专利名称：检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明提供了ー种利用免疫比浊方法測定人血清、血浆样本中非対称ニ甲基精氨酸含量的试剂盒，具体涉及利用人血清、血浆样本中非対称ニ甲基精氨酸和交联有非対称ニ甲基精氨酸-人血清白蛋白复合体的胶乳悬浮液竞争结合鼠抗非对称ニ甲基精氨酸单克隆抗体，通过检测免疫浊度的下降，达到较高的灵敏度和较宽的检测范围，属于医学免疫体外诊断领域。
背景技术：
非对称ニ甲基精氨酸(asymmetric diethylarginine, ADMA)是一种天然氨基酸，广泛存在于组织和细胞中。它能抑制一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的合成及由此而产生的生物学效应，阻止内皮细胞ー氧化氮(NO)的合成，导致血管内皮功能降低。血浆ADMA浓度的变化与血管内皮功能损害、动脉粥样硬化、脑梗死、高血压、高脂蛋白异常、糖尿病、肾功能衰竭等血管性病变的严重程度密切相关，是目前临床研究的重点课题之一。可以说，血浆ADMA的浓度是内皮功能不全和心血管疾病的危险因子。ADMA在体内由精氨酸甲基转移酶生成，精氨酸甲基转移酶有两种类型I型甲基化组蛋白和核内RNA-结合蛋白生成NG-单甲基-L-精氨酸(NG-monomethyl-L-arginine,L-NMMA)和ADMA ；11型仅甲基化髓磷脂主要蛋白产生L-NMMA和対称性ニ甲基精氨酸(symmetricdimethylarginine, SDMA)。L-NMMA 和 ADMA 均能降低 NOS 的活性，但前者血衆浓度大约是ADMA的1/20，因此，大多数研究都针对ADMA的检测。SDMA在血浆中的浓度与ADMA相似，但对NOS没有效应。測定血浆中ADMA的方法包括高效液相色谱、酶联免疫和免疫荧光等。但是生物样品中ADMA的测定比较烦琐，因为存在精氨酸和SDMA与ADMA在检测中表现交叉反应性。ADMA与精氨酸的不同仅在于一个胍基氮上的两个甲基。此外，正常人血清中精氨酸的浓度大约是ADMA浓度的100倍。SDMA比精氨酸更接近于ADMA，不同之处仅在于ー个甲基的位置。在正常人血清中，SDMA的浓度与ADMA的浓度相当，大约为luM。不仅如此，上述检测ADMA的方法，都存在样品处理烦琐、手工操作、耗时间长的特点。因此，发明一种特异性检测人血浆中ADMA，同时能够应用到自动化仪器上的试剂盒成为非常之需。

发明内容
因此，本发明的技术目的在于提供一种能够应用到全自动化生化分析仪器上的非 对称ニ甲基精氨酸检测试剂盒，能够快速、准确的检测人血浆样本中的非対称ニ甲基精氨
酸含量。因此，本发明的第一方面涉及ー种测定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，包括
I)非対称ニ甲基精氨酸Rl试剂；
2)非対称ニ甲基精氨酸R2试剂；3)非対称ニ甲基精氨酸校准品；所述非对称ニ甲基精氨酸Rl试剂包括非対称ニ甲基精氨酸特异性单克隆抗体、缓冲液、稳定剂、促凝剂和防腐剂；所述非对称ニ甲基精氨酸R2试剂包括非対称ニ甲基精氨酸-惰性蛋白复合体包被的胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂；所述非对称ニ甲基精氨酸校准品是由非対称ニ甲基精氨酸、缓冲液、稳定剂和防腐剂组成。优选地，所述非对称ニ甲基精氨酸-惰性蛋白复合体是通过偶联剂将非対称ニ甲基精氨酸和惰性蛋白偶联后而获得。优选地，所述偶联剂选自碳化ニ亚胺(EDAC)、戊ニ醛、ニ异氰酸化合物和ニ卤化ニ硝基苯中的ー种。优选地，所述的惰性蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、血蓝蛋白中的ー种。优选地，所述胶乳颗粒是ー种核壳结构，乳核是聚苯こ烯聚合物，乳壳由苯こ烯、丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸共聚物组成。优选地，所述胶乳颗粒根据其表面所帯的化学基团不同可以选自羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基修饰的ー种。优选地，所述胶乳颗粒直径范围为50-250nm，使用浓度选自O. 05-0. 5%。优选地，所述非对称ニ甲基精氨酸-惰性蛋白复合体可以通过与胶乳颗粒本身携带的化学基团通过化学键结合在胶乳颗粒表面，常用的化学基团包括羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基等，本发明通过优化的化学交联方法将非对称ニ甲基精氨酸-惰性蛋白复合特异性的结合在胶乳颗粒表面的羧基上，所述优化的化学交联方法可以概括为“一歩双pH”法。优选地，所述缓冲液选自3-[N，N-ニ(羟こ基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、4-(2-羟こ基)-1-哌嗪丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和巴比妥缓冲液中的ー种或两种以上，使用浓度选自10-200mM。优选地，所述稳定剂选自O. 1-5%浓度范围的牛血清白蛋白、O. 5-1%浓度范围的氯化钠、2-50mM的EDTA、O. I -1 %浓度范围的吐温-20、I -10 %浓度范围的丙三醇ー种或两种以上。优选地，所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、苯酚和こ基汞硫代硫酸钠中的一种或两种以上，使用浓度选自O. 02% -O. 1%。优选地，所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖钠中的ー种，使用浓度范围选自1_6%。最优选地，所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒由如下组分组成Rl 0. 2mg/mL ADMA 单克隆抗体、O. 9 %氯化钠、5 % PEG-6000,0. 2 % BSA、20mMEDTA,O. 1%叠氮化钠、50mM Tris-HCl 缓冲液 ρΗ7· 2 ；
R2 :非対称ニ甲基精氨酸-人血清白蛋白复合体包被的聚苯こ烯胶乳颗粒0.25%、50禮甘氨酸缓冲液。!18.0、0.9%氯化钠、0.8% BSA、20mM EDTA,O. I % 吐温 20、O. I %叠氮化钠,其中所述聚苯こ烯胶乳颗粒表面带有羧基、直径为150nm ；非対称ニ甲基精氨酸校准品浓度分别为0、0. 5、2、5、10、20umol/L的非対称ニ甲基精氨酸、O. 9%氯化钠、l%BSA、50mM EDTA,O. 1%叠氮化钠、50mM Tris-HCl 缓冲液pH7. 2。
换言之，本发明基于ー个特异性针对ADMA的单克隆抗体和交联有ADMA-人血清白蛋白的胶乳颗粒悬浮液，在特定的反应体系中发生抗原抗体反应形成一定的浊度，能够被基于分光光度计的生化分析仪检测到。而人血浆中如果有游离状态的ADMA存在，会与固定在胶乳颗粒表面的ADMA竞争结合单克隆抗体，使浊度下降，通过测定反应后体系浊度的降低程度来对ADMA进行定量分析。本发明同时解决了 ADMA检测的特异性和自动化程度低的问题，可以广泛推广应用。具体而言，为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是通过用偶联在惰性蛋白上的ADMA包被胶乳颗粒并悬浮在特定缓冲液中制作R2试剂。其中用作包被的胶乳颗粒直径范围为100-200nm，浓度为l_5mg/mL。由于ADMA分子量非常小，很难与胶乳颗粒结合。因此本发明中用作包被的ADMA首先通过化学键偶联在惰性大分子蛋白上，分子量较大的惰性蛋白可以更好的与胶乳颗粒结合，偶联有ADMA的惰性蛋白浓度为O. Ι-lmg/mL。偶联有ADMA的惰性蛋白进ー步通过优化的化学交联方法包被在胶乳颗粒表面，所用的化学交联方法为“ー步双pH”法，即胶乳颗粒首先在低pH条件下被活化剂激活，再与高pH溶液中的ADMA-惰性蛋白复合体混合，混合后的溶液pH为中性，这种方法可以使得偶联有ADMA的惰性蛋白高效、特异的与胶乳颗粒表面結合。所用作的悬浮缓冲液为含有稳定剂和防腐剂的甘氨酸-NaOH缓冲液，浓度为20-100mM，pH范围为7_9。所用作的稳定剂为牛血清白蛋白O. 1-1 %、氯化钠浓度为O. 7-0. 9%、こニ胺四こ酸浓度为5-50mM、吐温20浓度为O. 1_1%。所用防腐剂为叠氮钠O. 05-0. 1%。通过在特定缓冲液中加入特异性针对ADMA的单克隆抗体来制作Rl试剂，特定缓冲液中要添加无机盐、促凝剂、蛋白质和防腐剤。其中所选择的单克隆抗体为特异性针对ADMA的抗体，可以通过本领域公认的杂交瘤方法制备，也可以购买商品化的产品，例如Abeam、Mlilipore等。所选择的ADMA单克隆抗体首先要通过间接ELISA方法检测,确认不会与SDMA、L-NMMA和精氨酸产生交叉反应。其中要求缓冲液的缓冲能力为调节pH范围在7-9之间，可以选择各种缓冲液，优选HEPES、甘氨酸、Tris等，与其他缓冲液相比，具有缓冲能力強、溶解度高、很好的生物适应性和反应惰性。其中Tris-HCl能较长时间控制恒定的pH范围，因此更优选Tirs-HCl，其浓度范围为lO-lOOmM，pH范围为7_8。促凝剂选择PEG-6000，可以加快免疫反应速度，缩短检测时间，其终浓度为2-6%。蛋白质选择牛血清白蛋白，终浓度为O. 1-1 %。氯化钠浓度为O. 7-0. 9 %，叠氮钠浓度为O. 05-0. I %。通过在特定缓冲液中添加ADMA浓度分别为0、0. 5、2、5、10、20umol/L制作多点校准品，其中要求缓冲液的缓冲能力为调节PH范围在7-9之间，可以选择各种缓冲液，优选HEPES、甘氨酸、Tris等，与其他缓冲液相比，具有缓冲能力強、溶解度高、很好的生物适应性和反应惰性。其中Tris-HCl能较长时间控制恒定的pH范围，因此更优选Tirs-HCl，其浓度范围为10-200mM，pH范围为7_8。其中含有特定的蛋白稳定剂如牛血清白蛋白浓度为O. 1-1%，含有特定的防腐剂如叠氮钠浓度为O. 05-0. 1%，含有特定的抗氧化剂如こニ胺四こ酸浓度为5_50mM。本发明提供用于测量在人血浆、血清样品中的非対称ニ甲基精氨酸免疫比浊测定方法，其特征在干，通过将含有非対称ニ甲基精氨酸的人血浆、血清样本，与胶乳颗粒包被的非対称ニ甲基精氨酸竞争结合特异性针对ADMA的单克隆抗体，导致浊度下降，下降的程度与人血浆、血清中的非対称ニ甲基精氨酸含量成正比，采用全自动生化分析仪器可以计算出人血浆、血清样本中非対称ニ甲基精氨酸的含量。本发明与现有技术相比，具有如下特点1)能够应用在自动生化分析仪器上，检测速度快；2)检测特异性强，不与L_NMMA、SDMA和精氨酸产生交叉反应，与HPLC方法具有很闻的相关性；3)检测灵敏度和检测范围达到其他正在临床应用的试剂盒同等水平，能够满足临床应用需要。


图I为本发明所制备试剂盒的线性图。图2为本发明所制备试剂盒与HPLC方法试剂盒检测临床样本比对的相关性。
具体实施例方式下面将通过下述非限制性实施例进ー步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例实施例I :制备偶联非対称ニ甲基精氨酸的人血清白蛋白将IOmg人血清白蛋白用ImL O. IM磷酸盐缓冲液(ρΗ7· 8)稀释后，加入非对称ニ甲基精氨酸，再加入50mg EDAC，在4°C反应24小时，再用O. IM磷酸盐缓冲液(pH7. 8)在4°C条件下透析24小时，制作成偶联ADMA的人血清白蛋白(非対称ニ甲基精氨酸_人血清白蛋白复合体)。实施例2 :制备非对称ニ甲基精氨酸R2试剂表面带有羧基、直径150nm的聚苯こ烯胶乳溶液(浓度10% )(购自Merck)0. 5mL，加入4. 5mL的O. 05M MES缓冲液(ρΗ6· O)，然后加入5mg EDAC，在37°C反应I小时。再将O. 5mg偶联有ADMA的人血清白蛋白用5mL O. 05M硼酸盐缓冲液(pH9. 2)稀释后，立即加入到上述胶乳溶液中，在37°C反应6小吋。最后加入ImL O. IM的甘氨酸缓冲液(pH8. 5)搅拌Ih来终止反应，离心去掉上清，用20mL 50mM的甘氨酸缓冲液(pH8. O)洗涤3次，50mM的甘氨酸缓冲液中含有O. 9%氯化钠、20mM EDTA,O. 8% BSA、0. 1%吐温20、0. I %叠氮化钠，最后再以同样20mL的甘氨酸缓冲液分散成乳白色胶乳悬浮液，为R2试剂，最終R2试剂中非对称ニ甲基精氨酸-人血清白蛋白复合体包被的聚苯こ烯胶乳颗粒浓度为O. 25%。实施例3 :制备非对称ニ甲基精氨酸Rl试剂
在50mM pH7. 2的Tris-HCl缓冲液中，添加O. 2mg/mL的ADMA单克隆抗体(购自Abeam)，同时添加氯化钠 0.9%、PEG-60005 %、BSA 0.2%、EDTA20mM、叠氮化钠 0.1%，搅拌均匀为Rl试剂。实施例4 :制备非对称ニ甲基精氨酸校准品在50mM ρΗ7· 2 的 Tris-HCl 缓冲液中，加入浓度分别为 0,0. 5、2、5、10、20umol/L的非対称ニ甲基精氨酸，另外添加氯化钠0.9%、BSAl%、EDTA 50mM、叠氮化钠O. 1%，搅拌均匀为非対称ニ甲基精氨酸多点校准品。实施例5 :非対称ニ甲基精氨酸剂盒的性能检测I.检测试剂盒的用法以日立7180生化分析仪为例测定波长570nm，首先加入Rl试剂150uL，37°C反应 30秒后加入ADMA校准品10uL，再反应60秒后加入R2试剂50uL，测定反应第10秒、70秒的吸光度值(A1、A2)，计算吸光度差值ΛΑ = A2-A1，每管重复测定2次，将各校准品管2次测得的吸光度差值△ A为纵坐标，对应的浓度为横坐标，制作“浓度-吸光度差值”校准曲线，取待测样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中ADMA的含量。2.重复性检测以生理盐水稀释人血清样本，配制浓度分别为O. 1,0. 5、l、2umol/L的样本，用上述非对称ニ甲基精氨酸R1、非対称ニ甲基精氨酸R2和非対称ニ甲基精氨酸校准品组成的试剂盒，与A公司的ELISA试剂h盒比较重复性能。A公司的试剂基本分析原理是，先使用酰基化试剂将样本中的ADMA酰基化，然后加入酶标板，与结合在固相上的ADMA竞争性结合ADMA多克隆抗体，采用不同水平的标准品与酶标记抗体竞争结合，然后显色读出吸光度，制作标准曲线。样品与标准品同样步骤操作后，在标准曲线上得到相应ADMA浓度。本发明试剂盒按照I所述的方法測定10次，计算不同ADMA含量样本检测的变异系数，与A公司商品化的ELISA试剂盒比较结果如下表I和2所示表I本发明试剂盒的检测重复性
权利要求
1.一种测定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，包括: 1)非対称ニ甲基精氨酸Rl试剂； 2)非対称ニ甲基精氨酸R2试剂； 3)非対称ニ甲基精氨酸校准品； 所述非对称ニ甲基精氨酸Rl试剂包括非対称ニ甲基精氨酸特异性单克隆抗体、缓冲液、稳定剂、促凝剂和防腐剂； 所述非对称ニ甲基精氨酸R2试剂包括非対称ニ甲基精氨酸-惰性蛋白复合体包被的胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂； 所述非对称ニ甲基精氨酸校准品是由非対称ニ甲基精氨酸、缓冲液、稳定剂和防腐剂组成。
2.根据权利要求I所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在干，所述非对称ニ甲基精氨酸-惰性蛋白复合体是通过偶联剂将非対称ニ甲基精氨酸和惰性蛋白偶联后而获得。
3.根据权利要求I或2所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述的惰性蛋白选白人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白和血蓝蛋白中的ー种。
4.根据权利要求I至3任一项所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述胶乳颗粒是ー种核壳结构，乳核是聚苯こ烯聚合物，乳壳由苯こ烯、丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸共聚物组成。
5.根据权利要求I至4任一项所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述胶乳颗粒直径范围为50-250nm，使用浓度选自O. 05-0. 5%。
6.根据权利要求I至5任一项所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述非对称ニ甲基精氨酸-惰性蛋白复合体可以通过与胶乳颗粒本身携帯的化学基团通过化学键结合在胶乳颗粒表面，常用的化学基团包括羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基等，本发明通过优化的化学交联方法将非对称ニ甲基精氨酸-惰性蛋白复合特异性的结合在胶乳颗粒表面的羧基上，所述优化的化学交联方法概括为“一歩双pH” 法。
7.根据权利要求I至6任一项所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述缓冲液选自3-[N，N-ニ(羟こ基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、4-(2-羟こ基)-1-哌嗪丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和巴比妥缓冲液中的ー种或两种以上，使用浓度选自10-200mM。
8.根据权利要求I至7任一项所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述稳定剂选自O. 1-5%浓度范围的牛血清白蛋白、O. 5-1%浓度范围的氯化钠、2_50mM的EDTA、0. 1_1%浓度范围的吐温-20和1-10%浓度范围的丙三醇ー种或两种以上。
9.根据权利要求I至8任一项所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、苯酚和こ基汞硫代硫酸钠中的ー种或两种以上，使用浓度选自O. 02% -O. 1%。
10.根据权利要求I至9任一项所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-g000和硫酸葡聚糖钠中的ー种，使用浓度范围选自1_6%。
11.根据权利要求I至10任一项所述的測定非対称ニ甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于其由如下组分组成 Rl 0. 2mg/mL ADMA 单克隆抗体、O. 9 %氯化钠、5 % PEG-6000、0· 2 % BSA、20mM EDTA, O.1% 叠氮化钠、50mM Tris-HCl 缓冲液 ρΗ7· 2 ； R2 非対称ニ甲基精氨酸-人血清白蛋白复合体包被的聚苯こ烯胶乳颗粒O. 25 %、50mM 的甘氨酸缓冲液 ρΗ8. 0、0. 9% 氯化钠、O. 8%BSA、20mM EDTA、0. I % 吐温 20、O. 1% 叠氮化钠，其中所述聚苯こ烯胶乳颗粒表面带有羧基、直径为150nm ； 非対称ニ甲基精氨酸校准品浓度分别为0、0. 5、2、5、10、20umol/L的非対称ニ甲基精氨酸、O. 9%氯化钠、I % BSA、50mM EDTA、0. 1%叠氮化钠、50mM Tris-HCl 缓冲液 pH7. 2。
全文摘要
本发明涉及检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒。具体而言，本发明涉及一种胶乳增强免疫比浊法测定血液样本中非对称二甲基精氨酸(ADMA)含量的试剂盒，其由鼠抗人ADMA单克隆抗体溶液、交联有ADMA-人血清白蛋白复合体的胶乳颗粒悬浮液和ADMA校准品组成。本发明的方法利用血液中游离ADMA与交联在胶乳颗粒表面的ADMA竞争结合ADMA单克隆抗体，使得交联ADMA的胶乳颗粒与ADMA单抗反应形成的浊度下降，通过浊度下降程度来检测ADMA含量。本发明试剂盒能应用于临床常用的生化分析仪器，操作简便、快速、特异性强，灵敏度和检测范围均能满足临床应用的要求。
文档编号G01N33/68GK102628868SQ20111045499
公开日2012年8月8日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者刘希, 蔡华雅, 高爱民 申请人:北京九强生物技术股份有限公司