专利名称：一种检测样品中是否含有重金属铜离子的方法及其专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测样品中是否含有重金属铜离子的方法及其专用试剂盒。
背景技术：
重金属是环境与农产品中的重要污染物质，可以通过食物链在动物及人的体内富 集，对人类健康会带来严重的危害。铜是生命体生长所必须的微量元素之一，但是高浓度的 铜会对生命体产生毒害作用。目前，重金属铜的分析方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光/ 质谱法、X-射线荧光光谱法、电位溶出分析法以及近几年发展的生物传感器检测法等。但 是用这几种方法检测铜离子需要昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时，不能用于现场快速检 测。与仪器分析法相比，酶联免疫吸附测定法(ELISA)具有快速、简便、实时、易于进行现场 检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降 低检测成本。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测样品中是否含有重金属的试剂盒。本发明所提供的用于检测样品中是否含有重金属的试剂盒，包括包被原、抗待检 重金属的抗体；所述包被原与抗待检重金属的抗体结合，且所述包被原与所述抗待检重金 属的抗体的亲和力小于所述待检重金属与所述抗待检重金属的抗体的亲和力。上述任一所述试剂盒中，所述包被原为如下络合物螯合剂与载体蛋白通过共价 键连接形成的偶联物再与金属离子I通过配位键连接形成的络合物；所述金属离子I为除 了所述待检重金属外的其余金属中的任一种，且所述金属离子I与所述抗待检重金属的抗 体的亲和力小于所述待检重金属与所述抗待检重金属的抗体的亲和力；所述共价键是所述螯合剂上的氨基基团与所述载体蛋白上的酚基基团形成的；所 述配位键是所述金属离子I与所述偶联物中的螯合剂上的乙二胺四乙酸形成的。上述任一所述试剂盒中，所述包被原是按照如下方法制备得到的(1)将螯合剂重氮化，得到重氮化的螯合剂；(2)将载体蛋白与所述重氮化的螯合剂混合，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述 重氮化的螯合剂的偶联物；(3)将所述金属离子I的溶液与所述偶联物混合，进行络合反应，得到所述包被 原；上述任一所述试剂盒中，所述重氮化的方法包括如下步骤将所述螯合剂溶于酸 的水溶液中，再向其中加入亚硝酸盐，进行重氮化反应，得到所述重氮化的螯合剂；所述重 氮化反应的条件包括温度为0-5°C、避光和时间为15min ；所述温度优选为0°C或4°C ；所 述螯合剂、酸和亚硝酸盐的配比为4mg 2X 10_3mOl 1.2X10"4mol ；
上述任一所述试剂盒中，所述偶联反应的条件包括温度为4°C -10°C或4°C，pH值 为8. 5-9. 0或8. 5，反应时间为4h-24h或4h ；所述重氮化的螯合剂与所述载体蛋白的投料 摩尔比为10 1 ；上述任一所述试剂盒中，所述络合反应的条件包括温度为25°C、pH值为7. 5和时 间为12h;所述偶联物与所述金属离子I的投料摩尔比为1 20。上述任一所述试剂盒中，所述试剂盒中包括包被缓冲液、洗涤液、样品稀释液、标 准品溶液和酶标抗抗体；上述任一所述试剂盒中，所述标准品为EDTA与所述待检重金属的螯合物。上述任一所述试剂盒中，所述标准品是按照如下方法制备得到的(1)将每29.3mg EDTA溶解于去离子水中，调节pH至8. 0，得到溶液I ；(2)将13. 5mg待检重金属可溶性盐溶解于去离子水中，并逐滴加入到所述溶液I 中，磁力搅拌反应12小时，再将溶液定容至6. 4mL，得到EDTA与待检重金属的螯合物。上述任一所述试剂盒中，所述标准品溶液中待检重金属离子浓度为20ng/mL、 10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL、0. 31ng/mL、0. 156ng/mL 禾口 0. 078ng/
mLo上述任一所述试剂盒中，所述包被缓冲液为0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液；上述任一所述试剂盒中，每1升洗涤液按照如下方法配制将8. Og NaCl, 0. 2gKH2P04、2. 96g Na2HPO4 · 12H20、lmLTween-20 溶于水中，并用水补足至 IL ；上述任一所述试剂盒中，样品稀释液按照如下方法配制将ImL吐温20和Ig明胶 溶于IL PBS缓冲液中，得到样品稀释液；每1升PBS缓冲液由NaCl、KH2PO4, Na2HPO4 · 12H20和水组成；NaCl在磷酸盐缓冲 液中的浓度为8. Og/L, KH2PO4在磷酸盐缓冲液中的浓度为0. 2g/L，Na2HPO4 · 12H20在磷酸盐 缓冲液中的浓度为2. 96g/L，pH值为7. 5。上述任一所述试剂盒中，所述抗待检重金属的抗体为抗待检重金属的单克隆抗体 或多克隆抗体；上述任一所述试剂盒中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白 或卵清白蛋白；上述任一所述试剂盒中，所述酶标抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗 体。上述任一所述试剂盒中，所述待检重金属为铜，所述包被原中的金属为钴，所述标 准品中的金属为铜，所述抗铜的单克隆抗体为由保藏编号为CGMCC No. 3987的杂交瘤细胞 株Cu-EDTA 6A9分泌得到的，所述螯合剂为对氨基苄基乙二胺四乙酸。所述对氨基苄基乙二胺四乙酸的结构式为
权利要求
一种用于检测样品中是否含有重金属的试剂盒，包括包被原、抗待检重金属的抗体；所述包被原与抗待检重金属的抗体结合，且所述包被原与所述抗待检重金属的抗体的亲和力小于所述待检重金属与所述抗待检重金属的抗体的亲和力。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述包被原为如下络合物螯合剂与载 体蛋白通过共价键连接形成的偶联物再与金属离子I通过配位键连接形成的络合物；所述 金属离子I为除了所述待检重金属外的其余金属中的任一种，且所述金属离子I与所述抗 待检重金属的抗体的亲和力小于所述待检重金属与所述抗待检重金属的抗体的亲和力。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述包被原是按照包括如下步骤 的方法制备得到的(1)将螯合剂重氮化，得到重氮化的螯合剂；(2)将载体蛋白与所述重氮化的螯合剂混合，进行偶联反应，得到载体蛋白与所述重氮 化的螯合剂的偶联物；(3)将所述金属离子I的溶液与所述偶联物混合，进行络合反应，得到所述包被原；所述重氮化的方法包括如下步骤将所述螯合剂溶于酸的水溶液中，再向其中加入亚 硝酸盐，进行重氮化反应，得到所述重氮化的螯合剂；所述重氮化反应的条件包括温度为 0-5°C、避光和时间为15min ；所述温度优选为0°C或4°C；所述螯合剂、酸和亚硝酸盐的配比 为 4mg 2Xl(T3mol L2Xl(T4mol;所述偶联反应的条件包括温度为4°C -10°C或4°C，pH值为8. 5-9. O或8. 5，反应时间 为4h-24h或4h;所述重氮化的螯合剂与所述载体蛋白的投料摩尔比为10 1 ；所述络合反应的条件包括温度为25°C、pH值为7. 5和时间为12h ；所述偶联物与所述 金属离子I的投料摩尔比为1 20。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包括包被缓冲 液、洗涤液、样品稀释液、标准品溶液和酶标抗抗体；所述标准品为EDTA与所述待检重金属的螯合物。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述标准品是按照如下方法 制备得到的(1)将每29.3mg EDTA溶解于去离子水中，调节pH至8.0，得到溶液I ；(2)将13.5mg待检重金属可溶性盐溶解于去离子水中，并逐滴加入到所述溶液I中， 磁力搅拌反应12小时，再将溶液定容至6. 4mL，得到EDTA与待检重金属的螯合物。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于所述标准品溶液中待检重金 属离子浓度为 20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL、0. 31ng/mL、 0. 156ng/mL 禾口 0. 078ng/mLo
7.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒，其特征在于所述包被缓冲液为0.05M、 PH9. 6的碳酸盐缓冲液；每1升洗涤液按照如下方法配制将8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、 lmLTween-20溶于水中，并用水补足至IL ；样品稀释液按照如下方法配制将ImL吐温20和Ig明胶溶于IL PBS缓冲液中，得到 样品稀释液；所述抗待检重金属的抗体为抗待检重金属的单克隆抗体或多克隆抗体；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白； 所述酶标抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体。
8.根据权利要求1-7中任一所述的试剂盒，其特征在于所述待检重金属为铜，所述 包被原中的金属为钴，所述标准品中的金属为铜，所述抗铜的单克隆抗体为由保藏编号为 CGMCC No. 3987的杂交瘤细胞株Cu-EDTA 6A9分泌得到的，所述螯合剂为对氨基苄基乙二 胺四乙酸。
9.一种检测样品中是否含有重金属的方法，是用权利要求1-8中任一所述试剂盒对待 测样品进行检测。
10.保藏号为CGMCCNo. 3987的杂交瘤细胞株Cu-EDTA 6A9产生的抗金属铜的单克隆 抗体；保藏号为CGMCC No. 3987的杂交瘤细胞株Cu-EDTA 6A9。
全文摘要
本发明公开了一种检测样品中是否含有重金属的方法及其专用试剂盒。该试剂盒，包括包被原、抗待检重金属的抗体；所述包被原与抗待检重金属的抗体相互作用，且所述包被原与所述抗待检重金属的抗体的亲和力小于所述待检重金属与所述抗待检重金属的抗体的亲和力。实验证明，本发明所提供的制备铜离子非均等竞争ELISA检测法中，包被抗原的制备方法简单，且合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明方法制备的包被抗原对ELISA检测灵敏度有明显提高。本发明的制备包被抗原的方法及由该方法建立的铜离子快速免疫检测方法将有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/53GK101968481SQ20101025392
公开日2011年2月9日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者南铁贵, 孙硕, 曹振, 李召虎, 王保民, 王敏, 谭桂玉, 赵洪伟, 高巍 申请人:中国农业大学