专利名称：一种检测农产品中2,4-二氯苯氧乙酸的压电免疫传感方法
技术领域：
本发明涉及生物检测方法，具体是一种检测农产品中2，4-二氯苯氧乙酸的压电 免疫传感方法。
背景技术：
2， 4-D是一种应用广泛的植物生长调节剂，其测定方法有萃取_光度法、液相色谱 法、液相色谱质谱法、薄层色谱法、衍生气相色谱法等。但这些传统方法都有一定的局限性， 如样品前处理复杂、操作繁琐费时、测定周期长、设备昂贵、灵敏度低等。免疫传感器是利 用电化学免疫传感器的高灵敏度、简便、快速等特点，结合生物识别系统(抗原抗体特异性 结合)而形成的一种自动化分析检测系统，具有操作简单、快速、灵敏度高等优点，在2，4-D 的测定中引起高度重视，因此，研究一种高灵敏度、简便、快速的2，4-D免疫传感测定新方 法有非常重要的意义。

发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种农产品中2，4-D含量 的检测方法。本发明能较好的满足2， 4-D测定的需要，且方法简单，快速，灵敏度高，为检测 2，4-D提供了一种新的途径。 为了达到上述目的，本发明提供的检测农产品中2，4-D含量的方法包括以下步 骤2，4-D与BSA的偶联；在金电极表面制备无试剂型2，4-D压电免疫传感器；制备纳米金
标记的羊抗鼠IgG抗体；制作标准工作曲线；样品检测。 本发明解决其技术问题所采用的技术方案还可以进一步完善。所述2，4-D与BSA 的偶联可以由以下步骤制备称取3. 315g 2，4-D(0.015mmo1)溶解在0. 5mL的无菌DMF中， 再称取NHS 4. 028g(0. 035,1) 、EDC 6. 71g (0. 035,1)同时加入2， 4-D的无菌DMF中，室 温下搅拌反应5小时(130rpm， 28°C )。再称取0. 024gBSA溶于2. 4mL pH 11的硫酸缓冲液 中，然后将含有2， 4-D的无菌DMF缓慢加入到BSA的硫酸缓冲液中，约15min加完，在室温 下慢速搅拌反应4小时，4t:过夜。将反应液放入透析袋，在500mL 10%的DMF液中4t:透 析二次，4h/次；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4-D与BSA的偶联物。将 2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，备用。 所述无试剂型2，4-D压电免疫传感器可以由以下步骤制备(l)石英晶振表面 的半胱胺盐酸盐溶液自组装向洗净的石英晶振内加入10. OmM半胱胺盐酸盐溶液，并于 25°C自组装2. 5小时，石英晶振表面用纯水清洗三次，即在晶振表面获得一层致密均匀的 半胱胺自组装单层膜；(2)修饰后的石英晶振表面抗原固定化用2. 5% (V/V)戊二醛溶液 50 ii L活化组装后金电极表面的羧基；经PBS和去离子水清洗后，吹干。将自组装了半胱胺 自组装单层膜的金电极电极表面滴加30 ii L浓度为10. 0 ii g *mL—1的BSA_2，4_D溶液于晶振 表面，置于37t:恒温水浴箱中温育1小时，用PBS和去离子水清洗，晾干；再在电极表面上滴加40 ii Ll% BSA(pH 7. 4)并置于37。C恒温水浴箱中温育1小时，以封闭电极表面多余的 蛋白结合位点，防止免疫测定过程中的非特异性吸附产生误差，经PBS和去离子水清洗后， 吹干，即获得无试剂型2，4-D电化学免疫传感器。 所述的制作标准工作曲线方法为取不同浓度的2，4_D标准溶液和2，4_D抗体 (单抗)混合液，取常规量滴到已制备好的无试剂型2，4-D压电免疫传感器，37t:环境下反 应1小时；接着加入纳米金标记抗体(二抗)，37t:环境下反应1小时，对免疫传感器表面 的频率变化连续检测直到稳态，获得稳定的数值。改变2， 4-D标准溶液的浓度，按上述步骤 测定一系列不同浓度的2，4-D标准溶液，用免疫传感器表面的频率变化值与2，4-D浓度绘 制标准工作曲线。 所述的样品测定方法为取处理好的样品溶液和2， 4-D抗体(单抗)混合液，取常 规量滴到已制备好的无试剂型2，4-D压电免疫传感器，37t:环境下反应l小时；接着加入纳 米金标记抗体(二抗)，37t:环境下反应1小时，对免疫传感器表面的频率变化连续检测直 到稳态，获得稳定数值。将频率变化值与绘制好的标准工作曲线对照获得农产品样品溶液 中2，4-D的数值。 2，4-D压电免疫传感器的检测原理本发明是基于利用压电免疫传感器具有高灵 敏度、简便、快速、可靠等特点，结合生物识别系统(抗原抗体特异性结合)而形成的一种 自动化分析检测系统，实现农产品中2，4-D含量的检测。本发明利用自组装技术和静电吸 附作用，将2，4-D-BSA全抗原固定在通过由自组装半胱胺和静电吸附纳米金修饰的石英晶 振金电极表面，解决了抗原固定的难题，然后在电极上滴加anti-2， 4-D和2， 4-D的混合物， 由于2，4-D和2，4-D-BSA都能与anti-2， 4-D发生高特异性的免疫反应，如果样品中2，4_D 含量高，由于大部分2，4-D抗体已经与样品中2，4-D反应了，结合到金电极表面的2，4-D抗 体就少，这样纳米金标记的二抗结合上去的量也就少。2，4-D和2，4-D-BSA竞争与anti-2， 4-D反应后，用纳米金标记的羊抗鼠IgG将信号进一步放大，然后用石英晶体分析仪及联机 计算机测定。本发明实际上其放大倍数与样品中2，4-D含量成反比，即样品中2，4-D越少， 连接到金电极上的抗体反而越多，纳米金标记的二抗上去的也越多，质量放大越明显。
本发明效果是在2，4-D浓度为13. 3ng/mL-666. 7ng/mL范围内成线性关系，检测 下限为13. Ong/ml，能满足农产品中2，4-D测定的需要。


图1是本发明的农产品实际样品2，4-D含量的检测图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
—、试剂与仪器 半胱胺(Cys， ACROS公司)、BSA_2， 4_D偶联抗原(BSA_2， 4_D)由植物激素与生长 发育湖南省重点实验室合成、配制；戊二醛为Fluka公司产品；鼠抗2， 4-D抗体委托北京博 奥森生物技术有限公司制备；羊抗鼠IgG抗体(G-Anti-MsIgG)和牛血清白蛋白(BSA)从 北京鼎国生物技术有限公司购买；氯金酸和柠檬酸钠购于上海化学试剂公司；不同pH值的 PBS溶液用0. 01M Na2HP04和KH2P04配制;Piranha试剂为按体积比3 : 7配制的H202_H2S04混合液；其它试剂均为分析纯；实验中所用的水为二次蒸馏水。 9腿z， AT-切型双面镀金石英晶振(QCM)购于北京晨星无线电设备厂，使用前用 0型橡胶圈和塑料片将一侧封闭而另一侧粘有一个总体积为300 L的检测池；联机的压 电分析仪(QCA922)购于美国的普林斯顿应用研究所；CSS501型恒温箱购于重庆实验装备 厂；TCL-16A型台式高速冷冻离心机为长沙平凡仪器仪表有限公司产品；扫描电子显微镜 (SEM，JSM 6700F)为日本JEOLLtd.公司产品。
二、实施方法 这种检测农产品中2，4_D的方法，主要包括以下步骤来实现
1. 2，4-D与BSA的偶联:称取3. 315g 2， 4_D (0. 015mmol)溶解在0. 5mL的无菌DMF 中，再称取NHS 4. 028g(0. 035mmol) 、 EDC 6. 71g (0. 035mmol)同时加入2， 4_D的无菌DMF 中，室温下搅拌反应5小时(130rpm， 28°C )。再称取0. 024gBSA溶于2. 4ml pHll的硫酸缓 冲液中，然后将含有2， 4-D的无菌DMF缓慢加入到BSA的硫酸缓冲液中，约15min加完，在 室温下慢速搅拌反应4小时，4t:过夜。将反应液放入透析袋，在500M110X的DMF液中4°C 透析二次，4h/次；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4_D与BSA的偶联物。 将2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，备用。 2.无试剂型2，4-D压电免疫传感器的制备向洗净的石英晶振内加入10. OmM半 胱胺盐酸盐溶液，并于25°C自组装2. 5小时，石英晶振表面用纯水清洗三次，即在晶振表 面获得一层致密均匀的半胱胺自组装单层膜；用2.5% (V/V)戊二醛溶液50iiL活化组装 后金电极表面的羧基。经PBS和去离子水清洗后，吹干。在电极表面滴加30iiL浓度为 10. 0 ii g mL—1的BSA-2， 4-D溶液于晶振表面，置于37。C恒温水浴箱中温育1小时，用PBS 和去离子水清洗，晾干。再在电极表面上滴加40 ii L 1% BSA(pH 7. 4)并置于37。C恒温水 浴箱中温育1小时，以封闭电极表面多余的蛋白结合位点，防止免疫测定过程中的非特异 性吸附产生误差，经PBS和去离子水清洗后，吹干，即获得无试剂型2， 4-D压电免疫传感器。
3.制备纳米金标记的羊抗鼠IgG抗体。 4.标准工作曲线的制作取不同浓度的2，4-D标准溶液和2，4-D抗体(单抗) 混合液，取常规量滴到已制备好的无试剂型2， 4-D压电免疫传感器，37t:环境下反应1小 时；接着加入纳米金标记抗体(二抗)，37t:环境下反应1小时，对免疫传感器表面的频率 变化连续检测直到稳态，获得稳定的数值。改变2， 4-D标准溶液的浓度，按上述步骤测定 一系列不同浓度的2，4-D标准溶液，用免疫传感器表面的频率变化值与2，4-D浓度绘制 标准工作曲线在2，4-D浓度为13. 3ng/mL-666. 7ng/mL范围内成线性关系，校正曲线是y =-279. 1+255. 5x，相关系数R为0. 9957，检测下限为13. Ong/mL。 5.样品检测取处理好的样品溶液和2，4_D抗体(单抗)混合液，取常规量滴到 已制备好的无试剂型2，4-D压电免疫传感器，37t:环境下反应l小时；接着加入纳米金标记 抗体(二抗)，37t:环境下反应1小时，对免疫传感器表面的频率变化连续检测直到稳态，获 得稳定数值。将频率变化与绘制好的标准工作曲线对照获得农产品样品溶液中2，4-D的数 值。 本方法检测实例利用该传感器对用生长调节剂处理过的棉花幼叶中2，4-D残留 量进行了检测取棉花幼叶鲜样1. 5000g，于1. 5mL离心管中冰浴研磨，加入600 y L 100% 的甲醇，混匀后浸提过夜，4800g离心10min，取上清液于一新离心管中，剩余残渣用200 y L100%的甲醇浸提2h， 4800g离心10min，取上清，合并两次上清液，移入一新5mL离心管中。 用3000 ii L超纯水稀释提取液，过Waters S印-pak C18柱，用200iiL 20X甲醇和250iiL 30%甲醇分别洗脱后，用300iiL 100X甲醇洗脱并收集IAA，用于后续的检测和分析。接 着，将收集好的2 ， 4-D用100 ii L 100 %甲醇溶解后，取20 ii L进行HPLC检测，同时，取20 y L 滴加入PBS溶液中，用2，4-D电化学免疫传感器检测，其检测数据表明(图l)，本方法与 HPLC测定的结果基本一致。
权利要求
一种检测农产品中2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的压电免疫传感方法，其特征在于包括以下步骤(1)2，4-D与BSA的偶联；(2)在石英晶振表面制备无试剂型2，4-D压电免疫传感器；(3)制备纳米金标记的羊抗鼠IgG抗体；(4)制作标准工作曲线；(5)样品检测。
2. 根据权利要求1所述的检测农产品中2，4-D的方法，其特征包括 根据权利要求1所述的2，4-D与牛血清白蛋白(BSA)的偶联，其特征在于称取3. 315g2，4-D溶解在0. 5mL的无菌二甲基甲酰胺(DMF)中，再称取N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 4. 028g、二氯乙烷(EDC) 6. 71g同时加入2，4_D的无菌DMF中，室温下搅拌反应5小时 (130rpm，28。C )。再称取0. 024g BSA溶于2. 4mLpH 11的硫酸缓冲液中，然后将含有2，4_D 的无菌DMF缓慢加入到BSA的硫酸缓冲液中，在室温下慢速搅拌反应4小时，4t:过夜。将 反应液放入透析袋，在500mL 10%的DMF液中4。C透析二次(4h/次)；再在500mL的0. OIM 的PBS中透析4次。制得2， 4-D与BSA的偶联物。将2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，备 用。根据权利要求1所述的无试剂型2，4-D压电免疫传感器由以下步骤制备向洗净的石 英晶振内加入10. OmM半胱胺盐酸盐溶液，并于25°C自组装2. 5小时，石英晶振表面用纯水 清洗三次，即在晶振表面获得一层致密均匀的半胱胺自组装单层膜；用2. 5% (V/V)戊二醛 溶液50iiL活化组装后金电极表面的羧基。经PBS和去离子水清洗后，吹干。在电极表面滴 力口 30 ii L浓度为10. 0 ii g. mL—1的BSA_2， 4_D溶液于晶振表面，置于37"恒温水浴箱中温育 1小时，用PBS和去离子水清洗，晾干。再在电极表面上滴加40ii L 1% BSA(pH 7. 4)并置 于37t:恒温水浴箱中温育1小时，经PBS和去离子水清洗后，吹干，即获得无试剂型2， 4-D 压电免疫传感器。根据权利要求1所述标准工作曲线的制作，其特征在于取不同浓度的2， 4-D标准溶液 和2，4-D抗体(单抗)混合液，取常规量滴到已制备好的无试剂型2，4-D压电免疫传感器， 37t:环境下反应1小时；接着加入纳米金标记抗体(二抗)，37t:环境下反应1小时，实验 过程中传感器的频率变化由石英晶体分析仪及联机计算机实时记录。对免疫传感器表面的 频率变化连续检测直到稳态，获得稳定的数值。改变2， 4-D标准溶液的浓度，按上述步骤测 定一系列不同浓度的2， 4-D标准溶液，用免疫传感器表面的频率变化值与2， 4-D浓度绘制 标准工作曲线。根据权利要求1所述的检测农产品中2，4-D的方法，其特征在于取处理好的样品溶液 和2，4-D抗体(单抗)混合液，取常规量滴到已制备好的无试剂型2，4-D压电免疫传感器， 37t:环境下反应1小时；接着加入纳米金标记抗体(二抗)，37t:环境下反应1小时，对免 疫传感器表面的频率变化连续检测直到稳态，获得稳定数值。将频率变化与绘制好的标准 工作曲线对照获得农产品样品溶液中2，4-D的数值。
全文摘要
本发明涉及了一种检测农产品中2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)含量的压电免疫传感方法，主要包括以下步骤来实现1)2，4-D与BSA的偶联；2)电极修饰与免疫传感器的制备；3)制备纳米金标记的羊抗鼠IgG抗体；4)标准曲线的制备；5)样品检测。本发明有益的效果是在检测中，利用纳米金标记的羊抗鼠IgG将信号放大，提高检测灵敏度，从而实现2，4-D的高灵敏定量测定，该方法在2，4-D浓度为13.3ng·mL-1～666ng·mL-1范围内时成线性关系，检测下限为13ng·mL-1。同时，该方法具有方法简便，结果可靠，成本较低等优点。
文档编号G01N27/414GK101782574SQ20101010103
公开日2010年7月21日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者刘清, 王若仲, 肖浪涛, 蔺万煌 申请人:湖南农业大学