专利名称：一种测定杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌毒力的方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域中一种测定杀菌剂对病原菌毒力的方法，特别涉及一种离体条件下测定杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌毒力的方法。
背景技术：
玉米是我国面积和产量居第三位的重要粮食作物。玉米生长过程中易受多种病虫害危害，其中“丝黑穗病”直接危害产量器官，是玉米生产中的重要病害和主要防治对象。
玉米丝黑穗俗称“乌米”，是一种重要的土传和种传病害，主要发生在春播玉米区。其病原菌属担子菌亚门丝轴团粒黑粉菌属Sporisorium holci-sorghi(Rivolta)vanky，以冬孢子在土壤、粪肥中或种子上越冬，播种后随种子发芽受幼芽分泌物的刺激，病菌冬孢子萌发并从玉米幼芽的芽鞘、胚轴或幼根侵入，到达生长点；其菌丝随玉米植株生育而扩展，至玉米花芽分化时，进入花芽和原始穗，破坏穗部，形成大量黑粉，成为丝黑穗。玉米丝黑穗Sporisorium holci-sorghi(Rivolta)vanky冬孢子萌发过程如图1-图7所示，即首先伸出一枝或多枝芽管，然后产生先菌丝，其上着生小孢子，以小孢子芽殖和菌丝段繁殖，在液体培养液中摇培不形成菌团。
病害从种子开始萌动至展出五片叶期间均可发生，以三叶期前，特别是幼芽期侵染率最高。北方春播季节的气候特点一般是气温中度、风大、蒸发高，这就为玉米丝黑穗病的发生提供了有利的自然条件。一般年份发病率为2％-8％。近年来，由于有些地区推广了一些不抗病的品种，并且长期进行连作，玉米丝黑穗病逐年加重，部分地区发病率可高达60％-70％，玉米损失严重。种衣剂包衣处理可以降低种苗带菌率和病菌的侵染率，许多研究单位和农药生产企业一直尝试筛选对玉米丝黑穗病菌具有防治效果的三唑类药剂以及萎锈灵等有机杂环类内吸性杀菌剂与保护性杀菌剂福美双等复配以构建种子处理剂型。
针对一般病原菌，通常药剂的筛选采用离体条件下毒力测定方法，即在实验室条件下进行的不依附于作物体的农药本身(原药)对于靶标菌的抑菌作用的测定，如传统的毒力测定方法中的孢子萌发法和生长速率测定法等。生产中用于防治玉米丝黑穗病的常规药剂大都属于三唑类杀菌剂，如三唑酮(粉锈宁)、三唑醇(羟锈宁)、烯唑醇(特谱唑)、戊唑醇(立克锈)、腈菌唑等，其主要作用机制是抑制病原菌菌丝体内麦角甾醇的合成，麦角甾醇是细胞膜的主要成分，对其合成的抑制必然导致新合成膜结构的变化，致使细胞发生强烈的内陷和液泡化，影响正常的细胞分裂，最终将大大削弱病原菌的侵染能力，离体条件下三唑类药剂对病菌孢子萌发一般没有抑制作用，主要表现为抑制病菌次生孢子和菌丝的形成，而玉米丝黑穗病菌冬孢子萌发后产生的先菌丝生长缓慢，在固体培养液上，以小孢子芽殖形成的菌落的形状不规则且直径较小，仅为小于等于5mm，因此传统的毒力测定方法如孢子萌发法和生长速率测定法难于检测这类药剂的真实抑菌作用，目前一般采用活体植株法进行杀菌剂的毒力测定，即将用玉米砂扩大繁殖的丝黑穗病原菌接种于灭菌土壤中(接种比例为0.5％)，播种经不同药剂处理的玉米种子，在果穗出齐后、收获之前丝黑穗病症状明显时调查丝黑穗病病株率和病穗率，计算田间人工接种条件下各药剂处理的防病效果。并以防病效果数据转换成机率值为纵坐标，以药剂浓度对数为横坐标，作图并求其毒力回归式，计算出各药剂对病原菌的EC50，比较不同药剂的毒力及抑菌活性。该方法存在着测定周期长，需要3个多月时间；测定过程中影响因素较多，除药剂本身的毒力起作用外，其他各种条件均对药剂毒力的发挥产生影响，包括不同的施药方法，具体剂型，施药质量，作物生长情况，及防治对象生育情况；试验可重复性较差，采用人工多点调查方法不可避免具有一定的误差，影响了方法的准确度和精密度；试验实施中因为涉及到温室盆栽或田间试验，工作量大、需要耗材较多等诸多弊端。也有人提出将用玉米砂扩大繁殖的丝黑穗病原菌接种于灭菌土壤中(接种比例为0.5％)，播种经不同药剂处理的玉米种子，待两叶期(播种15-20d后)左右取不同植株的生长锥进行染色，光镜观察，以判断丝黑穗病原菌是否入侵成功并蔓延至生长锥的基部分生组织中，根据被调查的玉米植株生长锥的侵染率，计算田间人工接种条件下各药剂处理的防病效果。该方法目前虽已作为玉米丝黑穗病早期诊断的一种方法，但未见其用于毒力测定的报道，测定过程中也存在着取样量大，测定周期较长，影响因素较多等缺点。
国家农药检定部门及药剂生产企业迫切需要建立一种新的快速、准确和有效的检测方法，以确定和比较不同药剂对玉米丝黑穗病菌的抑菌效果和毒力，为进一步的田间药效试验和混配药剂的研制提供理论依据。
发明创造内容本发明的目的是提供一种离体条件下快速、有效测定杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌毒力的方法。
本发明所提供的离体条件下测定杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌毒力的方法，包括以下步骤1)制备玉米丝黑穗孢子悬浮液；2)在含3％葡萄糖或蔗糖的改定理查液体培养基中接种步骤1)制备的玉米丝黑穗孢子悬浮液并加入不同浓度梯度的待测杀菌剂，在26-28℃摇培80-90小时，测定650nm波长下不同处理的吸光值，得出待测杀菌剂的毒力。
上述方法中，步骤1)中所述玉米丝黑穗孢子悬浮液可按下述方法制备将玉米丝黑穗冬孢子粉以1mg∶1ml的比例浸泡于0.03％的土温20水溶液4-6小时，离心弃上清液，孢子沉淀用0.25％KMnSO4水溶液消毒处理25min，无菌水洗涤离心，孢子沉淀用0.05M盐酸处理4-6hr后离心，孢子沉淀用无菌水或3％葡萄糖或蔗糖的改定理查液体培养基浮载。其中，如玉米丝黑穗孢子悬浮液现用现配，可用3％葡萄糖或蔗糖的改定理查液体培养基浮载。
步骤2)中接种的玉米丝黑穗孢子悬浮液的比例可推算为1mg玉米丝黑穗孢子粉20ml 3％葡萄糖或蔗糖的改定理查液体培养基。为了降低成本，步骤2)中的改定理查液体培养基优选为3％葡萄糖的改定理查液体培养基。3％葡萄糖或蔗糖的改定理查液体培养基组成为硝酸钾10.00g、磷酸二氢钾5.00g、硫酸镁2.50g、氯化铁0.02g、葡萄糖或蔗糖30.00g、蒸馏水1000ml，pH 4-6。
其中，玉米丝黑穗冬孢子粉可按常规方法制备。
为了使测定结果更可靠，步骤2)中所述摇培时间优选为84小时。
上述方法中，步骤2)中所述摇培的容器可为酶联板或微孔培养板；步骤2)中所述测定650nm波长下不同处理的吸光值的仪器为酶联检测仪或多孔分光光度检测仪。
本发明针对目前采用的活体植株法测定杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌的毒力作用过程中存在的实验周期长，影响因素多，工作量大等弊端，根据玉米丝黑穗病原菌的特殊生长发育方式提供了一种离体条件下快速、有效的检测杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌毒力的测定方法，该方法测定周期约为96hr；测定过程中供试药剂均为高含量的原药，不受施药方法和剂型的影响；测定过程在离体条件下进行，是不依附于生物体进行的农药本身(原药)对于靶标菌的抑菌作用的测定，不受作物生长情况的影响；借助酶联检测仪和多孔分光光度检测仪作为快速检测手段代替人工调查方法，准确度和精密度高，平行性好，简化了操作，检测过程中耗费的试材量少，可简便、准确、快捷确定和比较不同药剂对玉米丝黑穗病菌的抑菌效果和毒力，为进一步的田间药效试验和混配药剂的研制提供了理论依据，将在玉米丝黑穗的防治中发挥重要作用。


图1-图7为玉米丝黑穗冬孢子萌发过程照片图8为酶联板未充分摇匀时，培养液中产物沉积于孔内底部的情况图9为酶联板充分摇匀后，使用酶联检测仪进行吸光值测定前的梯度混浊情况具体实施方式
实施例1、测定几种杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌的毒力实验材料(1)供试菌种玉米丝黑穗病原冬孢子Sporisorium holci-sorghi(Rivolta)vanky。
(2)供试药剂96％萎锈灵原粉(Carboxin)，浙江四海化工有限公司生产；95％戊唑醇原粉(Tebuconazola)，德国拜耳公司生产；92.7％腈菌唑原粉(Myclobutanil)，美国罗姆哈斯公司生产；98％福美双原粉(Thiram)，上海长江化工厂生产；94％三唑醇原粉(Triadimenol)，江苏建湖农药厂生产；福美双和三唑醇分别按照7∶1、6.5∶1.5、6∶2、5.5∶2.5、5∶3的配比制成混配制剂。
(3)供试培养液3％葡萄糖改定理查液体培养基基硝酸钾10.00g、磷酸二氢钾5.00g、硫酸镁2.50g、氯化铁0.02g、葡萄糖30.00g、蒸馏水1000ml，pH 4-6。
(4)供试试剂无菌水、0.03％土温20水溶液、0.25％高锰酸钾水溶液、甲醇、0.05M盐酸、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化铁、葡萄糖。
(5)仪器及设备三角瓶、电子天平、进样器及枪头、eppendorf管、高速离心机、超净工作台、恒温培养箱、湿热灭菌锅、小烧杯、酶联板、酶联检测仪、光学显微照相系统、摇床。
将玉米丝黑穗冬孢子粉10mg用0.03％的土温20水溶液以1mg1ml浸泡展着5hr后，离心弃上清液，孢子沉淀用0.25％KMnSO4水溶液消毒25min，消除孢子内混杂杂菌，软化孢子壁，促进孢子萌发；然后用无菌水洗涤、浮载，48hr后离心，孢子沉淀用0.05M盐酸处理6hr，离心弃上清液，孢子沉淀置于200ml改定理查培养液中混匀，96孔酶联板每孔中加入75μl带菌培养液和75μl不同浓度梯度的药剂(药剂中甲醇含量低于1％，孔中带毒培养液中的药剂浓度为原药剂浓度的1/2)，以75μl培养基加75μl无菌水为参比液，以75μl带菌培养基加75μl无菌水为空白对照，将酶联板置于摇床上26-28℃下黑暗摇培84小时(转速为100r/min)后，使用酶联检测仪在650nm(单光源)波长下测定不同处理的吸光值(测定前酶联板须充分摇匀，因产物沉积于孔内底部)，以不接菌的改定理查液体培养液为参比对照，并与不加药液的空白对照处理相比求出相对抑制百分率，查生物机率值换算表，将数据转换成机率值为横坐标，以药剂浓度对数为纵坐标，作图并求其毒力回归式，计算出各药剂对病原菌的EC50，比较不同药剂对玉米丝黑穗病原孢子萌发和生长的抑制程度。
其中，酶联板置于摇床上26-28℃下黑暗摇培84小时后，不同处理孔道中培养液的混浊情况如图8和图9所示。图8和图9中，孔道2为不接菌的改定理查液体培养液(参比对照)；孔道3为不加药液的菌悬液(空白对照)；孔道3-11为不同浓度梯度(由低至高)处理的菌悬液。
混配制剂的联合毒力采用孙云沛的共毒系数方法表示混配制剂的理论毒力指数A＝∑(某药的毒力指数×在混剂中该药有效成分的百分率)； C大于120时为增效作用；小于80时为拮抗作用；小于120时、大于80时为加和作用； 药剂萎锈灵、腈菌唑和戊唑醇的毒力测试结果如表1所示，表明上述药剂对原菌抑制的毒力回归相关系数大于0.9000，说明该方法适用于测定药剂对玉米丝黑穗病菌的抑菌效果；其中，戊唑醇的EC50为0.0379μg/ml，对玉米丝黑穗病菌有较高的抑菌活性，建议生产中与其它药剂适当混配使用。
表1杀菌剂对玉米丝黑穗病菌的EC50值及毒力指数药剂名称 浓度(μg/ml) 平均吸光度抑制百分率毒力回归式(Y＝A+BX) EC50(μg/ml)参比对照 0.0485 -空白对照 0.2013 -0.50 1.7810 15.8 Y＝3.700X+4.759 1.162萎锈灵1.00 1.5372 27.3 R2＝0.92831.50 0.9940 52.92.50 0.1991 90.63.00 0.0660 96.3参比对照 0.0443 ------腈菌唑空白对照 0.3020 ------0.3 0.2747 10.60.5 0.2270 29.1 Y＝0.6121X-2.90211.44011.0 0.1907 43.2 R2＝0.9451.5 0.1710 50.82.0 0.1357 64.73.0 0.1270 67.95.0 0.0870 83.4参比对照 0.0472 -空白对照 0.1870 -0.01 0.1471 28.6 Y＝1.0648x+6.5129 0.0379戊唑醇0.05 0.1183 49.4 R2＝0.97620.10 0.0877 71.00.20 0.0794 76.90.30 0.0700 83.7福美双和三唑醇分别按照7∶1、6.5∶1.5、6∶2、5.5∶2.5、5∶3的配比制成混配制剂加上两种单剂共7种药剂对玉米丝黑穗病菌的毒力回归式、EC50值及其毒力指数如表2所示，表明福美双和三唑醇按照6.5∶1.5和6∶2比例混配的药剂的EC50分别为0.0708和0.0738μg/ml，毒力指数为154.10和147.93；以上两种配比的EC50均小于福美双和三唑醇按照7∶1、5.5∶2.5、5∶3比例混配构建的混配制剂的EC50。
表2福美双和三唑醇及混配药剂对玉米丝黑穗病菌的EC50值及毒力指数药剂名称 浓度μg/ml 平均吸光度抑制百分率毒力回归式 EC50(μg/ml)毒力指数(Y＝A+BX)参比对照 0.0440 --空白对照 0.2159 --0.05 0.1954 11.93福美双0.10 0.1208 55.32 y＝3.0871x+7.9696 0.1091 1000.20 0.0858 75.68 R2＝0.98180.30 0.0585 91.560.40 0.0514 95.70参比对照 0.0440 --空白对照 0.1150 --2.00 0.0933 30.63三唑醇3.00 0.0775 52.82 y＝1.4244x+4.2142 3.5717 3.054.00 0.0755 55.67 R2＝0.87906.00 0.0720 60.568.00 0.0670 67.61参比对照 0.0440 --空白对照 0.1063 --福∶醇0.05 0.0943 19.26 y＝1.922x+6.847 0.1094 99.737∶1 0.10 0.0750 50.24 R2＝0.93830.30 0.0523 86.680.50 0.0485 92.781.00 0.0480 93.58参比对照 0.0430 --空白对照 0.0820 --0.05 0.0688 38.460.10.0633 44.87福∶醇0.30.0468 80.77 y＝2.5159x+7.901 0.0708 154.106.5∶1.5 0.50.0445 94.87 R2＝0.9704
1.00.0457 92.31参比对照 0.0440 --空白对照 0.1178 --0.05 0.0880 40.38 y＝1.4678x+6.5810.0738 147.930.10.0830 47.15 R2＝0.9362福∶醇 0.30.0555 84.426∶2 0.50.0550 85.091.00.050 91.87参比对照 0.0440 --空白对照 0.1093 --0.05 0.1043 7.660.10.0745 53.29y＝2.7802x+7.4944 0.1267 86.11福∶醇 0.30.0508 89.59R2＝0.93055.5∶2.5 0.50.0495 91.581.00.0495 91.58参比对照 0.0465 --空白对照 0.1540 --0.05 0.1385 14.42y＝1.8215x+6.2052福∶醇 0.10.1165 34.88R2＝0.9073 0.2179 50.075∶3 0.50.0880 61.401.00.0720 76.283.00.0470 99.53根据孙云沛的计算公式求得的福美双和三唑醇按照7∶1、6.5∶1.5、6∶2、5.5∶2.5、5∶3的配比混剂对玉米丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)的理论毒力指数A、共毒系数C以及增效倍数E分别如下福美双和三唑醇(7∶1)A＝100×87.5％+3.05×12.5％＝87.88；C＝99.73÷87.88×100＝113.5E＝99.73÷87.88-1＝0.14倍；福美双和三唑醇(6.5∶1.5)
A＝100×77.5％+3.05×22.5％＝78.19；C＝154.1÷78.19×100＝197.1E＝154.1÷78.19-1＝0.97倍；福美双和三唑醇(6∶2)A＝100×75％+3.05×25％＝75.76；C＝147.93.÷75.76×100＝195.3E＝147.93÷75.76-1＝0.95倍；福美双和三唑醇(5.5∶2.5)A＝100×68.8％+3.05×31.2％＝69.75；C＝86.11÷69.75×100＝123.5E＝86.11÷69.75-1＝0.24倍；福美双和三唑醇(5∶3)A＝100×62.5％+3.05×37.5％＝63.64；C＝50.07÷63.64×100＝78.68E＝50.07÷63.64-1＝-0.21倍联合毒力测试结果表明福美双和三唑醇按照6.5∶1.5和6∶2混配制成的混配制剂产品的EC50分别为0.0708和0.0738ppm，共毒系数C分别为197.1和195.3，增效倍数为0.97和0.95倍。表明按照以上配比构建的混配药剂，两单剂间具有一定的增效作用，优于其他配比。
由于福美双为一保护性杀菌剂，虽在离体情况下对丝黑穗病菌具有突出的抑菌效果，但若在病原菌已侵入或寄藏在种子内部情况下，由于福美双不能内吸传导，其对丝黑穗病菌的抑菌效果不能充分发挥。因此建议生产中将福美双与具有内吸作用的三唑醇混配以防治玉米丝黑穗病，确定福美双和三唑醇分别按照6.5∶1.5和6∶2的配比构建15％克·福·醇种衣剂为最优化选择。
权利要求
1.一种离体条件下测定杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌毒力的方法，包括以下步骤1)制备玉米丝黑穗孢子悬浮液；2)在含3％葡萄糖或蔗糖的改定理查液体培养基中接种步骤1)制备的玉米丝黑穗孢子悬浮液并加入不同浓度梯度的待测杀菌剂，在26-28℃摇培80-90小时，测定650nm波长下不同处理的吸光值，得出待测杀菌剂的毒力。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述玉米丝黑穗孢子悬浮液可按下述方法制备将玉米丝黑穗冬孢子粉以1mg∶1ml的比例浸泡于0.03％的土温20水溶液4-6小时，离心弃上清液，孢子沉淀用0.25％KMnSO4水溶液消毒处理25min，无菌水洗涤离心，孢子沉淀用0.05M盐酸处理4-6hr后离心，孢子沉淀用无菌水或3％葡萄糖或蔗糖的改定理查液体培养基浮载。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤2)中接种的玉米丝黑穗孢子悬浮液的比例为，含有1mg玉米丝黑穗孢子粉的玉米丝黑穗孢子悬浮液20ml 3％葡萄糖或蔗糖的改定理查液体培养基。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤2)中所述改定理查液体培养基为3％葡萄糖改定理查液体培养基。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤2)中所述摇培时间为84小时。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤2)中所述摇培的容器为酶联板或微孔培养板。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述测定650nm波长下不同处理的吸光值的仪器为酶联检测仪或多孔分光光度检测仪。
全文摘要
本发明公开了一种离体条件下测定杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌毒力的方法，其目的是提供一种离体条件下快速、有效测定杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌毒力的方法。本发明所提供的离体条件下测定杀菌剂对玉米丝黑穗病原菌毒力的方法，包括以下步骤1)制备玉米丝黑穗孢子悬浮液；2)在含3％葡萄糖或蔗糖的改定理查液体培养基中接种步骤1)制备的玉米丝黑穗孢子悬浮液并加入不同浓度梯度的待测杀菌剂，在26－28℃摇培80－90小时，测定650nm波长下不同处理的吸光值，得出待测杀菌剂的毒力。该方法为进一步的田间药效试验和混配药剂的研制提供了理论依据，将在玉米丝黑穗的防治中发挥重要作用。
文档编号G01N21/31GK1560600SQ200410004488
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月27日 优先权日2004年2月27日
发明者刘西莉, 李旭军, 李健强, 朱春雨, 刘鹏飞, 李继伟 申请人:中国农业大学