专利名称：一种准确检测花粉中的黄酮含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种花粉的检测方法，特别涉及简单而准确地检测花粉中的黄酮含量的方法。
背景技术：
花粉不仅含有丰富的营养成分，而且还含有许多与生命科学有关的药效成分。据报道黄酮为花粉中降血脂，抑制血栓，降压作用，抗病毒，抑菌，消炎，保肝的有效成分和药效物质基础。但是由于不同种类的花粉，例如油菜花粉、荞麦花粉、松花粉、茶花粉中的黄酮含量明显不同。一些花粉的黄酮含量较低，采用普通的检测方法难以检测出，或者需要较繁琐的提取过程，才能检测出其中的黄酮含量。双水相萃取术已广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化学和食品化工等领域，并取得了许多成功的范例，有广阔的工业应用前景。本发明采用了双水相体系萃取花粉中黄酮成份，用四氢呋喃、二氧六环替代常规双水相技术中使用的乙醇、乙腈、聚合物等，具有更好的萃取效果，结合HPLC-UV定量检测，有较温和的操作条件和较高检测灵敏度、快速、准确、稳定等特点。

发明内容
本发明的目的旨在于克服现有技术的缺陷，提供一种准确测定花粉中总黄酮的方法，为黄酮的多种生物活性的研究提供一种快速、准确、直观的定性和定量的测定。本发明所述的准确检测花粉中的总黄酮含量的方法，包括以下步骤:
(1)工作曲线的制作:在IOmL比色管中，加入至少5种黄酮标准溶液，加入萃取剂和盐，稀释至刻度，涡旋，离心，移取上层有机相，在一定色谱条件下，测定黄酮的回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率；
(2)样品处理
称取1.00-4.0Og含黄酮的花粉，加入30-50mL50%甲醇提取其中黄酮，其计量单位为v/V。室温放置0.5h后过滤，在滤液中加入5-8mL36%浓盐酸，其计量单位为w/w。水浴40_65°C加热0.5h，转移至50mL容量瓶中定容；取2.0mL含花粉提取液于IOmL离心管中，加入萃取剂和盐，稀释至刻度，涡旋、离心，移取上层有机相，在选定色谱条件下进行测定；
步骤(I)和(2)所述的色谱条件为色谱柱:Agilent ZorbaxSB_C18 (150 mmX4.6 mm);流动相:甲醇-0.5%冰醋酸(51:49);检测波长:入=360 nm ;柱温:30±5°C ;进样量:10y L ;流速:1.0 mL/min。所述的检测花粉中黄酮含量包括槲皮素、山萘酚的检测。所述有萃取剂包括:四氢呋喃、二氧六环中的一种，用量为0.5-1.0mL。所述的盐为NaCl、(NH4) 2S04、NH4C1、MgSO4、Na2SO4 中的一种，用量为 1.0-2.0g。所述的离心时间3-lOmin,离心速率2000-4000r / min。本发明所述的准确检测花粉中的总黄酮含量的方法针对现有技术花粉中的总黄酮含量检测弊端，确定了一种快速、简便提取方法及水-萃取剂-盐构成的双水相萃取体系，对花粉中的黄酮进行提取、分离富集，建立了 HPLC-UV法测定花粉黄酮提取物中槲皮素、山萘酚2种黄酮类化合物的方法，为研究不同种类花粉中黄酮的含量提供识别方法。为花粉资源的综合开发利用的提供依据。可用于不同种类花粉中黄酮类化合物的定量分析，为花粉原料及其提取物的质量控制和评价奠定了基础。其优点在于:
a、由于黄酮类物质绝大部分由不同甙元结合不同种类和数量的糖配基构成，通过水解可得到黄酮甙元。药典中所叙述的水解提取方法需要精密称定花粉细粉后置于锥形瓶中用80% (v/v)的甲醇50ml加热回流lh，过滤后加入稀盐酸8mL，置水浴上再加热水解lh，取出后迅速冷却，最后转移至容量瓶中再用80%(v/v)甲醇定容。针对药典中的提取过程耗时较长而且较为繁琐，同时消耗较多有机溶剂的现状，本发明的水解提取方法则有所改进，时间缩短、有机溶剂量降低、操作条件温和。 b、使用双水相萃取体系作为样品富集的前处理方法，用四氢呋喃、二氧六环替代常规双水相技术中使用的乙醇、乙腈、聚合物等，有更好的富集倍数及回收率，使得测定检出限降低，能更精确的检测花粉中的黄酮含量。C、本发明的双水相萃取体系以四氢呋喃、二氧六环为萃取剂，其在360nm处没有紫外吸收，不干扰目标物质的测定，并且该萃取剂容易得到，萃取条件温和，富集后所得的富集因子较大，且与高效液相色谱法结合后有效地提高了该仪器的测定灵敏度。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。实施例1
利用本发明检测荞麦花粉中槲皮素和山萘酚的含量。1、工作曲线制作:分别取0.20,0.50,0.80,1.00,1.50 mL槲皮素和山萘酚IOOl^g/mL标准储备液至五支IOmL离心管中混合，加水稀释，加入Ig (NH4)2SO4,涡旋20s，使溶解，加入ImL四氢呋喃，加水稀释至刻度，涡旋20s，3000r/min离心8 min，用吸管移取上层有机相，加入0.5mL甲醇，4000r/ min离心3min，使(NH4) 2S04在离心管底部析出，用注射器吸取上清液，通过0.45 U m微孔滤膜,色谱柱为Agilent ZorbaxSB_C18 (150 mmX4.6 mm),柱温控制在0±5°C，流速为1.0 mL/min，各取10 ill用液相色谱法，以甲醇:0.5% (v/v)乙酸溶液(51:49)为流动相，在360nm波长处测定。回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率等见表I。表I黄酮的线性方程
权利要求
1.一种准确检测花粉中的黄酮含量的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)工作曲线的制作:在IOmL比色管中，加入至少5种黄酮标准溶液，加入萃取剂和盐，稀释至刻度，涡旋，离心，移取上层有机相，在一定色谱条件下，测定黄酮的回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率，色谱条件为色谱柱=Agilent ZorbaxSB-C18(150 mmX4.6mm);流动相:甲醇-0.5%冰醋酸(51:49);检测波长:入=360 nm ;柱温:30±5°C ;进样量:10 u L ;流速:1.0 mL/min ； (2)样品处理 称取1.00-4.0Og含黄酮的花粉，加入为30-50 mL50% v/v的甲醇提取其中黄酮，室温放置0.5h后过滤,在滤液中加入5-8mL36% (w/w)浓盐酸,水浴40_65°C加热0.5h,转移至50mL容量瓶中定容；取5.0mL含花粉提取液于IOmL离心管中，加入萃取剂和盐，稀释至刻度，涡旋、离心，移取上层有机相，在选定色谱条件下进行测定，色谱条件为色谱柱=AgilentZorbaxSB-C18(150 mmX4.6 mm);流动相:甲醇-0.5%冰醋酸(51:49);检测波长:入=360nm ;柱温:30±5°C ;进样量:10 y L ;流速:1.0 mL/min。
2.根据权利要求1所述的一种准确检测花粉中的黄酮含量的方法，其特征在于检测的黄酮包括槲皮素、山萘酚检测。
3.根据权利要求1所述的一种准确检测花粉中的黄酮含量的方法，其特征在于萃取剂为:四氢呋喃、二氧六环中的一种，其用量为0.5-1.0mL。
4.根据权利要求1所述的一种准确检测花粉中的黄酮含量的方法，其特征在于，盐为NaCl、(NH4)2S04、NH4Cl、MgS04、Na2S04 中的一种，用量为 1.0-2.0g。
5.根据权利要求1所述的一种准确检测花粉中的黄酮含量的方法，其特征在于离心时间 3-lOmin,离心速率 2000-4000r / min。
全文摘要
一种准确检测花粉中的黄酮含量的方法公开了一种提取检测花粉中黄酮含量的方法，研究不同花粉中黄酮类化合物的提取及双水相萃取结合HPLC-UV法测定花粉中槲皮素、山萘酚2种黄酮类化合物的方法。即水-萃取剂-盐构成的双水相体系，使黄酮萃取到有机相中，进行相分离，用高效液相色谱法测定有机相的黄酮，方法检测限为0.2μg/mL。该方法能有效提取、分离及富集花粉中黄酮，消除了基体干扰，提高了检测灵敏度，具有萃取条件温和、操作简单、测定快速、有效，准确等特点。
文档编号G01N30/06GK103149304SQ20131009003
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月21日 优先权日2012年12月1日
发明者何昆云, 赵姣, 涂莉芸, 杨蕾, 杨志晶 申请人:云南白药集团股份有限公司