgDCC溶于0.2ml二氧六环中)。室温搅拌反应48h。 最后用PBS透析2 3d， -2(TC保存。
(2) 包被抗原的制备类似免疫抗原的制备，将BSA换为0VA即可。 步骤二，单克隆抗体的制备
将ZEN-BSA完全抗原溶解于PBS中，测定完全抗原中载体蛋白的浓度。将抗原与等量的弗 氏完全佐剂充分乳化，皮下注射免疫6周龄Balb/C小鼠，每只O. lml; 二免两周后，改用弗 氏不完全佐剂，用同样的方法和剂量，进行免疫；三免，操作同二免。免疫5天后眼底静脉采血测效价，效价达到1:10000以上时加强免疫腹腔注射不加佐剂的抗原O. lml，三天后处 死小鼠，取其脾脏，与骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。通过小鼠 腹腔注射杂交瘤细胞来大量制备小鼠腹水，腹水经过过滤、离心初步纯化后，采用辛酸法和 亲和层析法纯化腹水。
步骤三，胶体金的制备及单克隆抗体的标记
先将100ml的0. 005% (W/V) HAuC14溶液加热至沸腾，迅速加入O. 5 lml的1% (W/V)柠 檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7 10min出现透 明的酒红色，最后加三蒸水至100ml，就这样制备了40nm的胶体金溶液。然后用电镜镜检， 确保制备的金颗粒尽量使其大小一致，均匀，颗粒直径在40nm左右，否则重新制备。
待标记的抗体蛋白用O. 005mol/L的氯化钠溶液透析48小时除盐，然后用制备好的40nm的 胶体金来标记多克隆抗体蛋白。具体步骤为①向搅拌中的胶体金溶液里迅速加入抗体蛋白 使其终浓度达到40ug/mL， 25。C室温下孵育5min;②用0. lmol/L K2C03调节金溶液的pH为 9.0，然后加入10% (W/V) BSA至终浓度O. 1%来稳定胶体金溶液，反应5min;③10000rpm离心 20min，弃上清，再用0.01mMTris (pH=9.0)的缓冲液恢复，重复1次，以除去未与金颗粒 结合的抗体；④最后一次离心后将沉淀重悬于原体积的l/10的0.01mM Tris (pH=9.0)缓冲 液中，最后加入BSA至终浓度为O. 1% (W/V) ， NaN3至终浓度0. 02% (W/V) ， 4"C储存备用。 以上操作中应注意， 一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。
步骤四，胶体金试纸条的组装
将标记好的单克隆抗体蛋白喷涂到金标垫上，喷涂ZEN-OVA偶联抗原到T线，喷涂二抗到 C线，然后组装好试纸条，37'C烘箱干燥，置4'C冰箱保存备用。试纸条的组装顺序如附图l ，试纸条的组装顺序如附图l，由下到上的顺序为l为塑料底衬、2为硝酸纤维素膜、3为金标 垫、4为样品垫、5为吸水垫。
步骤五，胶体金试纸条的使用及结果判定
把待检样品滴入试纸条的样本槽中，由于毛细效应，液体的层析方向向上，若待检液中 含ZEN，当待测液进入测试端时，由于毛细效应往前移动，ZEN与金标垫上的金标单克隆抗体 (Au-Ab)形成Au-Ab- ZEN二联复合物，复合物在NC膜上继续层析泳动，无法与检测线(T 线)上的ZEN-OVA偶联抗原结合而不能被固定在T线抗原截留下来，无法形成可见的棕红色条 带；Au-Ab- ZEN复合物由于层析作用，继续迀移向前，与固定在质控线(C线)上的兔抗鼠 多克隆抗体结合而被截留下来，形成可见的棕红色条带，进行定性判定；根据检测线显色深 浅程度来大概判定检测到的ZEN含量，属于半定量，然后再结合酶联免疫试验进行定量，如图2中a所示。
若待测液不含ZEN，金标垫的金标鼠单克隆抗体继续向前移动，则与检测线(T线)的 ZEN-0VA结合，形成Au-Ab-ZEN-OVA而被截留，形成可见的棕红色条带，多余的金标单克隆体 继续层析向上，与固定在质控线(C线)上的二抗结合形成二联复合物被截留下来，形成可 见的棕红色条带，如图2中b所示。
本实施例的方法可直接检测样品中的ZEN，不需要专业培训，操作方便、快速，5 10分 钟即可获得结果，能快速、简便、及时地检测ZEN的目的。
权利要求
1、一种用胶体金免疫层析试检测玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，将ZEN半抗原通过活泼酯法分别与BSA和OVA偶联，得到ZEN的偶联物ZEN-BSA和ZEN-OVA；步骤二，利用ZEN-BSA作为免疫原，采用常规方法制备抗ZEN的单克隆抗体；步骤三，用柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金，用该胶体金标记经过透析除盐处理的抗ZEN的单克隆抗体；步骤四，将步骤三所得的已标记的单克隆抗体喷涂到金标垫上，将ZEN-OVA喷涂到T线，兔抗鼠的单克隆抗体喷涂到C线，组装成试纸条，干燥；步骤五，将待测样品用甲醇提取，离心，取上清，将上清滴入试纸条的样本槽中，获取T线和C线的显色，鉴定，得到结果。
2、 根据权利要求l所述的用胶体金免疫层析试检测玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特征 是，步骤三中，所述胶体金的制备方法具体为将100ml的0.005。/。HAuC14溶液加热至沸腾， 之后加入O. 5 lml的P/。柠檬酸三钠水溶液，煮沸7 10min，最后加三蒸水至100ml，制备得 到40nm的胶体金溶液；其中，百分数为重量体积百分数。
3、 根据权利要求l所述的用胶体金免疫层析试检测玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特 征是，步骤三中，所述标记具体为在搅拌的条件下，向胶体金溶液中加入单克隆抗体，使其终浓度达到40ug/mL， 25。C下孵育5min，用0. lmol/L K2C03调节胶体金溶液的pH为，9.0，然后加入10。/。BSA至BSA的终浓度为0. 1%， 10000rpm离心20min，弃上清，再用 O.OlmM pH为9.0的Tris缓冲液恢复，重复1次，之后将沉淀重悬于原体积的1/10的 0. OlmM pH为9. O的Tris缓冲液中，最后加入10。/。BSA至BSA的终浓度为0. 1%， 4。C储存备用 ;其中，百分数为重量体积百分数。
4、 根据权利要求l所述的用胶体金免疫层析试检测玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特 征是，步骤四中，所述干燥为37'C烘箱干燥。
5、 根据权利要求l所述的用胶体金免疫层析试检测玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特 征是，步骤五中，所述甲醇为体积分数为80%的甲醇。
6、 根据权利要求l所述的用胶体金免疫层析试检测玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特 征是，步骤五中，所述离心为2500g离心15分。
7、 根据权利要求l所述的用胶体金免疫层析试检测玉米赤霉烯酮毒素的方法，其特 征是，步骤五中，所述鉴定具体为在C线上出现棕红色条带，说明待测样 品中含玉米 赤霉烯酮毒素；在T线和C线上均出现棕红色条带，说明待测样品中不含玉米赤霉烯酮毒 素。
全文摘要
一种检测技术领域的用胶体金免疫层析试检测玉米赤霉烯酮毒素的方法，包括如下步骤将ZEN半抗原通过活泼酯法分别与BSA和OVA偶联，得到ZEN的偶联物ZEN-BSA和ZEN-OVA；利用ZEN-BSA作为免疫原，采用常规方法制备抗ZEN的单克隆抗体；用柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金，用该胶体金标记经过透析除盐处理的抗ZEN的单克隆抗体；将步骤三所得的已标记的单克隆抗体喷涂到金标垫上，将ZEN-OVA喷涂到T线，兔抗鼠的单克隆抗体喷涂到C线，组装成试纸条，干燥；将待测样品用甲醇提取，离心，取上清，将上清滴入试纸条的样本槽中，获取T线和C线的显色，鉴定，得到结果。本发明可特异性检测ZEN毒素，准确率高，检测速度快，所需时间仅为5～10分钟。
文档编号G01N33/577GK101650368SQ20091030780
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月27日 优先权日2009年9月27日
发明者严亚贤, 孙建和, 君 王, 王元凯 申请人:上海交通大学