专利名称：纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物的检测以及产生和用于癌的检测和监测的相关方法
技术领域：
本发明一般地涉及生产针对纤维蛋白原和纤维蛋白降解产物(FDP)的抗体群的方法和涉及针对纤维蛋白原和纤维蛋白降解产物(FDP)的抗体群的产生，涉及抗体群本身和涉及相关的使用方法，涉及通过免疫化学测量血清中的FDP的量检测癌和用于监测癌治疗的进展。
背景技术：
尽管对癌的理解有新的进展，但当前用于癌的筛查和识别的技术留有改进的空间。本领域中已知的用于筛查癌的方法试图通过使用抗体来检测癌相关抗原。抗原是大分子(例如蛋白、核酸或多糖)，其能在体内引起免疫应答。哺乳动物和其他动物的免疫系统具有检测外源因子(例如与癌相关的抗原)和通过产生下述抗体而对这些外源因子应答的能力，所述抗体特异地靶向那些癌相关抗原并与那些癌相关抗原反应。因而，在哺乳动物的循环血液中的这些癌相关抗原或靶向这些抗原的循环抗体的检测与在该个体中的癌的存在之间有强的关联性。因此，检测此类抗原或抗体的存在的试验在癌的筛查和诊断中是有用的。一种有前途的癌相关抗原靶是由纤维蛋白和纤维蛋白原二者的降解产物(FDP) 组成的库(pool)。虽然纤维蛋白和纤维蛋白原二者的降解产物的产生在健康个体中是被限制的，但当癌细胞释放出蛋白水解酶(例如纤溶酶和凝血酶)时，FDP在癌患者中是过量产生的。此外，FDP被作为其他的癌相关过程(例如血管生成和转移)的副产物产生。因为 FDP从肿瘤渗漏到周围液体中，在患有膀胱癌的受试者的尿中、在肺癌受试者的血浆中和在其他癌患者的血浆或血清中可测量到升高的FDP水平。FDP测量在癌诊断中的效用已被猜想了多年；但还没有发展出具有所需的敏感性的能定量测量FDP的精制化的检验。当前的 FDP检验通常被限制于测量作为该组的代表的一种特定的FDP组分，例如D- 二聚体。癌提高了纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)的水平，这都是通过产生纤维蛋白原降解产物和纤维蛋白降解产物二者的组织因子(TF)和尿激酶型纤溶酶原激活剂 (uPA)调控途径(

图1)。通过纤溶酶切割纤维蛋白原产生作为初级末端产物的片段D和E。 凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，作为对来自凝血级联系统的信号的响应。通过纤溶酶切割纤维蛋白产生作为初级末端产物的D-二聚体。通过癌诱导的纤溶酶切割产生的FDP 的组成受两种底物——纤维蛋白和纤维蛋白原的相对量影响。

发明内容
本文公开了用于癌的检测的方法，其包括对含有三种基本片段类型(片段D、片段 E和D- 二聚体)和任选地额外的三种片段类型(片段Y和初始纤溶酶消化产物-IPDP的两种可辨别形式)总计六种FDP组分的纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)的确定混合物的同步检测。方法包括用特异性多克隆抗体库对生物样品中的三种基本FDP抗原进行同时检测，其中所述多克隆抗体对三种FDP片段是特异性的。在本公开的一种实施方式中，提供了用于检测受试者中的癌的方法，所述方法包括下述步骤从受试者中获得生物样品；使生物样品与抗体制剂反应，所述抗体制剂结合与纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)相关的至少三种抗原，以形成抗体-FDP复合物， 其中三种FDP相关的抗原是片段D、片段E和D- 二聚体；检测抗体-FDP复合物；并诊断受试者中的癌。在另一实施方式中，抗体制剂额外地任选地与片段Y和初始纤溶酶消化产物 (IPDP)中的至少一种结合。在另一实施方式中，抗体制剂是多克隆抗体制剂。在另一实施方式中，所述方法包括酶联免疫吸附检验。在另一实施方式中，诊断步骤还包括至少一种额外的诊断测试。在本公开的一种实施方式中，提供了用于监测患者中的癌的方法，其包括下述步骤(a)从受试者中获得第一生物样品，所述第一样品在第一取样时间点收集；(b)从受试者中获得第二生物样品，所述第二样品在第一取样时间点之后的第二取样时间点收集； (c)使生物样品与抗体制剂反应，所述抗体制剂结合与FDP相关的至少三种抗原，以形成抗体-FDP复合物，其中三种FDP相关抗原是片段D、片段E和D- 二聚体；(d)检测抗体-FDP 复合物；(e)确定第二生物样品中的FDP水平与第一生物样品中的FDP水平的比率；(f)对癌发展进行判断；并任选地用在第一和第二时间点后的时间点下得到的额外的生物样品重复步骤(a)-(e)。在另一实施方式中，抗体制剂额外地任选地与片段Y和初始纤溶酶消化产物 (IPDP)中的至少一种结合。在另一实施方式中，抗体制剂是多克隆抗体制剂。在另一实施方式中，所述方法包括酶联免疫吸附检验。在另一实施方式中，如果比率高于或等于1. 15，癌已进展。还在另一实施方式中， 如果比率小于1. 15，癌已退化(regress)或是稳定的。在本公开的一种实施方式中，提供了用于检测受试者中的癌的试剂盒，所述试剂盒包含结合与FDP相关的至少三种抗原的抗体制剂，其中所述三种FDP相关抗原是片段D、 片段E和D- 二聚体；检测系统；和用于测量FDP和使FDP的存在与癌关联的指导；在另一实施方式中，检测系统包含特异性针对与FDP相关的至少三种抗原的检测抗体，其中所述三种FDP相关抗原是片段D、片段E和D- 二聚体。在另一实施方式中，抗体制剂任选地额外地与片段Y和初始纤溶酶消化产物(IPDP)中的至少一种结合。在另一实施方式中，抗体和检测系统包含酶联免疫吸附检验。附图简述图1描绘了癌诱导的纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)的产生的示意图。图2描绘了多个FDP免疫原批次(指定为03、13、15、17、19、21、对和25的8个批次)的非还原性(图2A)和还原性(图2B) SDS-PAGE凝胶。UD指未消化的纤维蛋白原；D 指片段D;E指片段E。图3描绘了与来自结肠直肠癌(CRC)患者血清(n = 5)和正常对照血清(n = 5) 的人血清样品结合的抗-FDP抗体的Western印迹分析(图3A 曝光到胶片上大约5秒， 图:3B 曝光到胶片上大约30秒)。图3C描绘了描绘每个泳道负载的蛋白总量的陪伴凝胶 (companion gel)的考马斯亮蓝(Coomassie Blue)染色。在凝胶上指出了 FDP亚型的位置。
图4描绘了使用抗-FDP多克隆抗体库⑴和结合兔IgG(-)的珠粒的来自人血清 (正常和CRC患者)的抗原的免疫沉淀(IP)。测试了三个样品FDP标定物对照(FDP)、正常人血清(N4)和CRC血清(C15)。图5描绘了使用抗-FDP多克隆抗体库(图5A)或结合兔IgG(对照)的珠粒(图 5B)从五个CRC和五个正常患者的血清中免疫沉淀的FDP抗原。发明详述纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)的检测可以是许多癌中的有价值的临床诊断工具。FDP水平与癌发生、阶段、发展和预后相关联。当前的FDP测试通常被限制于测量作为该组的代表的一种特定的FDP组分，例如D-二聚体。相反，本发明人已确定，许多纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物必须被同时测量，以使FDP的存在或FDP水平的变化分别与癌的存在或发展相关联。就本公开的目的而言，短语“癌的发展”包括患者中的癌的发展、退化或复发(re-occurrence)。本发明公开的检验使用了特异地识别至少三种FDP抗原的抗体制剂，所述FDP抗原在癌的检测和癌发展的监测中是特别有用的。这三种基本的FDP是片段D、片段E和D- 二聚体(也称为片段X)。用于检测和监测癌的有用的三种额外的FDP 是通过测序确定的两种初始纤溶酶消化产物(IPDP)和片段Y。在即时方法的一个实施方式中，三种基本的FDP抗原在同一检验中被大致同时地检测。在其他实施方式中，四种、五种或六种FDP抗原在同一检验中被同时检测。在一种实施方式中，所公开的检验测量片段D、片段E和D-二聚体。在另一实施方式中，所公开的检验测量片段D、片段E、D-二聚体以及一种或二种IPDP。在另一实施方式中，所公开的检验测量片段D、片段E、D-二聚体和片段Y。在另一实施方式中，所公开的检验测量片段D、片段E、D- 二聚体、片段Y和一种或两种IPDP。免疫检验是本领域熟知的并且本文公开的亲和纯化的抗-FDP抗体可被用在不同的检验方法中，包括但不限于酶联免疫吸附检验(ELISA)、斑点或狭缝印迹、捕获分析物的琼脂糖珠粒系统或各种快速测试形式例如侧流式系统或穿流式系统。本发明描述的方法的一个特别的特征是，捕获和/或检测抗体能与三种、四种、五种或六种FDP抗原特异地结合。抗体制剂在本文中是指抗体库，以体现抗体制剂含有多种抗体特异性。在一种实施方式中，抗体制剂是针对含有三种、四种、五种或六种FDP抗原种的免疫原制剂培育的多克隆抗体制剂。多克隆抗体可在包括但不限于兔、山羊、马、驴、绵羊、鸡或鲨鱼的多种物种中产生。在另一实施方式中，针对三种、四种、五种或六种FDP抗原中的每一种生产的抗体制剂可独立制备并合并在一起，以形成抗-FDP的抗体库。而且，在其他实施方式中，抗体制剂可包含单克隆、单一特异性多克隆、嵌合或人源化抗体或抗体片段的库，其中，每种抗体与六种FDP抗原中的一种或多种反应，只要在同一检验中所述抗体库能与三种、四种、五种或六种FDP抗原大致同时反应。此类抗体的制备是本领域熟知的并且将不在本公开中详细描述。本公开还包括用于结合FDP并检测受试者中的癌的存在或监测受试者中的癌的发展的系统和试剂盒。在一种实施方式中，系统包含抗体库和检测试剂，用于结合并检测生物样品中的三种、四种、五种或六种FDP并使三种、四种、五种或六种FDP抗原的存在与受试者中的癌的存在或发展关联。在一种实施方式中，试剂盒包含抗体库和检测试剂，用于结合并检测生物样品中的三种、四种、五种或六种FDP并用于使三种、四种、五种或六种FDP的存在与受试者中的癌的存在或发展关联。在另一实施方式中，试剂盒可含有在包装(package)或容器中的下述的一种或多种(1)结合三种、四种、五种或六种FDP以从生物样品捕获FDP的一个或多个抗体库；( 检测抗体；C3)用于固定(a)抗体库或(b)检测抗体中的至少一种的固相载体 (solid support) ； (4)检测试剂；(5)洗涤液；和(6)对于使用试剂盒组件(component)和生物样品进行检验的指导。可使用其中组件(1)-(6)中的两个或多个被发现于同一容器中的实施方式。当试剂盒被提供时，不同的试剂可被包装在单独的容器中并在使用前立即混合或附到固相载体上。此种组件的单独包装可允许长期储存而不会丧失活性组件的功能。包括在具体试剂盒中的组合物可在任何类型的容器中提供，使得不同组件的寿命可被维持并且不会被容器的材料吸收或改变。如上述，试剂盒还可提供有指导性材料。指导可打印在纸或其他基材上，和/或可作为电子可读介质(例如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盘、录像带、录音带、闪存设备等等) 提供。详细的指导可以不与试剂盒物理上相关；代之以，使用者可到由试剂盒的制造商或发行者指定的因特网网站上，或作为电子邮件提供。此外，所要求保护的方法、系统和试剂盒可被用来检测来自包括但限于血清、全血、血浆、唾液、痰、尿、腹腔液、肿瘤组织、脑脊液、阴道或直肠分泌物和泪液的各种来源的生物样品中的癌相关FDP。当使用作为癌的筛查的检验方法时，每个实验室必须建立其自己的正常范围和异常范围，这基于当地种群研究。实施例11提供了正常和癌患者样品的典型分布。通过鉴别出超过正常范围预定的数目的那些样品，将来自被怀疑患有癌的患者的生物样品中的FDP 水平与癌的存在关联。当使用检验方法用于监测有证实的癌症诊断的患者时，基准读数应先于他们的 FDP水平的评估。初始血清抽取物的FDP值作为基准读数。通过构建下述比率(R)，评估连续的血清提取的值；其中a =初始FDP值并且b =当前FDP值。R = b/a在当前FDP值相对于基准FDP的比率高于1. 15时，患者可能有疾病发展，但测试的FDP抗原的结果应与其他临床形态(modality)结合使用，所述临床形态是用于监测这些癌患者中的疾病发展的监护标准。
实施例除非另外指出，按照制造商的指导使用在实施例中涉及的商购试剂。实施例1FDP免疫原的制备通过购买含有纤维蛋白和纤维蛋白原二者(就该过程的目的而言，其被称为纤维蛋白/纤维蛋白原)的经纯化的人纤维蛋白原产物，制备FDP免疫原。然后通过Haverkate 和Timan过程(Thromb. Res. 10 =803-812,1977)使纤维蛋白/纤维蛋白原与纤溶酶反应，以形成纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)。通过将反应运行(rim)特定的一段时间并接着用蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)停止反应来控制纤溶酶降解纤维蛋白/纤维蛋白原。
具体地，使用下述过程使用50ml锥形管，将20ml的MOPS缓冲液(5mM的3- (N-吗啉代)丙磺酸，PH 7. 4，含有0. IM的氯化钠和20mM的氯化钙)在37°C的温育器中温育直到溶液达到37°C的温度(大约20-25分钟)并将经纯化的人纤维蛋白/纤维蛋白原添加到温的MOPS缓冲液中并在37°C下搅拌直到溶解。将PH 7. 4的一毫升的PBS添加到纤溶酶中来重建，然后将5单位的纤溶酶添加到在MOPS溶液中的纤维蛋白/纤维蛋白原中。然后将该混合物在37°C的温育器中搅拌3小时。消化的FDP被从摇瓶中去除，并添加200 μ 1的蛋白酶抑制剂混合物并将溶液完全混合。接着测量浓缩原液FDP溶液的总蛋白浓度，在变性和还原条件下，FDP分解产物标志在4-20%梯度SDS-PAGE上被验证(见图幻。产生的FDP 溶液在-40°C下存储。FDP免疫原还被用在抗体的免疫亲和纯化中并在FDP检测系统中用作为FDP标定物和对照。实施例2兔抗-FDP抗体的产牛用根据实施例1制备的FDP免疫原使兔免疫。每只兔接受由在1. 0到1. 5ml的磷酸盐缓冲液中的Img免疫原和等体积的弗氏完全佐剂组成的乳液的注射，用于第一次免疫。注射后三周，将每只兔放血并针对抗FDP的抗体检测血清。放血后一周，通过注射在1 到1. 5ml的磷酸盐缓冲液中的Img免疫原和等体积的弗氏不完全佐剂组成的乳液，给予每只兔加强免疫。根据加强免疫和放血方案喂养兔，直到它们不再能活。通过使用96孔板系统进行标准价效检验，检验在免疫接种后不同时间间隔下获得的兔血清的抗FDP的抗体的浓度。在典型的血清价效检验中，使10 μ g的免疫原固定在96 孔微量滴定板的孔中；用FBS封闭；然后与各种兔血清的一系列1 1稀释物反应；洗涤； 用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗-兔抗体(Sigma)检测；洗涤；用3,3' ,5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液温育；停止溶解并在OD 450nm下读数。通过将0D450nm值对稀释倍数作图来确定效价；然后确定曲线的拐点。兔抗-FDP如实施例6中那样被免疫亲和纯化。实施例3鸡抗-FDP抗体的产生用根据实施例1制备的FDP免疫原使鸡免疫。每只鸡接受由在1. 0到1. 5ml的磷酸盐缓冲液中的Img免疫原和等体积的弗氏完全佐剂组成的乳液的注射，用于第一次免疫 (第0天)。在第35、56、77和98天给予每只鸡额外的免疫接种。这些鸡在第沈、40、60、81 和100天被放血(收集血清)。血清应答测试在第45天开始。在第53天出现IgY的第一次收获物。在第56天开始第一次亲和纯化。通过使用96孔板系统进行标准效价检验，检验在免疫接种后不同时间间隔下获得的鸡血清的抗FDP的抗体的浓度。在检验之前，鸡抗-FDP的IgY抗体的亚组被缀合到 HRP上。在典型的血清效价检测中，使10 μ g的免疫原固定在96孔微量滴定板的孔中；用 FBS封闭；然后与各种鸡血清的一系列1 1稀释物反应；洗涤；用TMB溶液温育；停止溶解并在OD 450nm下读数。通过将OD 450nm值对稀释倍数作图来确定效价；然后确定曲线的拐点。鸡抗-FDP如实施例6中那样被免疫亲和纯化。
实施例4山羊抗-FDP抗体的产牛用根据实施例1制备的FDP免疫原使山羊免疫。每只山羊接受由在1. 0到1. 5ml 的磷酸盐缓冲液中的Img免疫原和等体积的弗氏完全佐剂组成的乳液的注射，用于第一次免疫。注射后三周，将每只山羊放血并检验血浆的针对FDP的抗体。放血后一周，通过注射由在1. 0到1. 5ml的磷酸盐缓冲液中的Img免疫原和等体积的弗氏不完全佐剂组成的乳液，给予每只山羊加强免疫。根据加强免疫和放血方案喂养山羊，直到它们不再能活。通过使用96孔板系统进行标准效价检验，检验在免疫接种后不同时间间隔下获得的山羊血清的抗FDP的抗体的浓度。在典型的血清效价检验中，使10 μ g的免疫原固定在 96孔微量滴定板的孔中；用FBS封闭；然后与各种山羊血清的一系列1 1稀释物反应；洗涤；用偶联HRP的兔抗-山羊抗体的(Sigma)检测；洗涤；用TMB溶液温育；停止溶解并在 0D450nm下读数。通过将OD 450nm值对稀释倍数作图来确定效价；然后确定曲线的拐点。山羊抗-FDP如实施例6中那样被免疫亲和纯化。实施例5偶联FDP的SeDharose琼脂糖CL 4B的制备用10倍琼脂糖(kpharose)凝胶体积(即20ml琼脂糖凝胶的10倍，其等于 200ml)的PH 7. 5磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤高碘酸盐氧化的琼脂糖CL4B QOml)。将洗涤过的并排水的琼脂糖CL 4B与20ml (1倍凝胶体积)的2. Omg/ml的合并的FDP抗原溶液(在 MOPS中的FDP，见实施例1)反应。将3. 5毫升(凝胶体积的1/6)在去离子(DI)水中的0. IM 氰基硼氢化钠添加到该悬浮液中并且在室温下摇动悬浮液16-20小时。然后，将40ml (凝胶体积的2倍)的在PH 7. 5的PBS中的0. IM甘氨酸和0. IM氰基硼氢化钠添加到悬浮液中并且在室温下继续搅拌悬浮液另外的2小时。FDP-偶联的琼脂糖CL 4B凝胶被脱气15 分钟并接着通过重力流被装填在色谱柱中。用下述溶液顺序洗涤凝胶DI水(10倍凝胶体积)、PH为7. 5的PBS (10倍凝胶体积)、含有0. 5M NaCl的PBS (10倍凝胶体积)、PH为3 的0. IM乙酸钠/0. 15M NaCl (10倍凝胶体积)、PH 7. 5的PBS (10倍凝胶体积)。当不使用时，将凝胶存储在4°C下含有0. 叠氮化钠的PBS中至多1周。实施例6抗FDP的多克隆抗体的免疫亲和纯化在使多克隆抗血清负载在如实施例5中制备的FDP-偶联的琼脂糖kpharose CL 4B凝胶柱上之前，将多克隆抗血清过滤通过0. 2μπι的针式过滤器。添加的经过滤的多克隆抗血清的体积大约等于凝胶的体积(1倍凝胶体积)。多克隆抗血清被添加之后，用PBS(5 倍凝胶体积)并接着用含有0. 5M NaCl的PBS (5倍凝胶体积)，再次洗涤FDP-偶联的琼脂糖CL 4B凝胶柱。用PH为3的0. IM乙酸钠/0. 15M NaCl洗脱与在柱上的FDP结合的免疫亲和纯化的抗-FDP抗体。洗脱液被收集在分级管(fraction tube)中用于监测，并且具有可检测的蛋白浓度(0D 280nm大于0.2)的随后的那些级分被转移到PETG瓶中用于长期存储。通过添加PH为8. 5的IM的Tris缓冲液，中和所得的抗体溶液的PH。实施例7抗FDP的兔多克隆抗体的表征在一种实施方式中，捕获抗体是亲和纯化的多克隆的针对FDP的兔抗体。兔被免疫并且如实施例3分离抗体。亲和纯化抗体的SDS-PAGE表明了高度的纯度。在非还原的抗-FDP制剂中的主要的蛋白带具有大约152kDa的分子量，其与兔IgG的分子量一致。当还原时，152kDa的蛋白带消失了，并且同时，出现了大约59kDa和30kDa的两条蛋白带，其分别与IgG分子的重链和轻链的分子量相似。因此，抗FDP抗体最初是IgG，不是IgM(M. W.大约900kDa)也不是 IgA (大约320kDa的二聚体)。基于SDS-PAGE分析，亲和纯化的FDP抗体库的纯度定性地被估算为大约90%。抗-FDP抗体与FDP抗原的结合遵循典型的Langmuir吸附等温线。从该数据中， 使用双倒数作图，抗体的结合常数被计算为1.25X10—^。因为抗体制备剂是多克隆源，在该研究中获得的结合常数是复合结合常数，即通过由不同克隆产生的抗体贡献的平均结合常数。捕获和检测抗体确保基于ELISA的任何测试的特异性。在Western印迹(图3) 和免疫沉淀(IP)两种实验(图4和5和表幻中，使FDP抗体库与人血清样品交叉反应，以证实FDP抗体库捕获人血清样品中的FDP。此外，通过FDP抗体库免疫沉淀的蛋白被测序并使用质谱鉴定。来自结肠直肠癌(CRC)和正常对照患者二者的人血清样品的Western印迹分析被用来确定人血清中的FDP抗原的数目和估算分子量。图3A和;3B描绘了分别曝光到胶片5 秒和30秒的相同凝胶的Western印迹。图3C描绘了对应的考马斯染色的凝胶。在图3 中，在CRC血清样品中检测出具有340J60-320、220、150、80和50kDa的估算分子量的六种主要的FDP抗原。这些环带分别对应于未消化的纤维蛋白原、初始纤溶酶消化产物(IPDP)、 片段D- 二聚体/片段X、片段Y、片段D和片段E。与之相对地，在正常的对照血清中仅检测出在大约220kDa下的一条主要带。就所有的测试的血清样品而言，来自CRC患者的血清样品中的反应的强度比来自正常对照的血清样品中的反应的强度高得多。表1癌血清vs.正常血清中的抗-FDP交叉反应性的分析
纤维蛋白原降解产物估算的MW面积来自各个受试者旳平均密度的平均值平均的平均密度的比率P-值(kDa)(in2)癌 n=5正常 n=5癌/正常未消化的& IPDP3400.150.34.012.65.1E-08IPDP260-3200.4150.74.136.71.3E-10片段X/片段 D-二聚体2200.2131.114.88.84.0E-10片段Y1500.277.45.115.25.4E-10片段D单体800.251.03.813.55.4E-09片段E单体500.239.13.311.95.0E-08
如在表1中所表明的，来自5个CRC患者的血清样品中的这些FDP组分的所有六种的平均信号密度显著(P-值彡0. 00000005)高于来自5个正常对照患者的平均信号密度。 在Western印迹(图3A)中的交叉反应水平的基于光密度测定的分析使用了 Scion影像光密度测定软件(Scion公司)。表1确认了抗-FDP库可基于它们各自的FDP水平区分癌和正常的血清样品。为了证实从人血清样品捕获的FDP抗原的数目和大小，使用结合到琼脂糖珠粒上的兔抗-FDP IgG或对照兔IgG进行免疫沉淀研究(图4和幻。免疫沉淀还浓缩了 FDP抗原，使得FDP抗原可从考马斯染色的SDS-PAGE中测序。根据制造商的指导使用Affl-Gel Hz免疫亲和试剂盒(BIO-RAD)，通过在IgG重
链上的Fc部分中的保守碳水化合物部分，将兔抗-FDP IgG或对照兔IgG抗体共价连接到 Sepharose琼脂糖珠粒上。人血清样品被随机选择并在PH为7. 4的PBS中稀释1到10倍。 将稀释的血清样品用结合抗-FDP的珠粒或结合对照兔IgG的珠粒温育。此外，两种类型的珠粒用预制的FDP的0. 25mg/ml溶液温育，以用作IP反应的阳性对照。在稀释的血清和结合对照兔IgG的珠粒之间IP的反应用作识别在非特异性兔IgGs和血清抗原之间的假阳性反应的对照。IP反应在翻转旋转器上在4°C下整夜温育。用PBS洗涤IP珠粒5次，并且抗原在非还原性Laemmli样品缓冲液中、在95°C下被萃取8分钟。接着，从抗-FDP和对照兔 IgG珠粒萃取的抗原在4-20% SDS-PAGE上运行。图4显示了两个代表性血清样品的一整套的实验条件N4来自正常患者4并且C15来自结肠直肠癌患者15。通过在IP检验中显示五个额外的正常患者和五个额外的结肠直肠癌患者，图5A和5B展示了这些IP反应的再现性。在图4中列出的IP实验的结果展示了四种主要的FDP特异性抗原和一种非特异性抗原已由抗-FDP珠粒(+)从结肠直肠癌患者的血清中捕获。从该样品(C15(+)，从右第二条泳道)中，四种主要FDP特异性抗原的估算分子量(MW)以递减的顺序分别为340、300、 220和50kDa。在该泳道中的一种非特异性抗原大约是25kDa。血清样品的对照泳道N4 (-) 和C15(_)(从右第三条和第五条泳道)也显示了与25kDa蛋白的反应，其与如在N4(+)和 C15(+)(从右第二条和第四条泳道)中所示的、暴露于抗-FDP珠粒(+)的N4和C15样品中的25kDa蛋白相符合。在所有这些泳道N4(_)、N4(+)、C15(_)、C15(+)中的25kDa蛋白的存在，证实了从血清样品的IP反应提取的25kDa蛋白与结合任何IgG的珠粒非特异性相互作用。IP检验的阳性对照反应被指定为FDP (-)和FDP (+)(从左第6条和第7条泳道)。珠粒对照泳道(FDP(-))表明在不是基于血清的FDP标定物溶液和阴性对照珠粒之间没有相互作用。FDP (+)反应含有一条次要带和三条主要带。一条次要带的估算MW是340kDa，其与未消化的纤维蛋白原的MW相符合。在FDP对照免疫原溶液中的三种主要FDP特异性抗原的估算的分子量是220kDa(其与纤维蛋白原片段X或D- 二聚体的MW相符合)、80kDa (其与纤维蛋白原片段D单体的MW相符合)和50kDa (其与纤维蛋白原片段E单体的相符合)。 抗-FDP珠粒从结肠直肠癌患者的人血清中捕获四种主要的FDP抗原；而在正常血清中同样的珠粒仅带来在大约53kDa下的一条次要带(弱带)。人血清样品(和FDP)与抗-FDP珠粒的IP反应和人血清样品(和FDP)与对照珠粒的IP反应之间的比较证实了抗-FDP抗体库的特异性。图5展示了多个患者样品之间的FDP抗原的模式是可再现的。对于该实验，分别用对照兔IgG珠粒和抗-FDP珠粒二者在免疫沉淀反应中测试来自额外的五个CRC和额外五个正常患者的血清(从临床测试样品中随机选择)。另外，用两种类型的珠粒测试FDP免疫原(校准溶液)。在图5A中的SDS-PAGE含有从FDP (阳性对照)、CRC患者血清样品和正常血清样品提取的FDP特异性抗原。在图5B中的SDS-PAGE示出了来自与图5A中的相同的样品并以相同样品顺序附到对照兔IgG珠粒上的抗原。图5中所示的实验证实了，在人血清中有四种主要的FDP特异性抗原和在25kDa 下的一种非特异性抗原。在图5A中，由在受控条件下纤维蛋白和纤维蛋白原的体外纤溶酶消化得到的FDP对照泳道含有三条主要带和一条次要带。基于这些非还原的样品的近似分子量，通过FDP抗体库从FDP对照样品捕获的主要带按关于分子量的递减次序与纤维蛋白原片段D- 二聚体、片段D单体和片段E单体对应。在340kDa下的次要带大概是未消化的纤维蛋白，这也基于其近似的分子量。来自人血清的FDP特异性抗原大约是340、 300(观0-320)、210和50kDa。这些带分别与未消化的纤维蛋白原、初始纤溶酶消化产物 (IPDP)、片段D- 二聚体/片段X和片段E对应。通过将同等浓度的每个血清样品添加到IP 反应中，在该实验(和所有其他IP实验)中的IP反应被标准化。在图5B中，主要抗原在大约25kDa下。如之前讨论的，这表明，在25kDa的血清蛋白与所有的结合兔IgG的珠粒非特异性反应。25kDa蛋白还明显地与示于图5A中的结合兔抗-FDP IgG的珠粒反应非特异性地相互作用。表2来自CRC患者血清的DR-70 (FDP)-特异性抗原的定量
权利要求
1.一种用于检测受试者中的癌的方法，所述方法包括下述步骤 从所述受试者获得生物样品；使所述生物样品与抗体制剂反应，所述抗体制剂至少结合与纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)相关的三种抗原，以形成抗体-FDP复合物，其中所述三种FDP相关抗原是片段D、片段E和D-二聚体；检测所述抗体-FDP复合物；并诊断所述受试者中的癌。
2.根据权利要求1的方法，其中所述抗体制剂额外地任选地与片段Y和初始纤溶酶消化产物(IPDP)中的至少一种结合。
3.根据权利要求1的方法，其中所述抗体制剂是多克隆抗体制剂。
4.根据权利要求1的方法，其中所述方法包括酶联免疫吸附检验。
5.根据权利要求1的方法，其中所述诊断步骤还包括至少一种额外的诊断测试。
6.一种监测患者中的癌的方法，其包括(a)从所述受试者获得第一生物样品，所述第一样品在第一采样时间点收集；(b)从所述受试者获得第二生物样品，所述第二样品在所述第一采样时间点之后在第二采样时间点收集；(c)使所述生物样品与抗体制剂反应，所述抗体制剂结合与FDP相关的至少三种抗原， 以形成抗体-FDP复合物，其中所述三种FDP相关抗原是片段D、片段E和D- 二聚体；(d)检测所述抗体-FDP复合物；并(e)确定在所述第二生物样品中的FDP水平与在所述第一生物样品中的FDP水平的比率；(f)对癌发展进行判断；并任选地用在所述第一时间点和所述第二时间点后的时间点下得到的额外的生物样品重复步骤(a)-(e)。
7.根据权利要求6的方法，其中所述抗体制剂任选地额外地与片段Y和初始纤溶酶消化产物(IPDP)中的至少一种结合。
8.根据权利要求6的方法，其中所述抗体制剂是多克隆抗体制剂。
9.根据权利要求6的方法，其中所述反应和检测步骤包括酶联免疫吸附检验。
10.根据权利要求6的方法，其中如果所述比率大于或等于1.15，所述癌已发展。
11.根据权利要求6的方法，其中如果所述比率小于1.15，所述癌已退化或是稳定的。
12.用于检测受试者中的癌的试剂盒，所述试剂盒包括至少结合与FDP相关的三种抗原的抗体制剂，其中所述三种FDP相关抗原是片段D、片段E和D-二聚体； 检测系统；和用于测量所述FDP并使所述FDP的存在与癌关联的指导。
13.根据权利要求12的试剂盒，其中所述检测系统包括特异性针对与FDP相关的至少三种抗原的检测抗体，其中所述三种FDP相关抗原是片段D、片段EJP D- 二聚体。
14.根据权利要求13的试剂盒，其中所述抗体制剂任选地额外地与片段Y和初始纤溶酶消化产物(IPDP)中的至少一种结合。
15.根据权利要求12的试剂盒，其中所述抗体和所述检测系统包括酶联免疫吸附检验。
全文摘要
本文公开了通过在一个检测系统中同时检测生物样品中的六种纤维蛋白和纤维蛋白原降解产物(FDP)的存在，用于检测癌或监测癌的发展的方法、系统和试剂盒。
文档编号G01N33/574GK102405413SQ200980158402
公开日2012年4月4日 申请日期2009年3月30日 优先权日2009年3月30日
发明者安德烈娅·斯莫尔-霍华德 申请人:Amdl有限公司