专利名称：一种Th细胞表面及胞内染色的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种Th细胞表面及胞内染色的方法及其应用，属于内分泌技术领域。
背景技术：
自身免疫性甲状腺病(autoimmune thyroid disease, AITD)为器官特异性自身免疫性疾病，以对甲状腺抗原自我耐受被破坏为特征。桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’ sthyix)idtiS，HT)与Graves病(⑶)均属于典型的自身免疫性甲状腺疾病，甲状腺中均有多量淋巴细胞以及浆细胞、NK细胞和巨噬细胞浸润，以HT淋巴细胞的浸润最为广泛。目前普遍认为，HT是由于抑制性T淋巴细胞功能降低，辅助性T淋巴细胞作用增强，使B淋巴细胞分化产生大量抗甲状腺抗体，其中最常见的是抗过氧化物酶抗体(TPOAb)，通过抗体依赖性和自然杀伤细胞介导的细胞毒作用导致甲状腺组织结构破坏和甲状腺功能低下为主要特点。CD4+T细胞是机体执行免疫应答的重要细胞，初始CD4+T细胞受抗原刺激被激活后，可在不同的细胞因子微环境下分化为效应细胞Thl、Th2、Thl7或调节性T细胞(Regulatory T cells, Treg)。Thl 细胞主要释放 IFN-Y、IL_12、TNF_ β 等细胞因子，激活巨噬细胞、中性粒细胞等，发挥细胞毒及吞噬效应，介导细胞免疫。Th2细胞主要分泌的细胞因子有IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等，促进B细胞释放IgG、IgA、IgE抗体，介导体液免疫。Thl7细胞分泌IL-17A、IL-17F、IL-6和IL-9等，实验动物模型显示Thl7细胞与器官特异性自身免疫性炎症反应关系密切。Treg细胞则特异性抑制CD4+、CD8 + T细胞的活化和增殖，从而阻止自身免疫反应的发生。在免疫应答过程中，免疫细胞间可通过所分泌的细胞因子而相互刺激，彼此约束，从而对免疫应答进行调节。细胞因子作为免疫细胞调节剂、免疫效应分子、炎性反应促进剂参与、调节、影响、促进这一过程。细胞因子的改变，在AITD患者中提示Thl / Th2功能有异常，这种异常可影响调节甲状腺细胞功能网络系统的活动，促进甲状腺抗体形成增多，促使AITD的发生，发展。普遍认为Thl型细胞因子所介导的细胞免疫反应在HT发病中起主要作用。其中代表性的细胞因子为IFN-Y。它一方面促进甲状腺内的淋巴细胞浸润，另一方面促进浸润的淋巴细胞和巨噬细胞活化并释放TNF-a、IL-U IL_6等细胞因子以及氧自由基的产生，这些物质可造成甲状腺组织破坏。GD的发生与促甲状腺激素受体抗体(TRAb)的产生有直接的关系，它是引起GD的主要和直接原因。TRAb属于IgGl亚类，而Th2型细胞因子促进IgGl亚类的产生。⑶的免疫反应呈Th2型，其免疫应答以体液免疫为主。TRAb模拟TSH的作用过度刺激甲状腺滤泡细胞，导致甲状腺功能亢进[3]。Th细胞有多种亚型，包括能分泌IL-17A的Thl7亚型，在器官特异性自身免疫性炎症的实验模型中显示出重要意义。而如何从单细胞水平检测不同细胞内的细胞因子，是相关领域有待解决的技术问题。

发明内容
本发明的目的是为了提供一种Th细胞表面及胞内染色的方法及其应用，以提供一种从单细胞水平检测不同细胞内的细胞因子的方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种Th细胞表面及胞内染色的方法，其步骤为:I)在一支流式测定管中加Iml肝素抗凝全血和Iml无菌的含10%小牛血清的RPMI1640培液混匀。2)在上述管中再加入佛波酯2ul，离子霉素2ul，莫能菌素2ul ;盖上盖子，在37°C，5%的CO2培养箱中培育不超过3.5小时(千万不要超过3.5小时，否则⑶4细胞得率降低。盖子不要盖太紧)。3)在3个流式管子内，分别加入IFNy/CD4/IL4体系，标记为IL-4，加入IFN-Y /⑶4/IL-17体系，标记为IL-17，以及阴性对照管(不加任何抗体)。取步骤2)的全血培养液轻缓颠倒混匀，取出600μ I分别加到三个流式管子中。4)每根流式管子加4ml无菌红细胞裂解液，颠倒混匀数次，放置lOmin，裂解红细胞。5)将裂解红细胞后的样本离心1，500rpm, 5min,弃上清。6)每管加Iml PBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗沉淀,离心1，500rpm, 5min,弃上清加标记抗体PE-Cy5-CD4抗体10 μ 1，阴性管不要加，4°C避光孵育30min。7)每管加Iml PBS缓冲液轻轻弹拨数次洗涤，离心1，500rpm，5min，弃上清，控干。8)每管加冷固定剂:500μ 1，4%多聚甲醛；固定20min，避光放置。9)每管加Iml PBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗,离心1，500rpm, 5min,弃上清。加500 μ 1，I %的皂素穿膜剂，避光放置lOmin。10) 1，500rpm, 5min,离心弃上清。11)在标记为 IL-4 的管子中加 FITC-1FN- Y 抗体 0.5ug，PE-1L-4 抗体 0.125ug，在 IL-17 的管子中 FITC-1FN- Y 抗体 0.5ug, PE-1L-17 抗体 0.25ug。12)将上述3根流式管子放在暗室中，室温孵育过夜后，上流式仪器检测。所述的流式细胞仪检测采用BECTON DICKINSON FACSCalibur流式细胞仪进行检测，结果分析应用CellsQuest软件。激活剂:在静止状态下,未活化的淋巴细胞内基本不表达或仅表达少量细胞因子，因而难以检测。只有当其被活化后，细胞内因子才能合成增加，因此检测细胞内细胞因子必须利用激活剂将其活化。阻断剂选择:细胞在活化后，细胞因子合成增多，却不断地分泌至细胞外发生作用，这就造成了用流式细胞检测其细胞内细胞因子水平的困难，因此还要阻断剂阻止其细胞因子分泌至胞外才能进行检测。本试验中使用的阻断剂是莫能菌素。莫能菌素通过抑制细胞内细胞因子向细胞外分泌，使细胞因子合成后累积在细胞内，但是，莫能菌素可产生剂量、时间依赖的细胞毒作用，故在使用时应摸索其实验条件，通常在刺激反应结束前6 12小时内使用。激活时间:根据检测指标和标本的不同，需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。标本处理:避免使用络合钙的抗凝剂，如EDTA(因为它会限制钙依赖性激活过程)，所以推荐使用肝素钠。此外，血样在8h内应进行实验，超过8h会导致细胞活性损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8h内实验，应将真空采血管水平室温放置。其基本原理是应用荧光素标记的特异性抗细胞因子单克隆抗体(如IFN、IL-4、IL-17等)和抗细胞表面分子单克隆抗体(如CD4、CD25等)，借助FCM免疫荧光技术(如FACS)即可从单细胞水平检测不同细胞内的细胞因子，并由此可判断产生特定细胞因子的细胞种类、细胞定位、分布密度及细胞因子与组织病变关系等。本发明通过刺激细胞一阻断细胞膜表面Fe受体一细胞膜表面抗原染色一细胞固定一细胞透膜一胞内或核内抗原染色一流式细胞分析等步骤，可以对Th细胞表面及胞内染色，并获得较好的实验效果。可应用于测试Thl、Th2、Thl7细胞占⑶4+细胞的比例。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。实施例1、入选人群⑶组25例和桥本氏甲减组25例患者均来自2010-06到2011-01上海市瑞金医院内分泌门诊。正常对照组来25例自年龄和性别相匹配的健康体检者。上述初发GD患者25例，尚未治疗。控制稳定期⑶患者25例。上述健康体检者25例。初发⑶组患者的诊断参照《内科学》第六版和《协和内分泌代谢学》第六版中GD的诊断标准。确诊的GD患者符合下述条件之一即可入选。存在甲状腺功能亢进的症状，伴或不伴突眼，甲状腺弥漫性肿大(触诊或B超证实)、质软；甲状腺功能检查(CMIA 法；Architect system, Abbott Laboratories, USA):游离 T3(FT3)、游离 T4(FT4)升高、超敏促甲状腺激素(sensitive thyroidStimulatinghormone, STSH)水平降低。甲状腺自身抗体(TRAb)阳性(ECLIA法；RocheDiagnostics)。桥本氏甲减组患者的诊断参照《内科学》第六版和《协和内分泌代谢学》第六版中的诊断标准:甲状腺中度肿大，质地坚硬。甲状腺功能检查:总T4 (TT4)、FT4减低、STSH显著升高。甲状腺球蛋白抗体(TgAb)和抗过氧化物酶抗体(TPOAb)滴度明显升高。⑶治疗稳定组甲状腺功能检查:游离T3(FT3)、游离T4(FT4)、超敏促甲状腺激素水平在正常范围，TRAb阴转。所有入选的研究对象均排除近期有感染史、女性妊娠、吸烟、合并其他免疫性疾病及服用免疫增强剂或抑制剂史。两组均选择新诊尚未治疗的病人。生化检查及激素测定血甲状腺激素，由上海市瑞金医院内分泌研究所检测。甲状腺激素测定(化学发光法；Architectsystem, AbbottLaboratories, USA) ;TRAb (ECLIA 法；RocheDiagnostics) JgAb (CMIA法；Architect system, Abbott Laboratories.USA) ；TPOAb (CMIA法；Architect system, Abbott Laboratories.USA)。2、样本准备:所有研究对象均在上午9点至11点空腹采集静脉血6ml，3ml为自凝血，提取血清分装冻存于-80°C，集中检测。3ml用无菌肝素抗凝管收集，置于室温，当天中午即处理，备流式细胞仪检测。3、Th细胞表面及胞内染色:
I)在一支流式测定管中加Iml肝素抗凝全血和Iml无菌的含10%小牛血清的RPMI1640培液混匀。2)在上述管中再加入佛波酯2ul，离子霉素2ul，莫能菌素2ul ;盖上盖子，在37°C，5%的CO2培养箱中培育不超过3.5小时(千万不要超过3.5小时，否则⑶4细胞得率降低。盖子不要盖太紧)。 3)在3个流式管子内，分别加入IFN- Y /CD4/IL-4体系，标记为IL_4，加入IFN-y/⑶4/IL-17体系，标记为IL-17，以及阴性对照管(不加任何抗体)。取步骤2)的全血培养液轻缓颠倒混匀，取出600μ I分别加到三个流式管子中。4)每根流式管子加4ml无菌红细胞裂解液，颠倒混匀数次，放置lOmin，裂解红细胞。5)将裂解红细胞后的样本离心1，500rpm, 5min,弃上清。6)每管加Iml PBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗沉淀,离心1，500rpm, 5min,弃上清加标记抗体PE-Cy5-CD4抗体10 μ 1，阴性管不要加，4°C避光孵育30min。7)每管加Iml PBS缓冲液轻轻弹拨数次洗涤，离心1，500rpm，5min，弃上清，控干。8)每管加冷固定剂:500 μ 1,4%多聚甲醒；固定20min,避光放置。9)每管加Iml PBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗,离心1，500rpm, 5min,弃上清。加500 μ 1，I %的皂素穿膜剂，避光放置lOmin。10) 1，500rpm, 5min,离心弃上清。11)在标记为 IL-4 的管子中加 FITC-1FN- Y 抗体 0.5ug，PE-1L-4 抗体 0.125ug，在 IL-17 的管子中 FITC-1FN- Y 抗体 0.5ug, PE-1L-17 抗体 0.25ug。12)将上述3根流式管子放在暗室中，室温孵育过夜后，上流式仪器检测。检测结果=Thl细胞比例:桥本氏甲减为(17.82% ±1.70%),⑶为(15.72%±0.86%)均高于正常对照组(12.47% ±1.09%) (P<0.05);⑶组 Th2 比例(1.78%±0.19%)显著高于正常对照组(0.99% ±0.13%) (Ρ〈0.01)，桥本氏甲减组Th2比例(1.59% ±0.20%)，高于正常对照组(P〈0.05)。Thl7细胞比例:⑶、桥本氏甲减、对照组分别为(2.30% ±0.12%),(2.87% ±0.31 % ), (1.90% ±0.11%)。两组患者的 Thl7 占⑶4 +细胞比例均高于对照组就，(P〈005)。
权利要求
1.一种Th细胞表面及胞内染色的方法，其特征在于:其步骤为: 1)在一支流式测定管中加Iml肝素抗凝全血和Iml无菌的含10%小牛血清的RPMI1640培液混匀； 2)在上述管中再加入佛波酯2ul，离子霉素2ul，莫能菌素2ul;盖上盖子，在37°C，5%的CO2培养箱中培育不超过3.5小时 3)在3个流式管子内，分别加入IFN-Y/CD4/IL-4体系，标记为IL-4，加入IFN-Y/⑶4/IL-17体系，标记为IL-17，以及阴性对照管；取步骤2)的全血培养液轻缓颠倒混匀，取出600 μ I分别加到三个流式管子中； 4)每根流式管子加4ml无菌红细胞裂解液，颠倒混匀数次，放置lOmin，裂解红细胞； 5)将裂解红细胞后的样本离心1，500rpm,5min,弃上清； 6)每管加ImlPBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗沉淀,离心1，500rpm, 5min,弃上清加标记抗体PE-Cy5-CD4抗体10 μ 1，阴性管不要加，4°C避光孵育30min ； 7)每管加ImlPBS缓冲液轻轻弹拨数次洗漆,离心1，500rpm, 5min,弃上清,控干； 8)每管加冷固定剂:500μ 1，4%多聚甲醛；固定20min，避光放置； 9)每管加ImlPBS缓冲液轻轻弹拨数次清洗，离心1，500rpm，5min，弃上清；加50(^ 1，I %的皂素穿膜剂，避光放置IOmin ； 10)I, 500rpm, 5min,离心弃上清； 11)在标记为IL- 4的管子中加FITC-1FN-Y抗体0.5ug，PE-1L-4抗体0.125ug，在IL-17 的管子中 FITC-1FN Y 抗体 0.5ug, PE-1L-17 抗体 0.25ug ； 12)将上述3根流式管子放在暗室中，室温孵育过夜后，上流式仪器检测。
全文摘要
本发明公开了一种Th细胞表面及胞内染色的方法及其应用，其步骤为刺激细胞→阻断细胞膜表面Fc受体→细胞膜表面抗原染色→细胞固定→细胞透膜→胞内或核内抗原染色→流式细胞分析等步骤，可以对Th细胞表面及胞内染色，并获得较好的实验效果。可应用于测试Th1、Th2、Th17细胞占CD4+细胞的比例。
文档编号G01N1/30GK103105326SQ20121058794
公开日2013年5月15日 申请日期2012年12月30日 优先权日2012年12月30日
发明者宁光, 谢晓雁, 杨颖 , 崔斌, 郭婷, 朱巍 申请人:上海市内分泌代谢病研究所