专利名称：一种荧光寿命测量方法及系统的制作方法
技术领域：
本发明属于光电检测领域，尤其涉及一种荧光寿命测量方法及系统。
背景技术：
荧光显微技术已经成为生命科学，尤其是细胞生物学研究的重要 工具。双光子激 发荧光显微技术具有对生命体的杀伤作用小，穿透深度大，具有层析能力等优点，已经成为 生命科学研究的重要手段。除荧光强度的分布和变化以外，荧光寿命对荧光团所处的微环 境非常敏感，能够对离子浓度(Ca2+，Na+)、pH值和p02等生理生化参数进行定量测量，因此双 光子激发荧光寿命测量能够为生物医学检测和分析提供高时空分辨率的功能信息，并有望 在蛋白质间相互作用的研究和癌症的早期诊断等生物学和临床医学领域获得重要的应用。目前双光子激发荧光寿命测量方法包括时间相关单光子技术(Time-Correlated Single Photon Counting, TCSPC)和门控像增强器。TCSPC通过统计单个光子发光几率拟 合出荧光寿命，而门控像增强器通过控制开关增强器，以非常短的时间记录不同时刻的荧 光衰减，再重构出完整的荧光衰减。二者均不能一次性直接记录荧光的衰减，成像速度慢。 扫描相机能够将时间变化转化为空间变化，一次记录完整的荧光衰减，具有明显优势。当前已有多参量多焦点荧光显微成像技术的相关报道，该技术具有同时获取荧光 光谱信息和荧光寿命信息的特点。利用针孔阵列形成阵列点并行双光子激发，荧光由自制 的扫描相机记录，在扫描相机前放置色散棱镜对光谱色散，扫描相机记录的图像一维为光 谱信息，另一维为荧光寿命信息。该方法图像传感器CCD相机每幅图像只能获得样品的阵 列点阵位置处光谱和寿命信息，如果要获得二维样品信息，必须对各子区域内对阵列点逐 点移动，并且阵列点每移动一个位置需要记录一幅图像，例如，对于512x512图像，阵列点 为4x4，需要记录16384幅图像，导致成像速度慢，特别对获得生物样品影响明显。实际上， 有些情况仅仅需要快速获得荧光寿命信息，而荧光光谱信息并不重要，需要发展快速的荧 光寿命测量方法。

发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种荧光寿命测量方法，旨在解决现有荧光寿命测 量速度慢、效率低的问题。本发明实施例是这样实现的，一种荧光寿命测量方法，包括以下步骤产生激发光；将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域；利用所述多个子光束，同时对所述多个子区域进行扫描，使各子区域内的荧光物 质发出荧光；实时采集扫描时发出的所述荧光；分辨所述荧光的寿命信息。本发明实施例的另一目的在于提供一种荧光寿命测量系统，所述系统包括
激发光源，用于产生激发光；分光器，用于将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个 子区域；第一扫描镜，用于将所述多个子光束调整至第二扫描镜；第二扫描镜，用于将经所述第一扫描镜调整后的多个子光束调整至所述样品，使 各子区域内的荧光物质发出荧光；双色镜，用于导出所述荧光；成像透镜，用于实时采集所述荧光；扫描相机，用于分辨所述荧光的寿命信息；探测器，用于记录所述荧光的寿命信息。本发明实施例将激发光分为与样品上多个子区域一一对应的多个激发光子光束， 利用激发光子光束对对应的测量子区域进行扫描，形成多线并行激发荧光，达到快速获取 荧光寿命的目的，效率高。


图1是本发明实施例提供的荧光寿命测量方法的实现流程图；图2是本发明实施例提供的荧光寿命测量系统的结构图；图3是本发明实施例提供的荧光寿命测量系统的光路图；图4a是本发明实施例提供的荧光寿命测量系统在第一个扫描位置的荧光寿命信 息；图4b是本发明实施例提供的荧光寿命测量系统在第二个扫描位置的荧光寿命信 息；图5是样品中任意一点的荧光衰减曲线。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。本发明实施例将激发光分为与样品上多个子区域一一对应的多个激发光子光束， 激发光子光束对对应的测量子区域进行扫描，形成多线并行激发荧光，达到快速获取荧光 寿命的目的。本发明实施例提供的荧光寿命测量方法包括以下步骤产生激发光；将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域；利用所述多个子光束，同时对所述多个子区域进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；实时采集扫描时发出的所述荧光；分辨所述荧光的寿命信息。本发明实施例提供的荧光寿命测量系统包括
激发光源，用于产生激发光；分光器，用于将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域；第一扫描镜，用于将所述多个子光束调整至第二扫描镜；第二扫描镜，用于将经所述第一扫描镜调整后的多个子光束调整至所述样品，使 各子区域内的荧光物质发出荧光；双色镜，用于导出所述荧光；成像透镜，用于实时采集所述荧光；扫描相机，用于分辨所述荧光的寿命信息；探测器，用于记录所述荧光的寿命信息。图1示出了本发明实施例提供的荧光寿命测量方法的实现流程，详述如下在步骤SlOl中，产生激发光；本发明实施例优选工作频率为76MHz，周期为120fs，中心波长为800nm的脉冲激 光作为激发光，此激发光可实现荧光物质的双光子激发。在步骤S102中，将激发光分为多个子光束，多个子光束对应于样品的多个子区 域；本发明实施例中，将激发光均分为多个平行的子光束，多个子光束一一对应于具 有荧光物质的样品的多个子区域。在步骤S103中，利用多个子光束，同时对多个子区域进行扫描，使各子区域内的 荧光物质发出荧光；本发明实施例中的扫描分为线扫描和步进扫描，具体过程如下1、线扫描各子光束经聚焦形成激发光阵列点分别投射至样品的各个子区域，沿样品纵向对 各子区域进行线扫描，各子区域内的荧光物质在激发光阵列点的作用下发出荧光。2、步进扫描对各个子区域的线扫描结束后，沿样品横向对各个子区域进行步进扫描即调整激 发光阵列点在样品横向的位置。循环执行上述线扫描和步进扫描，直至完成对样品各个子区域的扫描。应当理解， 具体实施时还可以调换线扫描与步进扫描的方向。在步骤S104中，实时采集线扫描时发出的荧光；本发明实施例中，对各子区域进行线扫描的同时，采集各子区域内荧光物质发出 的荧光。在步骤S105中，分辨荧光的寿命信息；本发明实施例中，将荧光的寿命信息转换为可分辨的空间信息，从而获取样品各 点的荧光寿命。本发明实施例将激发光分为多个子光束，由多个子光束对样品进行扫描，多线并 行激发样品内的荧光物质，大大提高荧光寿命测量的速度。图2和图3示出了本发明实施例提供的荧光寿命测量系统的结构，为了便于说明， 仅示出了与本发明实施例相关的部分。
本发明实施例提供的荧光寿命测量系统具有一激发光路和一探测光路。激发光路 包括激发光源、扩束准直装置、整形器、分光器、准直器件、第一扫描镜和第二扫描镜以及显 微物镜。探测光路包括显微物镜、第二扫描镜、双色镜、滤光片、成像透镜、扫描相机以及探 测器。第二扫描镜以及显微物镜为激发光路和探测光路所共用。以下对激发光路的结构进行详细说明。如图2和图3所示，本发明实施例优选钛宝石飞秒激光器101作为 激发光源，其可 产生中心波长为SOOnm、频率为76MHz、周期为120fs的脉冲激光，该脉冲激光可实现荧光物 质的双光子激发。脉冲激光经由扩束准直透镜102和扩束准直透镜103构成的扩束准直装 置，变成所需尺寸的准直光。本发明实施例中，整形器为光束整形器104，经准直的脉冲激光经光束整形器104 整形，形成强度平顶分布的光束，经整形后激光的强度分布均勻。分光器可为微透镜阵列、 衍射光学元件或分束器，本实施例优选微透镜阵列105，平顶分布的激光经微透镜阵列105 被分成多个子光束，多个子光束对应样品的多个子区域，本实施例中微透镜阵列105为 4X4微透镜阵列即微透镜阵列105具有16个微透镜。本发明实施例准直器件优选管镜 106，管镜106的后焦面与微透镜阵列105的前焦面重合，子光束在微透镜阵列105的前焦 面即在管镜106的后焦面聚焦，各子光束经管镜106均变为平行光的子光束。在本发明实施例中，子光束的传输光路上设有第一扫描镜107，经第一扫描镜107 调整后的光路上设有第二扫描镜113，具有荧光物质的样品116设在经第二扫描镜113调 整后的光路上，样品116与第二扫描镜113之间设有显微物镜114，本实施例中显微物镜 114的后焦面与管镜106的前焦面重合，子光束经本激发光路形成激发光阵列点聚焦于样 品，激发样品116内的荧光物质发出荧光。此外，为便于调节样品116，将其设于微调样品台 115。以下对探测光路的结构进行详细说明。如图2和图3所示，探测光路中的双色镜112设于第一扫描镜107与第二扫描镜 113之间，双色镜112对中心波长为800nm的脉冲激光高透，对波长为400 700nm的荧光 高反，双色镜112与子光束之间的夹角为45°或135°，双色镜112将荧光从激发光路反射 出来。荧光经双色镜112反射后的传输光路上依次设有成像透镜109、扫描相机110以及探 测器。在本发明实施例中，成像透镜109将荧光按其在样品不同的位置会聚于扫描相机 110的光电阴极。扫描相机110具有电压线性变化的偏转电场，能够将会聚于光电阴极的不 同位置的荧光的寿命信息转换为可分辨的空间位置信息，以便探测器识别荧光衰减信息， 从而获取样品各点的荧光寿命。本发明实施例中，探测器为面阵探测器111，面阵探测器111优选为CXD相机或 CMOS相机，面阵探测器111用于识别荧光衰减信息，同时记录荧光在样品上的位置信息。面 阵探测器111与计算机117连接，计算机117用于读取、存储和处理探测器探测到的荧光衰 减信息，由计算机117控制面阵探测器111的曝光时间；计算机117亦可控制第一扫描镜 107和第二扫描镜113。此外，成像透镜109与双色镜112之间设滤光片，滤光片为干涉滤光片108，干涉滤 光片108将反射回来的激发光以及其它杂散光过滤掉，避免干扰。
在本发明实施例中，面阵探测器111的曝光时间大于等于第一扫描镜107的一个 扫描周期，其曝光时间优选为第一扫描镜107扫描周期的整数倍。面阵探测器111开始曝 光，第一扫描镜107同时作顺(逆)时针快速扫描，第一扫描镜107归位时作逆(顺)时针 快速扫描。第一扫描镜107扫描时，第二扫描镜113必须静止，此时子光束沿样品纵向对样 品各子区域作线扫描，图4a所示为第一扫描镜107在第一个扫描位置的寿命信息。第一扫 描镜107完成一个位置的线扫描，面阵探测器111曝光结束，记录一幅图像，接着第二扫描 镜113开始一个步进扫描，第二扫描镜113步进扫描的方向与第一扫描镜107线扫描的方 向相互垂直，第二扫描镜113完成一个步进扫描后，第一扫描镜107重复线扫描，图4b所示 为第一扫描镜107在第二个扫描位置的寿命信息。通过第二扫描镜113的步进扫描即可实 现对整个样品的扫描，获得整个样品各点的荧光寿命(衰减)信息。第一扫描镜107的扫 描周期为第一扫描镜107作一次顺时针或一次逆时针扫描的时间的整数倍，本实施例中第 一扫描镜107的扫描周期优选为第一扫描镜107作一次顺时针扫描与一次逆时针扫描的时 间之和。当然第一扫描镜107可以完成多个扫描周期后，第二扫描镜113才开始一个步进 扫描。本发明实施例中，钛宝石飞秒激光器101发出激光脉冲与扫描相机110开启同步， 即钛宝石飞秒激光器101每发出一个激光脉冲，扫描相机110开启一次，本实施例利用同步 信号开启和关闭扫描相机110。钛宝石飞秒激光器101发出的脉冲到达样品时激发出荧光， 扫描相机110的光电阴极接收到所激发出的荧光时发射出光电子，所发出的光电子在扫描 相机110的偏转电场的作用下偏转，在扫描相机110的荧光屏上按空间位置产生二次荧光， 产生的二次荧光对应着样品上不同点发出的荧光不同时间的强度分布，即荧光强度的衰减 信息。如图5所示，计算出荧光衰减至其最大强度值的Ι/e的时间即为荧光寿命。经过测试，本发明实施例同样对于512x512图像，阵列点为4x4，仅需记录128幅图 像。跟现有技术相比，获取荧光寿命信息的速度大幅提高。本发明实施例将激发光分为与样品上多个子区域一一对应的多个激发光子光束， 利用激发光子光束对对应的测量子区域进行扫描，形成多线并行激发荧光，达到快速获取 荧光寿命的目的。此外，子光束对样品进行扫描时，其对样品不同位置处荧光物质的激发具 有一定的时间间隔即引入了线内点间到达样品的时间，大大减小了由柱面镜产生的线内点 间的串扰，提高了空间分辨率和图像对比度。本方法及系统具有能够快速获取样品荧光寿 命信息的特点，因此，该技术对生物医学领域研究，特别是对癌症早期诊断，具有重要意义。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种荧光寿命测量方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤产生激发光；将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域；利用所述多个子光束，同时对所述多个子区域进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；实时采集扫描时发出的所述荧光；分辨所述荧光的寿命信息。
2.如权利要求1所述的荧光寿命测量方法，其特征在于，所述扫描分为线扫描和步进 扫描，具体过程为各子光束经聚焦形成激发光阵列点分别投射至样品的各个子区域，沿样品纵向对各子 区域进行线扫描，各子区域内的荧光物质在所述激发光阵列点的作用下发出荧光；对各个子区域的线扫描结束后，沿样品横向对各个子区域进行步进扫描即调整所述激 发光阵列点在样品横向的位置；循环执行所述线扫描和步进扫描，直至完成对样品各个子区域的扫描。
3.如权利要求1所述的荧光寿命测量方法，其特征在于，所述产生激发光的步骤之后 还包括以下步骤调整所述激发光的尺寸并进行准直；并调整所述激发光的强度分布，使所述激发光的 强度分布均勻；所述将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域的步骤 之后还包括以下步骤准直各个所述子光束，使各个所述子光束成为平行光； 所述实时采集扫描时发出的所述荧光的步骤之前还包括以下步骤 过滤所述荧光，将杂散光去除。
4.如权利要求1 3至任一项所述的荧光寿命测量方法，其特征在于，所述分辨所述荧 光的寿命信息的步骤具体为将所述荧光的寿命信息转换为可分辨的空间信息，获取样品各点发出的荧光的寿命。
5.一种荧光寿命测量系统，其特征在于，所述系统包括 激发光源，用于产生激发光；分光器，用于将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域；第一扫描镜，用于将所述多个子光束调整至第二扫描镜；第二扫描镜，用于将经所述第一扫描镜调整后的多个子光束调整至所述样品，使各子 区域内的荧光物质发出荧光； 双色镜，用于导出所述荧光； 成像透镜，用于实时采集所述荧光； 扫描相机，用于分辨所述荧光的寿命信息； 探测器，用于记录所述荧光的寿命信息。
6.如权利要求5所述的荧光寿命测量系统，其特征在于，所述激发光源与分光器之间 还设有扩束准直装置，用于调整所述激发光的尺寸并进行准直；以及整形器，用于调整所述激发光的强度分布，使所述激发光的强度分布均勻。
7.如权利要求6所述的荧光寿命测量系统，其特征在于，所述分光器与第一扫描镜之 间还设有准直器件，用于准直各个所述子光束，使各个所述子光束成为平行光。
8.如权利要求7所述的荧光寿命测量系统，其特征在于，所述第二扫描镜与样品之间 还设有显微物镜，用于将各个所述子光束会聚于样品。
9.如权利要求8所述的荧光寿命测量系统，其特征在于，所述准直器件为管镜，所述分 光器为微透镜阵列、衍射光学元件或分束器；所述管镜的后焦面与所述微透镜阵列的前焦 面重合，所述管镜的前焦面与所述显微物镜的后焦面重合。
10.如权利要求5 9中任一项所述的荧光寿命测量系统，其特征在于，所述探测器的 曝光时间大于等于所述第一扫描镜的一个扫描周期，所述第一扫描镜完成一个周期的线扫 描或多个周期的线扫描后，所述第二扫描镜开始一个步进扫描，所述第二扫描镜完成一个 步进扫描后，所述第一扫描镜重复所述线扫描；所述第一扫描镜扫描的方向与所述第二扫 描镜步进扫描的方向相互垂直。
全文摘要
本发明适用于光电检测领域，提供了一种荧光寿命测量方法及系统，所述荧光寿命测量方法包括以下步骤产生激发光；将所述激发光分为多个子光束，所述多个子光束对应于样品的多个子区域；利用所述多个子光束，同时对所述多个子区域进行扫描，使各子区域内的荧光物质发出荧光；实时采集扫描时发出的所述荧光；分辨所述荧光的寿命信息。本发明实施例将激发光分为与样品上多个子区域一一对应的多个激发光子光束，利用激发光子光束对对应的测量子区域进行扫描，形成多线并行激发荧光，达到快速获取荧光寿命的目的，效率高。
文档编号G01N21/64GK101832931SQ201010182599
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者屈军乐, 牛憨笨, 邵永红 申请人:深圳大学