专利名称：检测尿液中戊二酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测尿液中戊二酸含量的方法。
背景技术：
戊二酸尿症是Goodman等(197 发现，有人将它列入赖氨酸代谢缺陷病，为常染色体隐性遗传病。本病的代谢缺陷已知有两型，经典型的I型已被证明是由于戊二酰辅酶A 的活性缺失，使戊二烯辅酶A转化为戊烯辅酶A的环节受阻。从患儿的末梢血白细胞培养中可以证明。由于戊二酸、戊烯二酸等在神经元膜上有竞争谷氨酸脱羧基酶(GAD)的作用， 患儿出现的锥体外系症状，可能与GAD活性受抑制有关。新近发现了 II型戊二酸尿症，其症状与第1型相似，但是其代谢缺陷则是由于电子传递的黄蛋白或黄蛋白一泛醌氧化还原酶活性缺乏。患儿早期发育多正常，从婴儿中期逐渐发生智能发育迟滞，运动功能退化，伴有肢体强直痉挛、手足紧握、下肢剪式交叉或角弓反张，有时并出现扭转痉挛、手足徐动等锥体外系症状。实验室检测除血清LDH和CPK酶活性增高、脑脊液中蛋白量稍多，尿中有大量戊二酸(赖氨酸的代谢物)排出。因此检测尿液中戊二酸的含量为研究II型戊二酸尿症提供可靠的实验依据。

发明内容
本发明的目的是提供一种简单、高效、灵敏的定量检测尿液中戊二酸含量的方法。本发明所提供的检测尿液中戊二酸含量的方法，包括如下步骤标品、待测样本分别和同位素内标溶液混勻，加入基质溶液，混勻；加入磷酸酸化的甲基叔丁基醚，混勻并离心，取上清液，吹干，加入饱和盐酸正丁醇溶液，混勻，65°C衍生 20min,衍生完成后吹干，加入流动相复溶液，萃取，离心，取上清，进行液相-质谱分析，得到尿液中戊二酸的含量。本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法，其中所述基质溶液为质量百分比浓度 4%牛血清蛋白或空白血清。本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法，其中所述流动相复溶液和流动相为含 1 %。甲酸铵或乙酸铵的甲醇水溶液或乙腈水溶液。本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法，其中所述流动相复溶液中甲醇或乙腈的体积百分比含量为10-80%。本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法采用磷酸酸化甲基叔丁基醚为萃取试剂进行液液萃取戊二酸，萃取效率高，以同位素为内标，使得目标化合物的识别更为准确，同时更好的消除了系统误差，定量结果更为准确。以BSA为基质，模拟尿液中的蛋白质环境， 消除基质效应，提高戊二酸的回收率。本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法，简便、快速、 准确，不仅可以应用于大量样本筛查，而且定量准确。


图1为盐酸正丁醇衍生色谱图。图2为盐酸甲醇衍生色谱图。图3为戊二酸标准品色谱图。图4为同位素内标色谱图。图5为尿样中戊二酸色谱图。图6为尿样中同位素内标色谱图。图7为标准品戊二酸质谱图。图8为内标标品质谱图。
具体实施例方式一.检测方法步骤1 用移液器移取标品和内标溶液，涡旋仪混勻；同时平行移取待测样本和内标溶液涡旋混勻。步骤2 向上述溶液加入基质溶液的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液)，涡旋混勻；步骤3 加入磷酸酸化的甲基叔丁基醚(MTBE)或乙醚或乙酸乙酯，充分混勻并高速离心。步骤4 取部分上清液，于氮吹仪上氮气吹干；步骤5 加入衍生试剂(饱和盐酸正丁醇溶液)，涡旋混勻，密封，加热衍生，步骤6 衍生完成后再次加热吹干溶剂。步骤7 加入流动相复溶液(含1%。甲酸铵或乙酸铵的甲醇水溶液或乙腈水溶液)，充分混勻；步骤8 经超声萃取一段时间后，充分混勻并高速离心；步骤9 取适量上清溶液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，经质谱分析，最终定量分析尿液中戊二酸(GA)的含量.液相色谱条件样品经液相的自动进样器进样，液相泵以85%甲醇溶液进行等度洗脱分离，流速 200 μ L/min,进样量5 μ L，进样前清洗取样针。色谱柱discovery C18 (SUPELCO, HPLC, 5cm*2. lmm, 5 μ m)串联质谱条件ESI离子源，正离子扫描；MRM模式，扫描时间;3min，喷雾电压4500V，鞘气(氮气)30psi，辅助气(氮气)10psi，毛细管温度300°C，碰撞气(氩气)1.5mTorr ；m/z 245/171、m/z 245/115 为 GA 的特征定性离子对，m/z 249/175、m/z 249/119 作为内标 D3-MMA的特征定性离子对，m/z 245/171用于GA定量，CE为MeV，扫描时间0. 5s，扫描宽度Iu0MTBE、乙醚、乙酸乙酯萃取对检测结果的影响见表1，MTBE萃取试剂的回收产率最高，检测结果最准确。表1.不同萃取试剂比较结果
权利要求
1.本发明所提供的检测尿液中戊二酸含量的方法，包括如下步骤标品、待测样本分别和同位素内标溶液混勻，加入基质溶液，混勻；加入磷酸酸化的甲基叔丁基醚，混勻并离心，取上清液，吹干，加入饱和盐酸正丁醇溶液，混勻，65°C衍生 20min,衍生完成后吹干，加入流动相复溶液，萃取，离心，取上清，进行液相-质谱分析，得到尿液中戊二酸的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述基质为质量百分比浓度4%牛血清蛋白或空白血清。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述流动相复溶液和流动相均为含 1 %。甲酸铵或乙酸铵的甲醇水溶液或乙腈水溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述流动相复溶液中甲醇或乙腈的体积百分比含量为10-80%。
全文摘要
本发明公开了一种检测尿液中戊二酸含量的方法，包括如下步骤标品、待测样本分别和同位素内标溶液混匀，加入基质溶液，混匀；加入磷酸酸化的甲基叔丁基醚，混匀并离心，取上清液，吹干，加入饱和盐酸正丁醇溶液，混匀，65℃衍生20min，衍生完成后吹干，加入流动相复溶液，萃取，离心，取上清，进行液相-质谱分析，得到尿液中戊二酸的含量。本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法，简便、快速、准确，不仅可以应用于大量样本筛查，而且定量准确。
文档编号G01N30/34GK102565204SQ20101058163
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者倪君君, 崔学峰 申请人:北京国立柏林医学科技发展有限公司