专利名称：液相色谱串联质谱分析尿液中苯和甲苯四种代谢产物的方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，涉及苯和甲苯代谢产物的分析，特别涉及液相色谱串联质谱技术分析尿液中苯和甲苯四种代谢产物(即反，反粘康酸、1，2-苯二酚、苯巯基尿酸和N-乙酰基卞基半胱氨酸)的方法，该分析方法快速、灵敏，准确度高。
背景技术：
苯和甲苯均为使用非常广泛的化工原料和有机溶剂，由于其具有挥发性，所以在大气以及环境中无处不在。国际癌症研究会(IRAC)已经证明，苯是一种致癌性化合物，长期暴露于苯环境中，会引发白血病、再生性障碍性贫血以及染色体异常等疾病；而甲苯的毒性虽略低于甲苯，但也对中枢神经系统有强烈的毒副作用。除了一些职业场所暴露外，如油漆厂、石化炼油厂、制鞋厂等外，苯、甲苯在我们日常生活中的暴露源主要来自室内装修材料、家具、油漆以及汽车尾气等。因此监测一些职业暴露场所以及普通人群体内的苯、甲苯暴露水平，既预估其面临的环境风险值，也可以用于其健康效应的早期评价。苯有三条不同的代谢途径。苯进入体内，经P450酶催化，转化为苯酚、1，2-苯酚、反，反-粘康酸以及苯巯基尿酸等代谢产物，最终随尿排出体外。反，反-粘康酸是以往研究中使用最多的一种指示苯暴露水平的生物标志物。但由于反，反-粘康酸同时也是一种食品添加剂-山梨酸的代谢产物，因此仅仅用反，反-粘康酸的浓度水平来评价苯的暴露水平是不科学的。最近，苯巯基尿酸也被用于指示苯的环境暴露。甲苯也有不同的代谢途径，绝大多数的甲苯代谢为马尿酸以及各种甲基马尿酸，只有约1%的甲苯代谢为N-乙酰基卞基半胱氨酸。但马尿酸也是尿的内源性代谢产物，因此不是甲苯的特异性生物标志物。而N-乙酰基卞基半胱氨酸自1993年来首次被认定为甲苯的代谢产物，相对于马尿酸和邻甲酚，是个更为特异性的甲苯代谢生物标志物，适用于低浓度的甲苯暴露环境。由于苯、甲苯代谢的途径多样化，且基因差异对不同代谢途径的效率有影响，因此仅仅用反，反-粘康酸或苯巯基尿酸做生物标志物，不能全面地反映苯、甲苯的整体暴露水平和特点。因此利用多个生物标志物(包括反，反粘康酸、1，2-苯二酚、苯巯基尿酸和N-乙酰基卞基半胱氨酸)，发展快速、灵敏的检测方法，联合监测苯、甲苯暴露水平和特点成为目前研究的方向和热点。

发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明目的在于提供一种固相萃取(SPE)和超高压液相色谱串联质谱(UHPLC/MS/MS)技术分析尿液中苯和甲苯的四种代谢产物(即反，反粘康酸(t，t-MA)、l，2-苯二酚(1，2-DB)、苯巯基尿酸(S-PMA)和N-乙酰基卞基半胱氨酸(S-BMA))的方法。本发明目的通过下述技术方案实现:
一种液相色谱串联质谱分析尿液中苯和甲苯四种代谢产物的方法，包括以下步骤:(I)选取反，反粘康酸、1，2-苯二酚、苯巯基尿酸和N-乙酰基卞基半胱氨酸作为苯和甲苯的特征代谢产物；配制含有上述四种特征代谢产物的单一标准品储备溶液、含有上述四种特征代谢产物同位素内标物的单一标准品储备溶液、以及含有上述四种特征代谢产物及其相应的同位素内标物的混合工作标准品溶液；特征代谢产物及其相应同位素内标物的化学结构式如下所示:
权利要求
1.一种液相色谱串联质谱分析尿液中苯和甲苯四种代谢产物的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)选取反，反粘康酸、1，2-苯二酚、苯巯基尿酸和N-乙酰基卞基半胱氨酸作为苯和甲苯的特征代谢产物；配制含有上述四种特征代谢产物的单一标准品储备溶液、含有上述四种特征代谢产物同位素内标物的单一标准品储备溶液、以及含有上述四种特征代谢产物及其相应的同位素内标物的混合工作标准品溶液； (2)配制系列浓度的混合标样工作液；系列浓度的混合标样工作液中，内标的浓度保持不变，而目标化合物浓度成比例增长；将系列浓度的混合标样工作液注入色谱柱进行仪器分析，以(标样峰面积/内标样峰面积)为响应值；根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系，即W=fXA，制成标准曲线； (3)取待测尿样，加入一定量的含四种特征代谢产物同位素内标物混合工作标准品溶液，使内标物的浓度介于标准曲线各浓度点的中部；调节待测样品的PH值为4.5，然后用甲醇、水、醋酸缓冲液分别活化后的固相萃取小柱吸附目标化合物；接着用醋酸缓冲液和水淋洗固相萃取小柱，除去杂质；真空抽干固相萃取小柱，然后用乙腈洗脱目标化合物；洗脱液用氮气吹干后，用少量甲醇溶液溶解，然后进行仪器分析；得到四种特征代谢产物的响应值； (4)根据已知的系数f，求出尿样中四种特征代谢产物的浓度； 步骤(2)和(3)中所述的仪器分析是采用超高压液相色谱串联质谱法，色谱柱采用粒径〈2 μ m的反相C18色谱柱。
2.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱分析尿液中苯和甲苯四种代谢产物的方法，其特征在于:步骤(2)所述系列浓度的混合标样工作液中，反，反粘康酸的浓度范围是.15.63-4000 μ g/L，I, 2-苯二酚的浓度范围是7.81-2000 μ g/L，苯巯基尿酸的浓度范围是.0.20-200 μ g/L, N-乙酰基卞基半胱氨酸的浓度范围是0.39-100 μ g/L。
3.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱分析尿液中苯和甲苯四种代谢产物的方法，其特征在于:所述的超高压液相色谱串联质谱法，质谱条件见表I ;色谱分离条件见表.2 ； 表1:质谱条件
全文摘要
本发明公开了一种液相色谱串联质谱分析尿液中苯和甲苯四种代谢产物的方法，该方法包括以下步骤配制系列浓度的混合标样工作液，进行仪器分析，根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系制成标准曲线；取待测尿样，加入含四种特征代谢产物同位素内标物混合工作标准品溶液；用固相萃取小柱吸附目标化合物，然后进行仪器分析；得到四种特征代谢产物的响应值；根据已知的系数f，求出尿样中四种特征代谢产物的浓度。所述的仪器分析是采用超高压液相色谱串联质谱法，色谱柱采用粒径<2μm的反相C18色谱柱。本发明方法简化了样品前处理步骤，缩短了样品仪器分析时间，定量准确性高。同时，本发明方法的仪器检出限和方法检出限非常低，提高了低浓度非职业暴露人群的检出率。
文档编号G01N30/02GK103175921SQ201310067770
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者范瑞芳 申请人:华南师范大学